KR20090129639A - 인유두종 바이러스 진단용 프로브 및 그 유전자형 확인방법 - Google Patents

인유두종 바이러스 진단용 프로브 및 그 유전자형 확인방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인유두종 바이러스 진단용 프로브 및 그 프로브를 이용한 HPV 유전자형 확인 방법에 관한 것이다.
인유두종 바이러스, 프로브, 역교잡 혼성화방법

Description

인유두종 바이러스 진단용 프로브 및 그 유전자형 확인 방법{Probe for detecting HPV and Genotyping method thereof}
본 발명은 인유두종 바이러스 진단용 프로브 및 그 유전자형 확인 방법에 관한 것이다.
일반적으로 전 세계적으로 자궁경부암 환자의 99.7%에게서 HR (High Risk)-HPV DNA가 존재하며 이러한 HR-HPV 감염의 존속이 침윤성 자궁경부암, 자궁경부 전암으로의 전이를 일으키는 것으로 알려져 있다. 자궁경부암의 경우 전 세계적으로는 매년 50 만명, 우리나라의 경우 6000명의 새로운 환자가 발생하고 있으며 50%는 치명적인 결과를 보인다. 이러한 자궁경부 종양으로 진행하는 과정에 인유두종 바이러스 (Human Papilloma Virus, HPV)가 중요한 원인으로 알려지면서 자궁암의 조기 진단에 HPV DNA의 존재 유무를 이용하고 있다 (Bernard, H. U., 등. 2006. Int J Cancer 118:1071-6).
HPV는 약 7.9 kb의 이중나선 구조의 DNA 바이러스로 papovavirus에 속하는 것으로 100개 이상의 서브타입이 존재하고 있으며 이중 40개의 서브타입은 생식기를 통해 감염 되는 것으로 알려져 있다. 또한 HPV 바이러스는 10개의 바이러스성 단백질을 지니고 있는데 바이러스의 캡시드를 구성하는 구조 단백질 합성에 관여하는 2개의 early 유전자 산물인 L1, L2와 바이러스의 감염의 활성과 잠복을 결정하는 바이러스의 복제에 관여하는 단백질의 합성을 조절하는 8개의 late 유전자 산물인 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8을 발현한다. 특히 E6와 E7은 전암 단백질을 암호화 하고 있고, 암과 연관이 있는 부분으로 알려져 있으며 (Sedman, S. A., 등. 1991. J Virol 65:4860-6), 여러 보고에 의하여 HPV 바이러스가 여성의 자궁경부암을 유발하고, 여러 가지 악성 종양과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다(Godfroid, E., M. 등. J Virol Methods 75:69-81).
여성의 자궁경부암은 전 세계적으로 유방암에 이어 두 번째로 높은 발병율을 나타내고 있고, 우리나라에서도 매년 1,000명 이상의 사망자가 보이고 있어 자궁경부암의 조기 진단을 위한 노력이 매우 중요하게 여겨지고 있다(Wui, J. H., 등. Journal of Gynecologic oncology and Coloscopy 17:39-47).
현재 HPV의 유전자형은 100가지 이상이 알려져 있고 (Likes, W. M., 등. Clin J Oncol Nurs 7:271-6), 이 중에서 사람에게 질병을 일으킬 수 있는 유전자형은 30가지 정도로 알려져 있다. 그 유전자형은 고위험군 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 과 저위험군 (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81), 잠재위험군(34, 57, 83)으로 분류하고 있으며 (Munoz, N., 등. N Engl J Med 348:518-27), 각각의 유전자형을 지닌 HPV가 병소의 위치와 병변의 진 행정도에 따라 유전자형 특이적으로 발견됨으로써 HPV 감염의 생물학적 다양성을 인지하게 되었다.
이러한 HPV의 감염여부를 진단하기 위하여 가장 많이 쓰이는 방법은 자궁세포진 검사(Papnicolaou Smear, Pap) 방법으로서 현재도 자궁경부암의 조직학적 진단은 이 검사법에 의해 진단하고 있으나 이 검사법은 검사자의 경험과 숙련도에 많은 의존을 해야 하고, 그 때문에 정확도가 떨어진다는 단점을 가지고 있다 (Kurman, R. J., 등. The 1992 National Cancer Institute Workshop. JAMA 271:1866-9.). 뿐만 아니라, 질확대경을 이용한 검사 방법은 자궁세포진 검사보다 정확한 결과를 얻을 수는 있지만, 숙련된 기술자와 고가의 장비가 필요하며, HPV의 유전자형을 구별할 수 없다는 단점이 있으며 위 두 방법을 통해서는 악성화 위험도가 다른 HPV 유전형을 분류할 수 없다는 단점이 있다.
상기한 단점을 보완하기 위하여 PCR, HC, DNA chip등을 이용하여 HPV 특이적 DNA 증폭을 통해 자궁경부암 전암 단계를 진단하고 유전자형을 확인하는 방법들의 연구가 계속 진행되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 HPV 유전자형을 확인하기 위한 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 이용하여 HPV 유전자형을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
서열번호 5 내지 서열번호 23의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 HPV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 PCR 산물을 탐지하기 위한 표지수단을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은
a) 상기 본 발명의 프로브를 고체 서포트에 부착하는 단계;
b) 상기 프로브에 증폭된 HPV PCR 산물을 교잡하는 단계; 및
c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 확인 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 고체 서포트는 막, 슬라이드, 또는 웰 플레이트인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명은 검체로부터 핵산을 추출하고, PCR 증폭을 수행하였다. 세포로부터 핵산을 추출하는 방법 및 PCR 방법은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 방법과 같은 당업계에 주지된 방법을 통하여 수행하였다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 프라이머를 사용하였다. 일반적으로 프라이머는 약 10에서 25bp 길이의 올리고뉴크레오타이드가 바람직하나 더 긴 것도 가능하며, 프라이머는 단일 가닥이 바람직하나 이중 또는 단일 가닥 형태로 존재할 수도 있으며, 본 발명에서 사용한 특정 프라이머는 본 발명의 실시예에 기재하였다.
본 발명의 프라이머는 통상의 올리고뉴크레오타이드 합성법에 의하여 제조되었으며, 그러한 합성 방법은 미국 특허 제 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 및 5,602,244 등에 개재된다.
본 발명의 프라이머와 같은 서열들은 샘플로부터 유래한 DNA와 같은 상보적인 서열들과 선택적으로 이중 나선을 형성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 타겟 서열에 대한 프라이머의 선택성을 변화시키기 위하여 교잡 조건을 변경할 수 있다.
일부 실시예에서는 교잡을 결정하기 위하여 표지와 같은 적당한 수단과 결합하여 본 발명의 한정된 서열의 핵산을 채택할 수 있다. 적당한 표지수단은 형광, 방사성동위원소 효소 또는 다른 리간드를 포함하는 다양한 표지 수단이 가능하다.
다양한 주형 의존적인 과정들이 주어진 세포 샘플에 존재하는 특정 유전자 산물을 증폭하는데 가능하다. 가장 공지된 증폭 방법 중 하나가 중합효소 연쇄반응(PCR)이다 이 방법은 미국특허 제 4,683,202 및 4,800,159 등에 기재된다.
일반적으로 한 단계 또는 또 다른 단계에서 증폭산물을 주형 또는 초과 프라이머 또는 다른 증폭산물로부터 분리하는 것이 바람직하다. 예를 들어 증폭 산물은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 표준 방법을 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 PAGE를 사용하여 분리될 수 있다.
또 흡착, 분배, 이온교환 등과 같은 크로마토그래피도 효과적인 분리방법으로 채택될 수 있다. 이들 분리방법들은 대량의 샘플을 가공하기 위하여 임상 셋팅에서 기능하도록 채택될 수 있으며, 수천개의 샘플을 한번에 분리하거나 검출할 수 있는 새로운 방법인 FMAT (fluorometric microvolume assay technique), chemiluminescence, sequence detection systems (Applied Biosystems) 및 질량 분광법 등이 있다.
본 발명에 따른 핵산은 검출되고 정량화될 것이다. 일 실시예에서 그 검출은 시각적 수단에 의하여 수행될 수 있다. 전형적인 시각적 수단 방법은 ethidium bromide로 젤을 염색하고, UV 광 하에서 밴드들을 시각화하는 것이다. 또 만약 증폭 산물이 방사선 또는 형광으로 표지된 뉴크레오타이드이면 분리된 증폭산물은 삽 입된 방사선동위원소 표지의 방사성 신티그램 촬영 또는 형광 검출을 수행한다.
본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 비한정적인 실시예에서 본 발명의 키트는 프라이머들, 증폭을 위한 효소 및 부가적인 시약을 포함할 수 있다. 따라서 본 키트들은 적당한 용기 수단들에 이들 하나 이상의 시약들을 포함할 것이다. 그 키트들은 또한 핵산을 분리하고 증폭 산물을 정제하는 시약들을 포함할 수도 있다. 키트들의 구성성분은 수용성 매체 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있고, 키트의 적당한 용기 수단은 구성성분이 들어갈 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병 등을 포함한다. 키트에 하나 이상의 구성요소가 존재한다면 부가적인 구성요소들이 따로 위치될 수 있는 제2, 제3 등의 다른 부가적인 용기를 포함할 수 있다. 그러나 여러 구성요소의 조합이 하나의 용기에 포함될 수도 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
1) ATCC 클론의 HPV 타이핑(도 2)
ATCC로부터 확보한 클론을 PCR을 수행한 결과 HPV 타입 43을 제외하고 모두 PCR 산물이 증폭되었고, 이 산물을 본 연구실의 HPV 특이적 프로브에 역 교잡 혼성화 방법(Reverse Blot Hybridization)을 통해 그 유전자형을 재검증할 수 있었다. 그러나 HPV 타입 43의 경우 비특이적 결합을 보였다. 이 실험은 독립적으로 각각 2개의 플라스미드를 추출하여 PCR을 수행한 산물을 사용하였으나 타입 44의 경우에는 실험상의 문제로 1개의 플라스미드만 추출하여 얻은 결과이다.
2) 역 교잡 혼성화 방법을 통한 Digene양성 검체와 이미 시퀀싱으로 지노타입이 확인된 임상검체의 검증
미즈메디 병원의 Digene (by HC2) 양성 검체로부터 고위험군 결과를 얻은 검체의 경우 MY11/09 프라이머를 사용한 첫 번째 PCR에서는 450bp의 PCR 산물 증폭된 것과 안된 것이 존재였으나 모든 첫 번째 PCR 산물을 nested 프라이머인 GP5+/6+로 PCR을 수행한 결과, 전체 44개 검체 중 31개의 검체에서 PCR 양성이 나왔고, 31개 검체를 Reverse Blot Hybridization (REBA, 도 3) 결과 26개의 검체에서 HPV 타입을 확인할 수 있었다. 이때 양성대조군으로 ATCC로부터 획득한 HPV 타입 56 클론을 사용하였다.
이들 HPV 타입의 분포를 살펴 보면 단독 감염의 경우 총 19개 중 HPV 타입 16이 31.5%, HPV 타입 58이 21%를 차지하고 있으며 다른 임상검체의 전체적인 지노타입의 결과는 도 4에 표기하였다. 특히 역 교잡 혼성성화 (REBA)를 통해 타입이 결정된 검체 26개 중 7개의 검체는 중복 감염된 것으로 추정하였으며 이들 모두 자궁경부암으로 발전할 가능성이 높은 고위험군들이 중복 감염된 것으로 추정된다. (도 4).
3) Plasmid DNA 클론의 확보
위에 기술한 검체들을 최종적으로 genotyping을 하기 위해서 본 발명에서는 HPV L1 유전자를 MY11/09 프라이머로 증폭한 산물을 플라스미드 DNA 클론을 확보하고자 하였다. HPV 타입 31, 33 L1 유전자가 삽입된 클론을 확보하였고, 바이오메트릭스에서 제공받은 DNA 중 HPV 타입 45, 미즈메디 병원으로부터 확보한 HPV 타입 58의 클론을 확보하였다. 이들 플라스미드 DNA 클론들의 REBA결과는 도 5에 제시한 바와 같이 본 발명에서 사용한 프로브와 실험방법 (REBA)으로 타 집단에서 수행한 결과와 동일함을 알 수 있었으며 상기한 발광 실험에서 도출된 결과를 통해 발색반응을 수행하여 동일한 결과는 얻었다 (도 6).
본 발명의 HPV 유전자형 확인방법은 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하고 미리 그 부위에 각 HPV 타입 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 제작, 부착한 막에 증폭된 DNA를 ECL-Southern hybridization을 이용한 역 교잡 혼성화를 이용한 방법으로 기존의 DNA 칩보다 특이도와 민감도가 좋은 프로브 개발과 좀 더 경제적이고 효과적인 방법을 개발하였다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1: HPV 양성 클론 확보
ATCC로부터 HPV 지노타입 중 8개에 해당하는 플라스미드를 확보하였으며 특히 pHPV-16(Cat. No.45133)을 전체 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. ATCC로부터 확보한 플라스미드는 HPV-6b (Cat. No.45150), HPV-11 (Cat. No.45151), HPV-18 (Cat. No.45152), HPV-35 clone 2A (Cat. No.40330), HPV-43 Clone 2A (Cat. No.40338), HPV-44 Clone 2 (Cat. No.40353), HPV-56 Clone 2C (Cat. No.40549)이 며, 이들 모두 E. coli에 형질전환 된 상태이기때문에 배양 후 플라스미드 DNA를 추출 (GeneAll, Seoul, Korea)하여 중합효소연쇄증폭반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)의 주형으로 사용하였다.
실시예 2: HPV 임상적 검체의 확보
본 발명에 사용된 임상검체는 2005년 11월부터 6개월간 강서 미즈메디 병원에서 이미 Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test™ (HC2, Digene, Gaithersburg, USA)로 검사를 받은 환자 137명 중 양성 고위험군 (High Risk, HR)으로 결과를 얻은 환자 44명을 대상으로 본 발명의 실험군으로 사용하였다. 이들 임상검체의 경우 PCR 효율성을 증폭시키기 위해 DNA가 들어있는 용액을 중화시키기 위해 0.45N HCl을 동량 넣어 섞어준 후 이를 주형으로 사용하였다. 또한 본 연구의 신뢰도 검증을 위하여 미즈메디 병원의 환자로부터 분리된 임상학적 검체 중 시퀀싱으로 지노타이핑이 끝난 HPV 타입 고위험군 16, 31, 58과 저위험군 6, 11을 확보하였고 HPV 타입 42, 45는 바이오메트릭스를 통해서 확보하였다.
실시예 3: PCR 반응
PCR 반응은 200㎕ PCR용 tube에 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P-40과 각각의 10 mM dNTP, 25 mM MgCl2, 각각의 10 pmole 프라이머과 1 unit의 Taq polymerase를 사용하였으며 총 반응 양은 50㎕로 실시하였다.
반응 조건은 94℃의 변성 (denaturation) 온도에서 5분간 예비 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 42℃에서 30초 결합(annealing), 72℃에서 20초 신장(extension)을 총 40회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장 반응을 하였다. 이때 사용한 프라이머는 기존의 공통인 GP5+/6+를 사용하며 이로 인해 150bp의 증폭 산물을 얻을 수 있다. 각각의 프라이머의 염기서열은 표 1에 표기하였다.
프라이머 서열
MY11 (forward) GCM CAG GGW CTA TAA YAA TGG(서열번호 1)
MY09 (reverse) CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC(서열번호 2)
GP5+ (forward) TTT GTT ACT GTG GTA GAT AC(서열번호 3)
GP6+ (reverse) GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C(서열번호 4)
상기 표 1은 프라이머 서열을 나타낸다.
Digene 양성 검체의 경우는 nested PCR 반응을 하기 위해 첫 번째 PCR 반응에서는 각각 2 pmole의MY11/09 프라이머를 이용하여 94℃에서 5분간 예비 변성, 94℃에서 30초 변성, 48℃에서 60초 결합, 72℃에서 30초 신장 반응을 총 35회 반복하고, 마지막 최종신장 반응을 72℃에서 10분간 진행하였다 (표 2). 이 후 첫 번째 PCR 산물의 1㎕를 주형으로 사용하여, GP5+/6+ 프라이머 10 pmole을 이용하여 첫 번째 PCR 반응과 동일한 조건으로 nested PCR을 수행하여 150 bp의 PCR 산물을 얻었다 (Lee, S. H., 등. Infect Agent Cancer 2:11).
Figure 112008042305017-PAT00001
상기 표 2는 GP 5+/6+ PCR 조건을 나타낸다.
실시예 4: 프로브로 사용할 oligonucleotide 와 프로브가 부착된 막의 제작
HPV 타입 특이적 프로브는 oligonucleotide의 염기서열은 표 3과 같다.
프로브로 사용할 oligonucleotide는 막의 음성전위를 띄는 카르복실기와 결합시키기 위해 양성전위를 갖도록 5 말단에는 아민기를 첨가하도록 바이오니아에 제작을 의뢰하였으며 준비된 프로브를 막에 부착하기 위하여 0.5 M NaHCO3용액에 전체 프로브 농도가 100 pmole이 되도록 희석하였고, 1.6 g/10 ml EDAC로 10분간 반응시킨 Miniblotter-MN45 (Immunetics, Cambridge, MA)를 이용하여 각각의 슬롯에 프로브를 로딩한 후 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 이 후 100 mM NaOH로 9분간 반응시킨 후, 최종적으로 100 ml의 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS 용액으로 60℃에서 5분간 반응시켜 비 결합 프로브를 제거하였다.
HPV 타입 프로브 Sequence HPV 타입 프로브 Sequence
HR 16 CATTATGTGCTGCCATATC(서열번호 5) LR 6 TCCGTAACTACATCTTCCA(서열번호 18)
18 TGCTTCTACACAGTCTCCT(서열번호 6) 11 TCTGTGTCTAAATCTGCTAC(서열번호 19)
31 GCAATTGCAAACAGTGATAC(서열번호 7) 42 TGGTGATACATATACAGCTG(서열번호 20)
33 TGCACACAAGTAACTAGTGA(서열번호 8) 43 TCTACTGACCCTACTGTG(서열번호 21)
35 CTGCTGTGTCTTCTAGTGA(서열번호 9) 44 TACTAGTGAACAATATAAGCA(서열번호 22)
39 ATAGAGTCTTCCATACCTTC(서열번호 10)
45 TAATTTAACATTATGTGCCTC(서열번호 11)
51 TGCTGCGGTTTCCCCAA(서열번호 12)
52 GAATACCTTCGTCATGGC(서열번호 13)
56 CAGAACAGTTAAGTAAATATG(서열번호 14)
58 TATGCACTGAAGTAACTAAG(서열번호 15)
59 TCTACTACTGCTTCTATTCC(서열번호 16)
68 CAGACTCTACTGTACCAGC(서열번호 17)
HPV-Universal GNCATGNNGARGAATWTGA(서열번호 23)
상기 표 3은 HPV 타입 별 프로브 서열을 나타낸다.
실시예 5: Reverse Blot Hybridization ( REBA )의 발광과 발색 실험
역 교잡 혼성화 반응 수행을 위하여는 프로브에 상보적으로 결합 가능한 염기서열을 가지고 있는 PCR 산물을 얻기 위해 GP5+/GP6+ 프라이머를 5' biotin (바이오틴)으로 표지하여 제작하였다. 이 프라이머로 얻은 150 bp의 PCR 산물 중 40 ㎕를 HPV 특이적 프로브들이 부착된 막에 miniblotter를 이용하여 혼성화 하였다. 즉, 증폭 확인된 PCR 산물 45 ml를 115 ml의 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS로 희석하고, 이를 100℃에서 10분간 끓인 후 즉시 얼음에 방치하였다. PCR 산물을 막에 혼성화하기 전에, 막을 활성화시키기 위해 100 ml 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS 용액에 넣고 실온에서 5분 동안 반응시킨 다음, 막을 miniblotter 상에 놓인 지지체 큐션 위에 올려 놓았다. 슬롯 내 여분의 습기를 흡입장치를 통해 제거하고 프로브들이 붙은 방향과 수직이 되게 하여 PCR 산물을 침적하였다. Oligonucleotide 프로브가 부착되어 있는 방향은 잉크를 이용하여 혼성화 전에 막에 표시하였다. PCR 산물이 침적된 슬롯 주변의 빈 슬롯은 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS로 채워서 교차흐름을 방지하였다. 이것을 바닥이 고른 50℃에서 60분 동안 혼성화 형성 반응을 진행하였고 이후 흡입장치를 이용하여 남아있는 시료를 miniblotter에서 모두 제거한 후 막을 100 ml 2X SSPE/0.5% SDS용액으로 50℃에서 15분간 2회 반복 세척하였다. 막을 rolling bottle에 넣고, streptavidine-alkaline phosphatase conjugate (AP conjugate, Roche Applied Science, Germany)를 2X SSPE/0.5% SDS 적당량에 1:2000 (v/v)으로 희석하여 잘 섞은 후, 42℃에서 40분간 반응시켰다. 이 후 막을 2X SSPE/0.5% SDS 용액 100 ml으로 42℃에서 두 번 세척한 후, 2X SSPE 용액 100 ml에서 두 번 세척하였다. 화학형광 검출을 위해 막에 10 ml의 CDP-Star TM detection reagent (Amersham pharmacia biotech., Buckinghamshire, England)에 넣고 4분간 반응시킨 후 Hyper sensitivity film에 30분간 노출시켜 결과를 확인하였다 (그림 1이 맞는지 확인 부탁드립니다). 발색반응을 위해서는 AP conjugate 반응이 끝난 막을 TBS (50 mM Tis-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)로 10분간 2회 세척하고 발색용 기질용액인 NBT/BCIP [Nitro Blue Tertrazolium Chloride and 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Phosphate, Toluidine salt in 67% DMSO (v/v), Roche Applied Science, Germany)]를 TBS (100 mM Tis-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5)에 1:50 (v/v)으로 희석하여 실온에서 10~30분 동안 반응시키면서 원하는 정도의 발색이 끝나면 발색 용액을 완전히 제거하고 3차 증류수를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
실시예 6: 임상적검체의 plasmid DNA 클로닝
클론으로 보유하고 있지 않은 HPV 유전자형과 바이오메트릭스에서 얻은 HPV 유전자형 42, 45와 역 교잡 혼성화 방법을 통하여 typing이 된 검체를 최종적으로 검증하기 위하여 MY11/09 프라이머로 PCR 한 후 TOPO TA Cloning kit를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 양성 클론은 제노텍에 시퀀싱을 의뢰하여 분석한 후 유전자 형이 정확한지를 분석한 후 최종 HPV 타입의 클론으로 확보하였다.
도 1은 본 발명에서 언급한 Reverse Blot Hybridization의 기본 원리에 대한 설명도이다. 즉 ① 아민기를 표지한 프로브를 멤브레인에 결합시킴.②타겟 유전자를 biotin이 라벨된 프라이머로 증폭한 후, membrane에 결합된 프로브와 반응시킴. ③ Streptavidin-conjugated alkaline phosphatase와 반응시킴. ④ Alkaline phosphatase의 기질을 처리하여 프로브와 증폭된 타켓유전자의 결함을 검출함.
도 2는 확보된 ATCC 클론 중 고위험군에 속하는 HPV 타입 35, 43, 56, 16, 18과 저위험군 HPV 타입 6. 11, 44 클론으로부터 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하여 membrane에 결합된 프로브와 Reverse Blot Hybridization 반응을 시켜 발광으로 검출하는 것을 보여주는 사진.
도 3은 Digene양성 검체 (by HC2)와 이미 시퀀싱으로 genotype이 확인된 임상검체를 본 발명의 프라이머와 프로브를 사용한 Reverse Blot Hybridization을 통한 검증결과임. HC2 양성 검체를 44개를 확보하였으나 GP5+/GP6+프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 결과 31개의 검체가 양성으로 나왔으며 이 검체를 membrane에 결합된 프로브와 Reverse Blot Hybridization 반응을 시켜 발광으로 검출한 것임.
도 4는 26개의 Reverse Blot Hybridization 양성 반응 검체들의 HPV 타입의 분포도. 31개의 PCR 양성검체들 중 26개의 Reverse Blot Hybridization 양성 결과가 도출되었으며 단독감염이 73 %, 2개 이상의 중복 감염이 26.9 %로 추정됨.
도 5는 프라즈미드 DNA 클론의 Reverse Blot Hybridization 결과를 발광으로 검출한 것을 나타내는 사진. 최종적으로 genotyping을 하기 위해서 본 발명에서는 HPV L1 유전자를 MY11/09 primer로 증폭한 산물을 플라스미드 DNA 클론을 확보하고자 함. HPV 타입 31, 33의 L1 유전자가 삽입된 클론, 바이오메트릭스에서 제공받은 DNA 중 HPV 타입 45, 미즈메디 병원으로부터 확보한 HPV 타입 58의 L1유전자 삽입 클론을 확보하여 시퀀싱 결과를 얻었으며 상기 클론들을 Reverse Blot Hybridization 한 결과임. (타입 42는 임상검체)
도 6은 프라즈미드 DNA 클론의 Reverse Blot Hybridization 결과를 발색으로 검출한 것을 나타내는 사진. 도 5와 같은 실험으로 최종단계에서 경제적이고 용이한 발색반응으로 검출이 가능함을 검증한 것임.
<110> Molecules and Diagnostics Inc. <120> Probe for detecting HPV and Genotyping method thereof <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MY11 primer <400> 1 gcmcagggwc tataayaatg g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MY09 primer <400> 2 cgtccmarrg gawactgatc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP5+ primer <400> 3 tttgttactg tggtagatac 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP6+ primer <400> 4 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Type 16 <400> 5 cattatgtgc tgccatatc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 18 <400> 6 tgcttctaca cagtctcct 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 31 <400> 7 gcaattgcaa acagtgatac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 33 <400> 8 tgcacacaag taactagtga 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 35 <400> 9 ctgctgtgtc ttctagtga 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 39 <400> 10 atagagtctt ccataccttc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 45 <400> 11 taatttaaca ttatgtgcct c 21 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 51 <400> 12 tgctgcggtt tccccaa 17 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 52 <400> 13 gaataccttc gtcatggc 18 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 56 <400> 14 cagaacagtt aagtaaatat g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 58 <400> 15 tatgcactga agtaactaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 59 <400> 16 tctactactg cttctattcc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 68 <400> 17 cagactctac tgtaccagc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 6 <400> 18 tccgtaacta catcttcca 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 11 <400> 19 tctgtgtcta aatctgctac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 42 <400> 20 tggtgataca tatacagctg 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 43 <400> 21 tctactgacc ctactgtg 18 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV TYPE 44 <400> 22 tactagtgaa caatataagc a 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-Universal <400> 23 gncatgnnga rgaatwtga 19

Claims (8)

  1. 서열번호 5 내지 서열번호 23의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브.
  2. 제 1항의 프로브 및 프라이머를 포함하는 HPV 진단용 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 키트.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 키트는 PCR 산물을 탐지하기 위한 표지수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 키트.
  5. a) 제 1항의 프로브를 고체 서포트에 부착하는 단계;
    b) 상기 프로브에 증폭된 HPV PCR 산물을 교잡하는 단계; 및
    c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 확인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 고체 서포트는 막, 슬라이드, 또는 웰 플레이트인 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 PCR 산물은 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머를 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
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Cited By (3)

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EP2535411A1 (en) * 2010-02-12 2012-12-19 M&D.Inc. Probe for hpv genotype diagnosis and analysis method thereof
EP2563939A1 (en) * 2010-04-29 2013-03-06 Diagcor Bioscience Incorporation Limited Rapid genotyping analysis for human papillomavirus and the device thereof
CN107090520A (zh) * 2017-04-27 2017-08-25 广州和实生物技术有限公司 一种运用反向点杂交法快速检测hpv基因型的试剂盒

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2535411A1 (en) * 2010-02-12 2012-12-19 M&D.Inc. Probe for hpv genotype diagnosis and analysis method thereof
EP2535411A4 (en) * 2010-02-12 2013-07-03 M & D Inc PROBE FOR THE DIAGNOSIS OF GENOTYPES OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND ANALYSIS METHOD THEREOF
EP2563939A1 (en) * 2010-04-29 2013-03-06 Diagcor Bioscience Incorporation Limited Rapid genotyping analysis for human papillomavirus and the device thereof
EP2563939A4 (en) * 2010-04-29 2014-01-22 Diagcor Bioscience Inc Ltd QUICK GENOTYPIZING ANALYSIS FOR THE HUMANE PAPILLOMA VIRUS AND DEVICE THEREFOR
CN107090520A (zh) * 2017-04-27 2017-08-25 广州和实生物技术有限公司 一种运用反向点杂交法快速检测hpv基因型的试剂盒

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