CN102428183B - 人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法 - Google Patents

人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人类乳头瘤病毒检测用引物，探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法。具体地说，本发明涉及包含由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对、由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对、由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对、由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对、由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对、及由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对的，能够特异性检测出人类乳头瘤病毒的引物，探针，包含它的人类乳头瘤病毒检测用微阵列，人类乳头瘤病毒检测用试剂盒及使用所述的引物或探针检测人类乳头瘤病毒的方法。依照本发明的人类乳头瘤病毒检测用引物及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法具有非常有用的效果，能够特异性地、快速准确地掌握作为皮肤粘膜疣的原因的人类乳头瘤病毒HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27及HPV-57的存在与否及类型。

Description

人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法
技术领域
本发明涉及人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法。
背景技术
人类乳头瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)是乳多空病毒科(Papovaviridae family)所属环状双螺旋DNA病毒，能够感染人类及哺乳动物的上皮样细胞，与如疣的引起各种恶性肿瘤的症状密切相关，已知是宫颈癌的重要病因因子。
迄今为止已知的100余种HPV中，在生殖器官中发现了40余种，确认了其中的高危群HPV-16及HPV-18的发展速度比其它的HPV类型快约40％左右，并且其重要性占全部宫颈癌中发现的HPV的约70％左右。另外，HPV-26、HPV-30、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-61、HPV-66、HPV-67、HPV-68、HPV-69、HPV-70、HPV-73等因其发展成为宫颈癌的机率相对较高而被分类为“高危群(high risk group)”，HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-6、HPV-7、HPV-10、HPV-11、HPV-13、HPV-32、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-57、HPV-72、HPV-81等被分类为“低危群(low risk group)”。
另一方面，在全部粘膜皮肤HPV感染中最常见的感染原因是并非与宫颈癌相关的高危群HPV的低危群HPV(HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4)，该低危群HPV通常引起粘膜和皮肤的疣病变。
疣作为HPV感染皮肤或粘膜产生的非常常见的病毒感染性疾病的一种，引起表皮过度增殖，表现为表面凹凸不平的丘疹。在任何部位的皮肤上均有可能发生，但主要发生在暴露部位的手、足、腿、脸等，也可以通过性接触发生在性器官。
通常情况下，疣根据临床类型可分为寻常疣、扁平疣、跖疣及尖锐湿疣。其中尖锐湿疣与宫颈癌相关，对它的研究比较活跃，最近能够预防它的疫苗已实现商业化。然而如寻常疣的常见皮肤疾病由于与致死无关，因此在此期间未受到医生或科学家的关注，事实上与它相关的基础研究几乎成为空白。
HPV感染的诊断方法大致可分为细胞学方法和分子生物学方法。判断HPV感染细胞的形态变化的细胞学方法有巴氏涂片检查法(Papanicolaou(Pap)Smear)，但其诊断的客观性低，而且具有较高的假阴性率(15～45％)，因此存在着不具有一贯准确性的问题。
另一方面，分子生物学方法利用病毒的DNA检测HPV的存在及基因型，大致可分为直接鉴定HPV DNA的方法和利用PCR扩增实施鉴定的方法。该方法能够客观地检测出HPV DNA，诊断准确性显著，在利用细胞学方法不能明确诊断的情况下，具有能够在初期诊断出疾病的优点。
为了直接确认HPV DNA，传统上使用利用HPV类型特异性的探针的如Southern印迹杂交(southern blotting)、斑点印迹法(dot blotting)及FISH(Filter insitu hybridization)的方法，尽管受到FDA认可的二代杂交捕获法(Hybridcapture II)得到广泛使用，但因需要大量的HPV DNA，在HPV初期感染或样品采集稀少的情况下表现出检测限制，并且使用RNA探针因而安全性低，不仅如此还存在着设备比较昂贵、灵敏度降低的问题。
相反地，PCR技术作为能够利用与目标病原体的核酸碱基序列特异性结合的互补寡核苷酸(引物)对微量的病原体核酸进行扩增，检测其是否存在的技术，是多种类型的HPV感染与否的诊断中使用的代表性技术中的一种。上述PCR技术可实现客观的大规模检测，与上述细胞学方法及HPV DNA直接检测法相比，在准确性、易用性及费用方面受到了具有相对优势的评价。
到目前为止，基于PCR的HPV检测法中使用的引物，已开发出与HPV类型无关地使其DNA扩增的通用引物，或是与各种类型特异性结合而仅使型特异性HPV DNA选择性扩增的型特异性引物。
然而上述传统技术在与迄今为止揭示的多种HPV类型进行比较时，仅能够诊断出极其有限的类型的HPV，并且存在着基于HPV类型的检测的灵敏度大幅降低等问题，在实际临床使用上受到较大的限制。尤其是即使借助使用通用引物的PCR反应得到了扩增产物，也难以准确地确认新鉴定分类的HPV类型是高危群还是低危群，在使用型特异性引物的情况下，为了确认样品内是否存在HPV，存在着需要同时使用各种不同引物的麻烦，在临床上广泛使用方面受到限制。
因此为了提高基于是否使用PCR进行HPV DNA扩增的疾病诊断的实际使用效率，急需开发出能够选择性地对HPV类型进行扩增，从而能够在初期诊断出是否感染HPV，并一次简便地诊断出HPV引起的疾病的引物。
发明内容
要解决的技术问题
为此，本发明的发明者发现了用于特异性检测出粘膜皮肤疣的产生原因即6种亚型的人类乳头瘤病毒的新型PCR引物对，并利用它开发出按不同类型特异性地快速检测出人类乳头瘤病毒的方法，并完成本发明。
因此本发明的目的在于，提供一种能够有效检测出人类乳头瘤病毒的人类乳头瘤病毒检测用引物及探针。
本发明的另一目的在于，提供一种人类乳头瘤病毒检测用微阵列，其特征在于将所述的探针集成在基质上。
本发明的又一目的在于，提供一种使用所述的引物或探针的检测人类乳头瘤病毒的方法。
此外，本发明的又另一目的在于，提供一种包含所述的引物或探针的人类乳头瘤病毒检测用试剂盒。
技术方案
为实现如上所述的本发明的目的，本发明提供了包含由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对、由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对、由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对、由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对、由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对、及由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对的人类乳头瘤病毒检测用引物。
另外，本发明提供了包含由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对、由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对、由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对、由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对、由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对、及由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对的人类乳头瘤病毒检测用探针。
本发明的一实施例中，人类乳头瘤病毒检测用引物的特征在于，所述的第1引物对是HPV-1DNA的扩增引物，所述的第2引物对是HPV-2DNA的扩增引物，所述的第3引物对是HPV-3DNA的扩增引物，所述的第4引物对是HPV-4DNA的扩增引物，所述的第5引物对是HPV-27DNA的扩增引物，所述的第6引物对是HPV-57DNA的扩增引物。
另外，本发明提供了包括固定在基质上的所述的引物或探针的人类乳头瘤病毒检测用微阵列。
另外，本发明提供了包含所述的引物或探针的人类乳头瘤病毒检测用试剂盒。
另外，本发明提供了人类乳头瘤病毒的检测方法，该方法中包括了以使用所述的人类乳头瘤病毒检测用引物的聚合酶链式反应探测人类乳头瘤病毒的步骤。
本发明的一实施例中，所述的人类乳头瘤病毒可以选自HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27及HPV-57组成的群。
有益效果
依照本发明的人类乳头瘤病毒检测用引物或探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法，具有能够快速准确地掌握成为皮肤粘膜疣的原因的6种亚型(HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57)的人类乳头瘤病毒的存在与否及类型的效果，能够减少检测感染在疣中的人类乳头瘤病毒所花费的时间和费用，有效地进行诊断。
附图说明
图1所示为本发明的一实施例中的代表具有6种亚型的标准品HPV DNA各亚型的扩增用引物对实施多重聚合酶链式反应的结果的照片。其中，列M代表尺寸标记物(size marker)，列1代表HPV-1，列2代表HPV-2，列3代表HPV-3，列4代表HPV-4，列5代表HPV-27，列6代表HPV-57。
图2所示为本发明的另一实施例中的代表以6种亚型的标准品HPV DNA的混合物为模板利用6种引物掺杂形成的引物试剂盒实施多重聚合酶链式反应的结果的照片。其中，列M代表尺寸标记物(size marker)，列1代表HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的混合液。
图3所示为本发明的又一实施例中的代表利用6种引物掺杂形成的引物试剂盒以各个标准品HPV亚型DNA为单一模板实施多重聚合酶链式反应的结果的照片。其中，列M代表尺寸标记物(size marker)，列1代表HPV-1、列2代表HPV-2、列3代表HPV-3、列4代表HPV-4、列5代表HPV-27、列6代表HPV-57的混合液。
图4所示为本发明的又另一实施例中的代表反应结束的PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶上利用电泳展开后以DNA的尺寸确认HPV的存在及亚型的结果的照片。其中，列M代表100bp Ladder的尺寸标记物(size marker)。
具体实施方式
本发明的发明者设计出能够特异性检测出成为皮肤粘膜疣的原因的人类乳头瘤病毒的引物及探针，开发出使用所述的引物或探针的人类乳头瘤病毒的检测方法及包含所述的引物或探针的人类乳头瘤病毒检测用试剂盒及微阵列。
因此，本发明的特征在于，提供了能够检测出人类乳头瘤病毒中6种亚型的人类乳头瘤病毒的引物，具体地说，提供了包含由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对、由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对、由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对、由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对、由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对、及由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对的人类乳头瘤病毒检测用引物。
本发明中，人类乳头瘤病毒是发生皮肤粘膜疣的原因因子，以HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57亚型的人类乳头瘤病毒为佳。
依照本发明的所述的人类乳头瘤病毒检测用引物是指能够与人类乳头瘤病毒的基因互补杂交的引物，优选地，可以是能够扩增所述的人类乳头瘤病毒的特异性基因的引物、引物对或引物试剂盒。
本发明中，术语“引物”意指能够以带有短游离3′-末端羟基(free 3′hydroxylgroup)的核酸序列与互补模板(template)形成碱基对，并且起到模板分段复制用起点的作用的短核酸序列。即，引物是指能够在合适的缓冲液中在合适的条件(例如，四种不同的三磷酸核苷及如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的聚合剂)及合适的温度下，开始模板指示DNA合成的单链寡核苷酸。
另外，本发明的引物可以使用固相亚磷酰胺三酯法，或其它公知的方法通过化学方式合成。另外，上述引物在不对人类乳头瘤病毒的特异性检测产生影响的范围内，可以利用相应领域公知的多种方式进行变型(例如：添加，缺失，置换)，尽管无需与模板完全互补，但也需要以能够与模板杂交的程度充分互补。上述变型的非限定性例子，如甲基化，加帽，利用一个以上同族体置换天然核苷酸，及核苷酸之间的变形，例如，不带电的连结体(例如：甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷胺酸二乙酯、氨基甲酸酯等)或带电的连结体(例如：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的变型。核酸可以含有一个以上附加的共价结合的残基，例如，蛋白质(例如：核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚左旋赖氨酸等)，嵌入剂(例如：吖啶、补骨脂素等)，络合剂(例如：金属、放射性金属、铁、氧化性金属等)及烷基化剂。本发明的核酸序列还可以利用能够直接或间接地提供可检测的信号的标记发生变型。上述标记例如放射性同位素、荧光性分子、生物素等。
本发明中，能够检测出人类乳头瘤病毒的引物可以是特异性扩增HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27及HPV-57的特定区域的引物。另外，本发明的引物可以是能够与所述的基因互补结合的具有10至40个，优选20至30个碱基序列的正向及反向引物对。
本发明的所述的引物，更优选地，可以是由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对，由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对，由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对，由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对，由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对及由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对。
具体地说，HPV-1通过具有序列编号1和2的碱基序列的引物对，HPV-2通过具有序列编号3和4的碱基序列的引物对，HPV-3通过具有序列编号5和6的碱基序列的引物对，HPV-4通过具有序列编号7和8的碱基序列的引物对，HPV-27通过具有序列编号9和10的碱基序列的引物对，HPV-57通过具有序列编号11和12的碱基序列的引物对，分别能够特异性地扩增各自基因的特定区域。
本发明中，提供了如上所述的特异性基因扩增用引物对，以探测出HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的亚型的特异性DNA碱基序列，尤其是6种亚型的人类乳头瘤病毒引物对全部混合而成的引物试剂盒。能够设计并合成出6种PCR引物对，使所述的6种亚型的人类乳头瘤病毒的特异性DNA碱基序列，在尺寸相互不同的情况下同时被探测出来。
根据本发明的一实施例，在所述的人类乳头瘤病毒检测用引物对中，设计出如下记录的由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对T1-5/T1-3，以特异性探测出HPV-1，扩增特异性基因约575bp。
序列编号1(T1-5)：5′-GTGAACCATCATTTACAATAGTGA-3′
序列编号2(T1-3)：5′-ACGACCAGATAAGTTTGGCAGCA-3′
另外，设计出如下记录的由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对T2-5/T2-3，以特异性探测出HPV-2，扩增特异性基因约222bp。
序列编号3(T2-5)：5′-ATACATTTCAAGGCCTGCCTCCGCA-3′
序列编号4(T2-3)：5′-ACGTATGGCGAAATAATAACGACTA-3′
另外，设计出如下记录的由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对T3-5/T3-3，以特异性探测出HPV-3，扩增特异性基因约348bp。
序列编号5(T3-5)：5′-TACTATTTGTGCAGGCTTTCTCTGT-3′
序列编号6(T3-3)：5′-ACAGGTGACCTGCAACTACAACCT-3′
另外，设计出如下记录的由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对T4-5/T4-3，以特异性探测出HPV-4，扩增特异性基因约437bp。
序列编号7(T4-5)：5′-TCTGGAATGTTTTATTCTGCCAGGA-3′
序列编号8(T4-3)：5′-ATTTTCCACCACTCCCGGTGCAAA-3′
另外，设计出如下记录的由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对T27-5/T27-3，以特异性探测出HPV-27，扩增特异性基因约174bp。
序列编号9(T27-5)：5′-TAATTGTGACATATCGCCACCAT-3′
序列编号10(T27-3)：5′-TAAGCCAATGAGGGTGAGAA-3′
另外，设计出如下记录的由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对T57-5/T57-3，以特异性探测出HPV-57，扩增特异性基因约511bp。
序列编号11(T57-5)：5′-GYAACATTTCACAGCCTGTATCAT-3′
序列编号12(T57-3)：5′-GTTTATTGACACGYAGCAATACA-3′
因此，本发明的人类乳头瘤病毒检测用引物对不仅分别对6种人类乳头瘤病毒，即，HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57具有特异性，而且能够以相互不同的尺寸扩增特异性基因，因此能够分别探测出6种人类乳头瘤病毒，也能够同时探测出所述的6种人类乳头瘤病毒。因此，本发明的所述的引物能够有效使用在是否感染HPV，确认感染的HPV遗传型，HPV免疫学检测，HPV疫苗的有效性及危害度检测等。
另外，本发明提供了能够检测出人类乳头瘤病毒的探针。
依照本发明的能够检测出人类乳头瘤病毒的所述的探针，优选地，其组成可以是由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对，由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对，由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对，由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对，由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对及由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对。
另外，优选地，所述的第1引物对是HPV-1DNA的扩增引物，所述的第2引物对是HPV-2DNA的扩增引物，所述的第3引物对是HPV-3DNA的扩增引物，所述的第4引物对是HPV-4DNA的扩增引物，所述的第5引物对是HPV-27DNA的扩增引物，所述的第6引物对是HPV-57DNA的扩增引物。
本发明中，所述的“探针”意指能够与DNA或RNA形成特异性结合的数个至数百个碱基对应的核酸片段，另外所述的探针中形成标记(labeling)，能够确认特定DNA或RNA是否存在。探针可制作成寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针等形态，可利用生物素、FITC、罗丹明及DIG等标记，或利用放射线同位素等标记。
另外，本发明提供了包括固定在基质上的所述的引物或探针的人类乳头瘤病毒检测用微阵列。
所述的微阵列可以包括DNA或RNA聚核苷酸。所述的微阵列除了在探针或引物的聚核苷酸中包含本发明的聚核苷酸之外，由普通的微阵列组成。
将探针聚核苷酸固定在基质制备微阵列的方法为业界所公知。本发明中，所述的“探针聚核苷酸”意指可杂交的聚核苷酸，意味着能够序列特异性地结合在核酸的补链上的寡核苷酸。上述探针中可包含Nielsen等在Science254，1497-1500(1991)中记录的肽核酸。
依照本发明的将人类乳头瘤病毒相关探针聚核苷酸固定在基板上的过程，也可以使用传统技术容易地进行制备。另外，微阵列上的核酸的杂交及杂交结果的检测也为业内公知。所述的检测举例来说，核酸试样列举荧光物质为例，利用包含如Cy3及Cy5的物质的能够发生可检测信号的标记物质进行标记，之后杂交在微阵列上，通过检测由所述的标记物质产生的信号，能够检测出杂交的结果。
另外，本发明提供了利用依照本发明的人类乳头瘤病毒检测用引物或探针检测人类乳头瘤病毒的方法。
本发明的能够检测出人类乳头瘤病毒尽管不限定于此，但可通过多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction)，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptasePCR)，DNA测序(DNA sequencing)，基于微阵列(microarray)的杂交，PCR-RFLP(restriction fragment length polymerphism)，RAPD(randomlyamplified polymorphic DNA)，DAF(DNA amplification fingerprinting)，AP-PCR(arbitrarily primed PCR)，STS(sequence tagged site)，EST(expressedsequence tag)，SCAR(sequence characterized amplified regions)，ISSR(inter-simple sequence repeat amplication)，AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism)，CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)，PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)，Northern印迹杂交(Northern blot)及Southern印迹杂交(Southern blot)所组成的群中选择的一种以上的方法实施。
本发明中，术语“聚合酶链式反应(polymerase chain reaction：PCR)”是在试管内利用酶对特定DNA区域的所需部分进行扩增的，代表性的核酸扩增技术(NAT)中的一种。于1985年由穆里斯(Mullis)等人开发出来，无论DNA分子的任何部分，只需知道其旁邻序列，即可通过该方法进行扩增。PCR基本上由变性、退火、延长三个阶段组成，在重复该过程的同时扩增DNA。在PCR的第1阶段变性阶段使模板DNA变性为单链，在第2阶段的退火阶段使其结合在位于目标区域之间的两种单链DNA。并且，在第3阶段延伸阶段，利用耐高温的DNA聚合酶由引物合成DNA，以上循环重复25至30次。
本发明的所述的人类乳头瘤病毒检测方法中可使用的引物或探针，可以是由序列编号1及2的碱基序列组成的HPV-1检测用第1引物对、由序列编号3及4的碱基序列组成的HPV-2检测用第2引物对、由序列编号5及6的碱基序列组成的HPV-3检测用第3引物对、由序列编号7及8的碱基序列组成的HPV-4检测用第4引物对、由序列编号9及10的碱基序列组成的HPV-27检测用第5引物对、及由序列编号11及12的碱基序列组成的HPV-57检测用第6引物对组成的群中所选的一种以上引物对或探针。
具体地说，本发明的一实施例中提出了利用使用依照本发明的引物多重聚合酶链式反应(M-PCR)的方法，仅特异性检测出人类乳头瘤病毒中的6种亚型的方法。即，利用能够扩增HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的6种亚型特异性DNA碱基序列的引物对，能够分别检测6种亚型人类乳头瘤病毒。
另外，本发明的另一实施例中，利用使用包含全部6对引物对的引物试剂盒的多重聚合酶链式反应，能够将HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57中的一种以上类型，根据扩增出的DNA的尺寸加以区分，同时将其检测出来。
依照本发明的一实施例，首先采集疣皮肤组织，实施蛋白酶K(proteinaseK)，由组织提取出DNA，之后将其作为模板DNA，实施使用PCR引物混合液的多重聚合酶链式反应。若多重聚合酶链式反应结束，则将扩增的DNA在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据有无特异性DNA碱基序列扩增及其尺寸确认及判定亚型(参照图1至图3)。
如上所述，使用能够分别对HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57特异性的DNA进行扩增的引物试剂盒，实施多重聚合酶链式反应的结果，能够确认出种亚型的特异性引物对，不能扩增不同类型的人类乳头瘤病毒DNA。
因此，本发明的检测方法的特征在于，不仅能够利用第1引物对至第6引物对中选择的1种引物对，特异性地检测出各种人类乳头瘤病毒亚型，而且利用含有全部6种引物对的引物试剂盒实施多重聚合酶链式反应，从而能够一次快速检测出6种类型(HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57)的人类乳头瘤病毒。
另外，其特征在于，能够更加容易快速地确认皮肤或粘膜中产生的各种疣的亚型，在此期间相对于表现出极低致病率的高危群疣，以实际上最常接触到的疣类型为重点，可提高诊断价值。
本发明进一步提供了包含所述的依照本发明的人类乳头瘤病毒检测用引物或探针的人类乳头瘤病毒检测用试剂盒。
所述的检测用试剂盒可以包含依照本发明的人类乳头瘤病毒检测用引物或探针，所述的试剂盒可以包含病毒检测试剂盒通常的组成成分，所述的通常的组成成分可以包括反应缓冲液、DNA聚合酶及dNTP等。
本发明的一实施例中的人类乳头瘤病毒检测用试剂盒中，包括含有依照本发明的序列编号1-12的碱基序列的6对引物对(T1-5/T1-3；T2-5/T2-3；T3-5/T3-3；T4-5/T4-3；T27-5/T27-3；T57-5/T57-3)的引物试剂盒，反应缓冲液及Taq DNA聚合酶。
以下通过实施例对本发明进行详细说明。然而该实施例用于更加具体地对本发明进行说明，本发明的范围并不限定于该实施例。
<实施例1>
6种亚型的特异性DNA碱基序列扩增用引物的设计及合成
本发明的发明者设计及合成出检测用PCR引物，作为以如表1的HPV基因之间的(intergenic sequence)为对象的各个类型的特异性碱基序列，能够不引起皮肤粘膜疣的HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的相互交叉反应，可一次将其检测出来。
【表1】
Figure BPA00001462289900121
<实施例2>
人类乳头瘤病毒检测用试剂盒的制备
本发明的发明者制备出包含所述的实施例1中合成出的6对PCR引物(序列编号(1-12)的多重聚合酶链式反应混合液，制备出检测用试剂盒。其中，检测试剂盒由10X反应缓冲液、多重引物混合液(序列编号1-12)及Taq DNA聚合酶(5U/μl)组成。
<实施例3>
使用6种亚型各自的引物对实施多重聚合酶链式反应
本发明的发明者利用6种亚型的标准品HPV DNA，以各个亚型的扩增用引物对实施多重聚合酶链式反应。
首先采集疣皮肤组织，进行蛋白酶K(proteinase K)处理，由组织提取DNA，之后以此作为模板DNA，利用PCR引物混合液实施多重聚合酶链式反应。若多重聚合酶链式反应结束，则将扩增的DNA在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据有无特异性DNA碱基序列扩增及其尺寸确认及判定亚型，其结果如图1所示。
根据其结果能够确认，由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对扩增HPV-1DNA，由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对扩增HPV-2DNA，由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对扩增HPV-3DNA，由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对扩增HPV-4DNA，由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对扩增HPV-27DNA，由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对扩增HPV-57DNA(参照图1)。
<实施例4>
使用本发明的引物试剂盒利用多重聚合酶链式反应检测人类乳头瘤病 毒
本发明的发明者通过所述的实施例3，确认了本发明中，设计出的各个引物能够特异性地扩增人类乳头瘤病毒的各个种类，利用所述的各个引物对作为一个引物试剂盒，进一步探明了6种亚型的人类乳头瘤病毒是否能够一次检出。为此以标准品HPV DNA混合物为模板，利用6对引物混合而成的引物试剂盒实施多重聚合酶链式反应。实验方法同所述的实施例3实施，实验结果如图2所示。
其结果，在使用包含HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57各自亚型的特异性引物对的本发明的引物试剂盒的情况下，各个引物对不扩增其它类型的人类乳头瘤病毒的DNA，而特异性扩增能够扩增所述的引物对的人类乳头瘤病毒，因此通过所述的结果可知，本发明的发明者在使用包含6对引物对的本发明的引物试剂盒的情况下，能够简便准确地扩增出多个种类的人类乳头瘤病毒。
<实施例5>
使用本发明的引物试剂盒利用多重聚合酶链式反应检测人类乳头瘤病 毒
本发明的发明者以6种亚型各自的标准品人类乳头瘤病毒亚型DNA为单一模板，利用6对引物混合而成的引物试剂盒实施多重聚合酶链式反应。所述的实验方法同实施例3实施，其结果如图3所示。
其结果能够确认，本发明的HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57各自亚型的特异性引物对不能扩增其它类型的人类乳头瘤病毒DNA。
<实施例6>
使用多重聚合酶链式反应从寻常疣组织中探测出人类乳头瘤病毒
以提取自疣组织的DNA为模板，利用所述的实施例2中制备的多重聚合酶链式反应混合液引发聚合酶链式反应，扩增出人类乳头瘤病毒的亚型特异性DNA碱基序列。扩增出的DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳后，根据特异性DNA有无扩增和扩增出的DNA的尺寸判定人类乳头瘤病毒的存在及亚型。
<6-1>从疣组织分离出DNA
采集分别判定为不同疣的6个组织，至于1.5ml离心管中，在其中加入细胞分解缓冲溶液400μl，之后在37℃处理16-18小时。在确认组织全部被破坏后，在95℃加热10分钟，消除蛋白酶K(proteinase K)的活性，在其中添加等体积的苯酚进行离心分离。将上清液移至另一离心管中，在其中添加两倍的乙醇，-20℃保存2小时。离心分离15分钟，弃去上清液，之后在DNA沉淀中加入50μl蒸馏水，溶解DNA将其分离。
<6-2>制备PCR反应液
在各个疣组织DNA 2μl中添加10X反应缓冲液5μl，2.5mM dNTP 4μl，多重引物混合液，即，混合有本发明的6对引物的引物混合液12μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，之后以灭菌蒸馏水定容，使反应液总体积达到50μl，制备PCR反应液。
<6-3>实施多重聚合酶链式反应
利用所述的<6-2>中制备的PCR反应液实施多重聚合酶链式反应。多重聚合酶链式反应的条件为，在94℃实施预变性(initial denaturation)1分30秒，之后在94℃实施变性(denaturation)30秒，在55℃实施退火(annealing)30秒，之后在72℃延伸(extension)30秒，全部过程总共重复实施30次。
<6-4>判定人类乳头瘤病毒的有无及亚型
所述的<6-3>中反应结束后的PCR反应产物，在1.8％琼脂糖凝胶上电泳展开，利用DNA尺寸确认HPV的存在及亚型，结果如图4所示。
其结果，对于各个疣组织样品，确认了通过使用依照本发明的引物对的多重聚合酶链式反应扩增的DNA产物，其尺寸分别为437bp，575bp，222bp，174bp，511bp及222bp。因此，通过扩增的产物的尺寸可知，437bp为HPV-4，575bp为HPV-1，222bp为HPV-2，174bp为HPV-27，511bp为HPV-57及222bp为HPV-27。
因此通过所述的结果可知，表1中记录的本发明的引物是能够特异性扩增HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的引物，利用本发明的引物通过如PCR的基因扩增方法，能够快速准确地判定成为皮肤粘膜疣的主要原因的人类乳头瘤病毒的存在与否及类型。
另外，本发明能够更加容易地判断出皮肤粘膜疣的亚型，广泛使用在各种疣的自身接种与否、感染路径掌握、复发的确认、再感染的确认、亚型中发发病率检测、及各种疣的免疫学检测等。另外，通过本发明能够对研究基础组成，以及疣的亚型中的临床表现的差异和发生期限，有无治疗的抵抗性，各种预后因子的研究等，更加容易、简便、准确地进行诊断。
上面以优选的实施例为中心对本发明进行了观察。在本发明所属技术领域具有普通知识的技术人员应当理解，本发明能够在不脱离本发明的本质特性的范围内实现变型。因此应当考虑到公开的实施例是说明性的观点而非限定性的观点。本发明的范围体现在权利要求范围内而非上述说明，并且在其同等范围内的全部差异应当解释为包含在本发明中。
序列表之非关键词文字
序列表中记录了12个碱基序列，该碱基序列组成了包含在人类乳头瘤病毒检测用引物或探针中的引物对。
Figure IPA00001462289300011
Figure IPA00001462289300021
Figure IPA00001462289300031

Claims (4)

1.一种人类乳头瘤病毒检测用引物或探针，其能够不引起相互交叉反应而检测出人类乳头瘤病毒HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27以及HPV-57，其特征在于，由以下引物对构成：
由序列编号1及2的碱基序列组成的第1引物对；
由序列编号3及4的碱基序列组成的第2引物对；
由序列编号5及6的碱基序列组成的第3引物对；
由序列编号7及8的碱基序列组成的第4引物对；
由序列编号9及10的碱基序列组成的第5引物对；及
由序列编号11及12的碱基序列组成的第6引物对。
2.根据权利要求1所述的人类乳头瘤病毒检测用引物或探针，其特征在于，
所述的第1引物对是HPV-1DNA的扩增引物，
所述的第2引物对是HPV-2DNA的扩增引物，
所述的第3引物对是HPV-3DNA的扩增引物，
所述的第4引物对是HPV-4DNA的扩增引物，
所述的第5引物对是HPV-27DNA的扩增引物，
所述的第6引物对是HPV-57DNA的扩增引物。
3.一种人类乳头瘤病毒检测用微阵列，其用于检测人类乳头瘤病毒HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27以及HPV-57，其特征在于，在基质上固定有如权利要求1或权利要求2中所述的引物或探针。
4.一种人类乳头瘤病毒检测用试剂盒，其用于检测人类乳头瘤病毒HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27以及HPV-57，其特征在于，包含如权利要求1或权利要求2中所述的引物或探针。
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