WO2010128724A1 - 인체유두종바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법 - Google Patents

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WO2010128724A1
WO2010128724A1 PCT/KR2009/005129 KR2009005129W WO2010128724A1 WO 2010128724 A1 WO2010128724 A1 WO 2010128724A1 KR 2009005129 W KR2009005129 W KR 2009005129W WO 2010128724 A1 WO2010128724 A1 WO 2010128724A1
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WO
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primer
hpv
human papillomavirus
primer pair
dna
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PCT/KR2009/005129
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최순용
박영민
김범준
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Definitions

  • the present invention relates to a primer for detecting human papillomavirus, a probe and a method for detecting human papillomavirus using the same.
  • HPV Human Papilloma virus
  • HPV-26 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 69, 70, 73, etc.
  • HPV-1 2, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 72 and 81 are classified as "low risk groups”.
  • HPV-1 high-risk HPVs
  • HPV-2 high-risk HPVs associated with cervical cancer
  • these low-risk HPVs generally have wart lesions on mucous membranes and skin.
  • Warts are a very common viral infection that occurs when HPV is infected with the skin or mucous membranes. Excessive proliferation of the epidermis results in bumpy surface papules. It can occur on the skin of any part, but occurs mainly on the exposed hands, feet, legs, face, etc., and can also occur on the genitals through sexual contact.
  • warts are classified into common warts, flat warts, plantar warts, and genital warts according to clinical types.
  • genital warts are related to cervical cancer, and research on these has been relatively active.
  • a vaccine to prevent this has been commercialized.
  • common skin diseases, such as warts have not been associated with direct death, so they have been alienated by doctors and scientists, and there is little basic research on this.
  • the diagnosis of HPV infection is largely divided into cytological and molecular biological methods.
  • the cytological method for determining the morphological changes of HPV infected cells is the Pap smear (Papanicolaou (Pap) Smear), but the problem of not having consistent accuracy due to low objectivity of diagnosis and high false negative rate (15-45%). There is this.
  • the molecular biological method is to examine the presence and genotype of HPV using the DNA of the virus, it is largely divided into a method of directly identifying the HPV DNA and amplification by PCR. This method has the advantage of being able to objectively detect the HPV DNA and to make the diagnosis accurate, so that the disease can be diagnosed early if the diagnosis is unclear by the cytological method.
  • Hybrid capture II method is widely used, but because it requires a large amount of HPV DNA, it shows a limit of detection when HPV early infection or sampling is insufficient. The equipment is relatively expensive and has a low sensitivity.
  • PCR is a technique that can detect the presence of a variety of types of HPV infection by amplifying a trace amount of the pathogen nucleic acid using a complementary oligonucleotide (primer) that specifically binds to the nucleic acid sequence of the target pathogen. It is one of the representative techniques used to diagnose the disease. These PCR techniques are capable of objective large-scale testing, and are evaluated to have a relative advantage in accuracy, ease, and cost compared to the above-described cytological methods and direct HPV DNA tests.
  • primers used in HPV detection by PCR have been developed by common primers that amplify the DNA regardless of the HPV type, or by type-specific primers that bind specifically to each type to selectively amplify only the type-specific HPV DNA. It became.
  • HPV type can be selectively comprehensively amplified, so that HPV can be diagnosed early and the disease caused by HPV can be diagnosed at once. Development of a primer that can be urgently urgent.
  • the present inventors have found a novel PCR primer pair for specifically detecting six subtypes of human papillomavirus, which is the cause of mucosal skin warts, and can detect human papillomavirus by type in a specific and rapid manner.
  • the present invention has been completed by developing a method.
  • an object of the present invention is to provide a primer and probe for detecting human papillomavirus, which is designed to effectively detect human papillomavirus.
  • Another object of the present invention is to provide a microarray for detecting human papillomavirus, wherein the probe is integrated on a substrate.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting human papillomavirus using the primer or probe.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting human papillomavirus comprising the primer or probe.
  • the present invention comprises a first primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and 2; A second primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4; A third primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6; A fourth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8; A fifth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10; And a sixth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12; It provides a primer for detecting human papillomavirus comprising at least one primer pair selected from the group consisting of.
  • the present invention comprises a first primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2; A second primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4; A third primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6; A fourth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8; A fifth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10; And a sixth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12; It provides a probe for detecting human papillomavirus comprising at least one primer pair selected from the group consisting of.
  • the first primer pair is a primer for amplifying DNA of HPV-1
  • the second primer pair is a primer for amplifying DNA of HPV-2
  • the third primer pair is HPV A primer for amplifying DNA of -3
  • the fourth primer pair is a primer for amplifying DNA of HPV-4
  • the fifth primer pair is a primer for amplifying DNA of HPV-27
  • the sixth primer pair is It may be a primer for detecting human papillomavirus, characterized in that the primer for amplifying the DNA of HPV-57.
  • the present invention also provides a microarray for detecting human papillomavirus, wherein the primer or probe is immobilized on a substrate.
  • the present invention provides a human papillomavirus detection kit comprising the primer or probe.
  • the present invention also provides a method for detecting human papillomavirus comprising the step of detecting human papillomavirus by polymerase chain reaction using the primer for detecting human papillomavirus.
  • the human papillomavirus may be selected from the crowd consisting of HPV-1, 2, 3, 4, 27 and 57.
  • Human papillomavirus detection primer or probe according to the present invention and human papillomavirus detection method using the same is the human papilloma of six subtypes (HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57) that causes skin mucosal warts It is effective to quickly and accurately determine the presence and type of the virus, and can effectively diagnose by reducing the time and cost of detecting human papilloma virus infected with warts.
  • six subtypes HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57
  • Figure 1 is a photograph showing the results of performing a multiplex polymerase chain reaction with a primer pair for amplification of each subtype with standard HPV DNA of six subtypes according to an embodiment of the present invention.
  • lane M represents a size marker
  • lane 1 is HPV-1
  • lane 2 is HPV-2
  • lane 3 is HPV-3
  • lane 4 is HPV-4
  • lane 5 is HPV-27
  • lane 6 represents HPV-57.
  • Figure 2 is a photograph showing the results of performing a multiplex polymerase chain reaction with a primer set of six primers mixed with the standard HPV DNA of six subtypes according to another embodiment of the present invention as a template.
  • lane M represents a size marker
  • lane 1 represents HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 mixed solution.
  • Figure 3 is a photograph showing the results of performing a multiplex polymerase chain reaction with each standard HPV subtype DNA as a single template in a primer set mixed with six primers according to another embodiment of the present invention.
  • lane M represents a size marker
  • lane 1 is HPV-1
  • lane 2 is HPV-2
  • lane 3 is HPV-3
  • lane 4 is HPV-4
  • lane 5 is HPV-27
  • lane 6 represents HPV-57.
  • Figure 4 is a photograph showing the result of confirming the presence and subtype of the HPV by DNA size by electrophoresis of the reaction product PCR completed according to another embodiment of the present invention on 1.8% agarose gel.
  • lane M represents a size marker of a 100 bp ladder.
  • the inventors of the present invention devised a primer and probe that can specifically detect human papillomavirus that causes skin mucosal warts, and a method for detecting human papillomavirus using the primer or probe and human papilloma including the primer or probe.
  • Virus detection kits and microarrays were developed.
  • the present invention is characterized in that it provides a primer for detecting human papilloma virus of six subtypes of human papillomavirus, specifically, the present invention comprises a first primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2; A second primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4; A third primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6; A fourth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8; A fifth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10; And a sixth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12; It provides a primer for detecting human papillomavirus comprising at least one primer pair selected from the group consisting of.
  • Human papillomavirus in the present invention is a causative factor for developing skin mucosal warts, preferably human papillomavirus of subtype HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57.
  • the primer for detecting human papillomavirus refers to a primer that can hybridize complementarily to a gene of human papillomavirus, and preferably a primer, primer pair or primer that can amplify a specific gene of the human papillomavirus. It can be a set.
  • the term “primer” refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 ′ ydroxyl group, which forms a complementary template and base pair and serves as a starting point for template strand copying. Refers to a nucleic acid sequence. That is, the primers can initiate template-directed DNA synthesis under appropriate conditions (eg, four different nucleoside triphosphates and polymerizers such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) in appropriate buffers and at appropriate temperatures. Refers to a single stranded oligonucleotide.
  • primers of the present invention may be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods.
  • such primers may be modified (e.g., added, deleted, substituted) using a number of means known in the art to the extent that they do not affect the specific detection of human papillomavirus, and are completely compatible with the template. It does not need to be complementary, but it should be complementary enough to hybridize with the template.
  • Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoroami Date, carbamate, etc.) or charged linkages such as phosphorothioate, phosphorodithioate and the like.
  • Nucleic acids may be selected from one or more additional covalently linked residues, such as proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), inserts (eg, acridine, proralene, etc.).
  • Chelating agents eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.
  • Nucleic acid sequences of the invention can also be modified using a label that can provide a detectable signal directly or indirectly. Examples of labels include radioisotopes, fluorescent molecules, biotin, and the like.
  • primers capable of detecting human papillomavirus may be primers that specifically amplify specific regions of HPV-1, HPV-2, HPV-3, HPV-4, HPV-27 and HPV-57. have.
  • the primers of the present invention may be a pair of forward and reverse primers having 10 to 40, preferably 20 to 30 nucleotide sequences complementary to the gene.
  • the first primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2
  • the second primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 A third primer pair consisting of a fourth primer pair consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 7 and 8, a fifth primer pair consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 9 and 10, and a sixth primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 11 and 12 It may be one or more primer pairs selected from the group consisting of pairs.
  • HPV-1 is a primer pair having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2
  • HPV-2 is a primer pair having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and 4
  • HPV-3 is a base sequence of SEQ ID NO: 5 and 6
  • HPV-4 is a primer pair having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and 8
  • HPV-27 is a primer pair having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and 10
  • HPV-57 is the base of SEQ ID NO: 11 and 12
  • the present invention provides primer pairs for amplification of specific genes such as HPV-1, 2, 3, 4, 27, and 57 for detecting subtype specific DNA sequences, and in particular, human papilloma virus of six subtypes.
  • Six PCR primer pairs can be designed and synthesized to simultaneously detect the specific DNA base sequences of the six subtypes of human papillomaviruses of different sizes.
  • the first primer pair T1-5 / T1-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 described below is specific for HPV-1.
  • the gene was designed to be detected and amplified to about 575 bp.
  • SEQ ID NO: 1 (T1-5): 5'-GTGAACCATCATTTACAATAGTGA-3 '
  • SEQ ID NO: 2 (T1-3): 5'-ACGACCAGATAAGTTTGGCAGCA-3 '
  • the second primer pair T2-5 / T2-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 described below was designed to specifically detect HPV-2, and amplified the specific gene to about 222 bp.
  • SEQ ID NO: 3 (T2-5): 5'-ATACATTTCAAGGCCTGCCTCCGCA-3 '
  • SEQ ID NO: 4 (T2-3): 5'-ACGTATGGCGAAATAATAACGACTA-3 '
  • the third primer pair T3-5 / T3-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 described below was designed to specifically detect HPV-3, and amplified the specific gene to about 348 bp.
  • SEQ ID NO: 6 (T3-3): 5'-ACAGGTGACCTGCAACTACAACCT-3 '
  • the fourth primer pair T4-5 / T4-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 described below was designed to specifically detect HPV-4, and the specific gene was amplified to about 437 bp.
  • SEQ ID NO: 7 (T4-5): 5'-TCTGGAATGTTTTATTCTGCCAGGA-3 '
  • SEQ ID NO: 8 (T4-3): 5'-ATTTTCCACCACTCCCGGTGCAAA-3 '
  • the fifth primer pair T27-5 / T27-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10 described below was designed to specifically detect HPV-27, and amplified the specific gene to about 174 bp.
  • SEQ ID NO: 9 (T27-5): 5'-TAATTGTGACATATCGCCACCAT-3 '
  • SEQ ID NO: 10 (T27-3): 5'-TAAGCCAATGAGGGTGAGAA-3 '
  • the sixth primer pair T57-5 / T57-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12 described below was designed to specifically detect HPV-57, and amplified the specific gene to about 511 bp.
  • SEQ ID NO: 12 (T57-3): 5'-GTTTATTGACACGYAGCAATACA-3 '
  • the primer pair for detecting human papillomavirus of the present invention not only has specificity for each of six types of human papillomaviruses, ie, HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57, but also amplifies specific genes at different sizes. Since it is possible to detect each of the six types of human papillomavirus, it is possible to detect the six types of human papillomavirus at the same time. Furthermore, the primer of the present invention can be effectively used for HPV infection, identification of infected HPV genotype, HPV epidemiological investigation, efficacy and risk investigation of HPV vaccine.
  • the present invention also provides a probe capable of detecting human papillomavirus.
  • the probe capable of detecting human papillomavirus preferably comprises a first primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, a second primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, SEQ ID NO: 5 And a third primer pair consisting of a nucleotide sequence of 6, a fourth primer pair consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 7 and 8, a fifth primer pair consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 9 and 10, and a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 11 and 12 It may be composed of one or more primer pairs selected from the group consisting of a sixth primer pair consisting of.
  • the first primer pair is a primer for amplifying DNA of HPV-1
  • the second primer pair is a primer for amplifying DNA of HPV-2
  • the third primer pair is for amplifying DNA of HPV-3 Primer
  • the fourth primer pair is a primer to amplify DNA of HPV-4
  • the fifth primer pair is a primer to amplify DNA of HPV-27
  • the sixth primer pair to amplify DNA of HPV-57 It is preferable that it is a primer.
  • the "probe” refers to a nucleic acid fragment corresponding to several to several hundred bases that can specifically bind to DNA or RNA, and the probe is labeled so that the specific DNA or RNA may be You can check the presence.
  • Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single-stranded DNA probes, double-stranded DNA probes, RNA probes, and the like, and may be labeled with biotin, FITC, rhodamine and DIG, or labeled with radioisotopes.
  • the present invention also provides a microarray for detecting human papillomavirus, wherein the probe or primer of the present invention is immobilized on a substrate.
  • the microarray may include DNA or RNA polynucleotides.
  • the microarray consists of conventional microarrays except that the polynucleotide of the invention is included in the polynucleotide of a probe or primer.
  • probe polynucleotide refers to a polynucleotide capable of hybridization, and refers to an oligonucleotide capable of sequence-specific binding to the complementary strand of a nucleic acid.
  • probes may include peptide nucleic acids described in Nielsen et al., Science 254, 1497-1500 (1991).
  • the process of immobilizing a probe polynucleotide associated with a human papillomavirus according to the present invention on a substrate can also be easily prepared using the prior art.
  • the hybridization of nucleic acids on microarrays and detection of hybridization results are well known in the art.
  • the detection may, for example, label a nucleic acid sample with a labeling substance capable of generating a detectable signal comprising a fluorescent substance such as Cy3 and Cy5, and then hybridize onto a microarray and from the labeling substance. By detecting the generated signal, the hybridization result can be detected.
  • the present invention also provides a method for detecting human papillomavirus using a primer or probe for detecting human papillomavirus according to the present invention.
  • a method for detecting the human papilloma virus of the present invention but not limited to, multiplex polymerase chain reaction, polymerase chain reaction, reverse transcriptase polymerase chain reaction transcriptase PCR (DNA), DNA sequencing, hybridization by microarray, restriction fragment length polymerphism (PCR-RFLP), randomly amplified polymorphic DNA (RAPD), DNA amplification fingerprinting (DAF), and AP-PCR (arbitrarily) primed PCR, sequence tagged site (STS), expressed sequence tag (EST), sequence characterized amplified regions (SCAR), inter-simple sequence repeat amplication (ISSR), amplified fragment length polymorphism (AFLP), cleaved amplified polymorphic sequence ), Single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), Northern blot, and Southern blot. All.
  • PCR-RFLP restriction fragment length polymerphism
  • RAPD randomly amplified polymorphic DNA
  • DAF DNA amplification fingerprinting
  • PCR polymerase chain reaction
  • NATs nucleic acid amplification techniques
  • the first primer pair for detecting HPV-1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2
  • a second primer pair for detecting HPV-2 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4
  • a third primer pair for detecting HPV-3 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6
  • a fourth primer pair for detecting HPV-4 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8
  • a fifth primer pair for detecting HPV-27 consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10
  • a method of specifically detecting only six subtypes of human papillomaviruses by the method of multiple polymerase chain reaction (M-PCR) using a primer according to the present invention is illustrated. That is, six subtypes of human papillomaviruses can be detected using primer pairs capable of amplifying six subtype specific DNA sequences of HPV-1, 2, 3, 4, 27, and 57.
  • M-PCR multiple polymerase chain reaction
  • the wart skin tissue is treated with proteinase K to extract DNA from the tissue, and then, as a template DNA, a polymerase chain reaction using a PCR primer mixture is performed. Perform. After the completion of the multipolymerase chain reaction, the amplified DNA was electrophoresed on a 1.5% agarose gel to confirm and determine the subtype according to the specific DNA sequence amplification yu and its size (see FIGS. 1 to 3).
  • primer pairs specific for each subtype are different. It was confirmed that it does not amplify the type of human papillomavirus DNA.
  • the detection method of the present invention can not only specifically detect each human papillomavirus subtype using one type of primer pair selected from the first to sixth primer pairs, but also all six types of primer pairs. 6 types (HPV-1, 2, 3, 4, 27, 59) of human papillomaviruses can be detected at once by carrying out the multiple polymerase chain reaction using the primer set containing .
  • the present invention can more easily and quickly identify subtypes of various warts occurring on the skin or mucous membranes, and can increase diagnostic value based on the types of warts that are most commonly encountered in practice, rather than high-risk warts, which have a very low prevalence. There is a characteristic.
  • the present invention provides a human papillomavirus detection kit comprising a primer or probe for detecting human papillomavirus according to the present invention.
  • the detection kit may comprise a primer or probe for detecting human papillomavirus according to the present invention
  • the kit may include a conventional component of the virus detection kit, the conventional components include reaction buffer, DNA polymerase, dNTP, and the like.
  • Human papillomavirus detection kit is six pairs of primer pairs having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1-12 according to the present invention (T1-5 / T1-3; T2-5 / T2-3 T3-5 / T3-3, T4-5 / T4-3, T27-5 / T27-3, T57-5 / T57-3), and buffer buffers and Taq DNA polymerase.
  • the present inventors prepared a kit for detection by making a multipolymerase chain reaction mixture containing the six pairs of PCR primers (SEQ ID NOs (1-12) synthesized in Example 1.
  • the detection kit is a 10X reaction buffer, It consists of a multiplex primer mixture (SEQ ID NOs: 1-12) and Taq DNA polymerase (5U / ⁇ l).
  • the present inventors carried out the multiple polymerase chain reaction with six subtypes of standard HPV DNA and primer pairs for amplification of each subtype.
  • the wart skin tissue was collected, treated with proteinase K, and DNA was extracted from the tissue. Then, the polymerase chain reaction was performed using the PCR primer mixture as the template DNA. After the completion of the multipolymerase chain reaction, the amplified DNA was electrophoresed on 1.5% agarose gel to confirm and determine the subtype according to the presence and size of specific DNA sequences, and the results are shown in FIG. 1.
  • the first primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 amplifies the DNA of HPV-1
  • the second primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 amplifies the DNA of HPV-2
  • the third primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 amplifies the DNA of HPV-3
  • the fourth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 amplifies the DNA of HPV-4
  • the fifth primer pair consisting of the nucleotide sequences of Nos. 9 and 10 amplified the DNA of HPV-27
  • the sixth primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12 amplified the DNA of HPV-57.
  • each primer pair designed in the present invention can specifically amplify each type of human papillomavirus through Example 3, and further, by using each primer pair as one primer set, We investigated whether six subtypes of human papillomaviruses can be detected at one time. To this end, a standard HPV DNA mixture was used as a template, and a multipolymerase chain reaction was performed using a primer set in which 6 pairs of primers were mixed. Experimental method was carried out in the same manner as in Example 3, the experimental results are shown in FIG.
  • each primer pair amplified DNA of a different type of human papillomavirus.
  • the primer pairs specifically amplified human papillomavirus, which can be amplified. Therefore, the above results show that when the inventors use the primer set of the present invention including six pairs of primer pairs, It was found that the papillomavirus can be easily and accurately amplified.
  • the present inventors performed a multiplex polymerase chain reaction with a primer set containing 6 pairs of primers, using the standard human papillomavirus subtype DNA of each of the six subtypes as a single template.
  • the experimental method was performed in the same manner as in Example 3, and the results are shown in FIG.
  • the polymerase chain reaction was performed with the multipolymerase chain reaction mixture prepared in Example 2 to amplify specific DNA sequences of subtypes of human papillomavirus. After amplified DNA was electrophoresed on agarose gel, the presence and subtype of human papillomaviruses were determined according to the presence or absence of specific DNA amplification and the size of the amplified DNA.
  • the DNA products amplified by multiple polymerase chain reaction using primer pairs according to the present invention for each wart tissue sample were 437 bp, 575 bp, 222 bp, 174 bp, 511 bp and 222 bp, respectively. Therefore, the size of the amplified product was found to be 437bp HPV-4, 575bp HPV-1, 222bp HPV-2, 174bp HPV-27, 511bp HPV-57 and 222bp HPV-27.
  • the primers of the present invention described in Table 1 are primers capable of specifically amplifying HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57, and using the primers of the present invention. Genetic amplification methods such as PCR were able to quickly and accurately determine the presence and type of major human papillomaviruses that cause skin mucosal warts.
  • the present invention can more easily determine the subtypes of skin mucosa warts, whether or not self-inoculation of various warts, identifying infection paths, identifying recurrences, confirming reinfection, investigating the prevalence according to subtypes, and various wart epidemiological studies. Can be.
  • the present invention as well as the research base composition for the alienated study, it is possible to more easily and easily diagnose precisely the differences in the clinical features and the mechanism of occurrence according to the subtypes of the warts, the resistance of treatment, and the study of various prognostic factors. have.
  • sequence listing describes 12 base sequences, which form a primer pair included in a primer or probe for detecting human papilloma virus.

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Abstract

본 발명은 인체유두종바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 인체유두종바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 마이크로어레이, 인체유두종바이러스 검출용 키트 및 상기 프라이머 또는 프로브를 이용한 인체유두종바이러스 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법은 피부점막 사마귀의 원인이 되는 인체유두종바이러스인 HPV-1, 2, 3, 4, 27 및 57의 존재 유무 및 타입을 특이적으로 신속하고 정확하게 파악할 수 있는 매우 유용한 효과가 있다.

Description

인체유두종바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법
본 발명은 인체유두종바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
인체유두종바이러스(Human Papilloma virus, HPV)는 파포바바이러스과(Papovaviridae family)에 속하는 환상 이중 나선상 DNA 바이러스로, 사람뿐만 아니라 포유동물의 우상피세포에 감염되어 사마귀와 같은 여러 가지 악성종양을 일으키는 증상과 밀접한 관계가 있으며, 자궁경부암의 중요 원인인자로 알려져 있다.
현재까지 알려진 100여 종의 HPV 중 40여종이 생식 기관에서 발견되고, 이 중 고위험군인 HPV-16 및 -18은 다른 HPV 유형보다 위험 진행이 약 40%정도 빠르게 진행되는 것이 확인되었으며, 전체 자궁경부암에서 발견되는 HPV의 약 70%를 차지할 정도로 중요하다. 이 외에도 HPV-26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 69, 70, 73 등이 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높아 "고위험군(high risk group)" 으로 분류되고, HPV-1, 2, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 72, 81 등은 "저위험군(low risk group)" 으로 분류되고 있다.
한편, 전체 점막피부 HPV 감염에서 가장 흔한 감염 원인은 자궁경부암과 관련된 고위험군 HPV가 아닌 저위험군 HPV(HPV-1, 2, 3, 4)로서 이들 저위험군 HPV는 일반적으로 점막과 피부에 사마귀 병변을 일으킨다.
사마귀는 HPV가 피부 또는 점막에 감염되면서 발생하는 매우 흔한 바이러스감염성 질환의 일종으로, 표피의 과다한 증식이 일어나 표면이 오돌도돌한 구진으로 나타난다. 어느 부위의 피부에나 발생할 수 있으나 노출 부위인 손, 발, 다리, 얼굴 등에 주로 발생하고, 성 접촉을 통해 성기에도 발생할 수 있다.
일반적으로 사마귀는 임상유형에 따라 보통사마귀, 편평사마귀, 손발바닥사마귀, 성기사마귀로 구분한다. 이들 중 성기사마귀는 자궁경부암과 관련되어 있어 이에 대한 연구가 비교적 활발히 수행되어 최근에는 이를 예방할 수 있는 백신이 상용화되었다. 그러나 일반 사마귀와 같은 흔한 피부질환은 직접적인 사망과 연관되지 않기 때문에 그동안 의사나 과학자들로 소외되어 왔으며 따라서 이에 관한 기초 연구가 거의 전무한 실정이다.
HPV 감염의 진단방법은 크게 세포학적 방법과 분자생물학적 방법으로 구분된다. HPV 감염세포의 형태변화를 판별하는 세포학적 방법으로는 세포진 검사(Papanicolaou(Pap) Smear)가 있으나, 진단의 객관성이 낮을 뿐 아니라 높은 위 음성율(15∼45%) 때문에 일관된 정확성을 갖지 못하는 문제점이 있다.
한편, 분자생물학적 방법은 바이러스의 DNA를 이용하여 HPV의 존재 및 유전자형을 검사하는 것으로, 크게 HPV DNA를 직접 동정하는 방법과 PCR에 의해 증폭하여 수행하는 방법으로 나뉜다. 이러한 방법은 HPV DNA를 객관적으로 검출하여 진단의 정확성을 꾀할 수 있어 세포학적 방법으로 진단이 불명확한 경우에 조기에 질병을 진단할 수 있다는 이점이 있다.
HPV DNA의 직접적인 확인을 위해서 종래에는 HPV 유형별 특이적인 프로브를 이용하는 서던 블로팅(southern blotting), 도트 블로팅(dot blotting) 및 FISH(Filter in situ hybridization)과 같은 방법이 사용되고 있으며, FDA로부터 승인받은 하이브리드 캡쳐 Ⅱ(Hybrid capture Ⅱ)방법이 널리 활용되고 있으나, 많은 양의 HPV DNA를 필요로 하기 때문에 HPV 초기 감염 또는 시료 채취가 미흡할 경우 검출 한계를 나타내고 RNA 프로브를 사용하므로 안전성이 낮을 뿐 아니라, 장비가 비교적 고가이고 민감도가 떨어지는 문제점이 있다.
반면, PCR 기법은 목적 병원체의 핵산 염기 서열에 특이적으로 결합하는 상보적 올리고뉴클레오티드(프라이머)를 이용하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로서, 다양한 유형의 HPV 감염 여부를 진단하는데 사용되는 대표적인 기술 중 하나이다. 이런 PCR 기법은 객관적인 대규모 검사가 가능하며, 상기한 세포학적 방법 및 HPV DNA 직접 검사법에 비해 정확성, 용이성 및 비용적인 측면에서 상대적 우위를 가지고 있는 것으로 평가받고 있다.
현재까지 PCR에 의한 HPV 검출법에서 사용되는 프라이머는 HPV 유형에 관계없이 그 DNA를 증폭시키는 공통 프라이머 또는 각각의 유형에 특이적으로 결합하여 유형 특이적인 HPV DNA만을 선택적으로 증폭시키는 유형 특이적 프라이머들이 개발되었다.
그러나 이러한 종래기술들은 지금까지 밝혀진 다양한 HPV 유형과 비교할 때, 극히 제한된 유형의 HPV만을 진단할 수 있으며, HPV 유형에 따른 검출의 민감도도 크게 떨어지는 등의 문제점을 가지고 있어, 실제 임상적으로 활용하는데 큰 제약이 있다. 특히, 공통 프라이머를 사용한 PCR 반응에 의해 증폭 산물을 얻더라도 새롭게 동정, 분류된 HPV 유형이 고위험군인지 저위험군인지 정확히 확인하기 어려우며, 유형 특이적 프라이머를 사용하는 경우에는 샘플 내에 HPV 존재를 확인하기 위해서 각각 다른 프라이머를 동시에 사용해야 하는 번거로움이 있어 임상적으로 폭넓게 활용하는데는 한계가 있다.
그러므로 PCR을 이용한 HPV DNA 증폭 여부에 따른 질병 진단의 실용적 효율성을 높이기 위해서는 HPV 유형을 선택적으로 포괄 증폭시킴으로써, HPV의 감염여부를 조기에 진단하고, HPV에 의해 야기되는 질병을 한 번에 간단히 진단할 수 있는 프라이머의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 점막피부 사마귀의 발생 원인인 6가지 아형의 인체유두종바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 신규한 PCR 프라이머쌍을 발견하였으며, 이를 이용하여 인체유두종바이러스를 타입별로 특이하고 신속하게 검출할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 인체유두종바이러스를 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 및 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브가 기질 상에 집적되는 것을 특징으로 하는 인체유두종바이러스 검출용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 이용한 인체유두종바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1프라이머 쌍은 HPV-1의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제2프라이머 쌍은 HPV-2의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제3프라이머 쌍은 HPV-3의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제4프라이머 쌍은 HPV-4의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제5프라이머 쌍은 HPV-27의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제6프라이머 쌍은 HPV-57의 DNA를 증폭하는 프라이머인 것을 특징으로 하는 인체유두종바이러스 검출용 프라이머일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 또는 프로브가 기질 상에 고정된 인체유두종바이러스 검출용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인체유두종바이러스 검출용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 인체유두종바이러스를 탐지하는 단계를 포함하는 인체유두종바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인체유두종바이러스는 HPV-1, 2, 3, 4, 27 및 57으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법은 피부점막 사마귀의 원인이 되는 6가지 아형(HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57)의 인체유두종바이러스의 존재 유무 및 타입을 신속하고 정확하게 파악할 수 있는 효과가 있고, 사마귀에 감염된 인체유두종바이러스 검출에 드는 시간과 경비를 절감하여 진단을 효과적으로 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 6가지 아형의 스탠다드 HPV DNA를 가지고 각 아형의 증폭용 프라이머 쌍으로 다중중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸 사진이다. 여기서, 레인 M은 사이즈 마커(size marker)를 나타내며, 레인 1은 HPV-1, 레인 2는 HPV-2, 레인 3은 HPV-3, 레인 4는 HPV-4, 레인 5는 HPV-27, 레인 6은 HPV-57을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 6가지 아형의 스탠다드 HPV DNA를 혼합한 것을 주형으로 하여 6가지 프라이머가 섞인 프라이머 세트로 다중중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸 사진이다. 여기서, 레인 M은 사이즈 마커(size marker)를 나타내며, 레인 1은 HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 혼합액을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 6가지 프라이머가 섞인 프라이머 세트로 각각의 스탠다드 HPV 아형 DNA를 단일 주형으로 하여 다중중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸 사진이다. 여기서, 레인 M은 사이즈 마커(size marker)를 나타내며, 레인 1은 HPV-1, 레인 2는 HPV-2, 레인 3은 HPV-3, 레인 4는 HPV-4, 레인 5는 HPV-27, 레인 6은 HPV-57을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 반응이 끝난 PCR 산물을 1.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 전개하여 HPV의 존재 및 아형을 DNA 크기로 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 여기서, 레인 M은 100bp래더의 사이즈 마커(size marker)를 나타낸다.
본 발명자들은 피부점막 사마귀의 원인이 되는 인체유두종바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 고안하였고, 상기 프라이머 또는 프로브를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법 및 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 키트 및 마이크로어레이를 개발하였다.
그러므로 본 발명은 인체유두종바이러스 중 6가지 아형의 인체유두종바이러스를 검출할 수 있는 프라이머를 제공함에 그 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명에서 인체유두종바이러스란 피부점막 사마귀를 발생하는 원인 인자이며, 바람직하게는 HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 아형의 인체유두종바이러스이다.
본 발명에 따른 상기 인체유두종바이러스 검출용 프라이머는 인체유두종바이러스의 유전자에 상보적으로 혼성화될 수 있는 프라이머를 말하며, 바람직하게는 상기 인체유두종바이러스의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머, 프라이머 쌍 또는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 용어 “프라이머”는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' ydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 즉, 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성을 개시할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말하는 것이다.
또한, 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 이러한 프라이머는 인체유두종바이러스의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형(예를 들면: 부가, 결실, 치환)될 수 있으며, 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명에 있어서 인체유두종바이러스를 검출할 수 있는 프라이머는, HPV-1, HPV-2, HPV-3, HPV-4, HPV-27 및 HPV-57의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 상기 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 바람직하게는 20 내지 30개의 염기서열을 가지는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머로는, 보다 바람직하게, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍일 수 있다.
구체적으로, HPV-1은 서열번호 1과 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, HPV-2은 서열번호 3과 4의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, HPV-3은 서열번호 5와 6의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 그리고 HPV-4은 서열번호 7과 8의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, HPV-27은 서열번호 9와 10의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, HPV-57은 서열번호 11과 12의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 의해 각각 유전자의 특정 영역이 특이적으로 증폭될 수 있다.
본 발명에서는 HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57의 아형별 특이 DNA 염기서열을 탐지할 수 있도록 상기와 같은 특이 유전자의 증폭용 프라이머 쌍을 제공하며, 특히 6가지 아형의 인체유두종바이러스 프라이머 쌍이 모두 혼합된 프라이머 세트를 제공한다. 상기 6가지 아형의 인체유두종바이러스의 특이 DNA염기서열을 서로 크기가 다르게 동시에 탐지할 수 있도록 6가지의 PCR 프라이머쌍을 설계하고 합성할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 쌍에 있어서, 하기에 기재된 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍 T1-5/T1-3는 HPV-1을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 특이 유전자를 약 575bp로 증폭시켰다.
서열번호 1(T1-5): 5’-GTGAACCATCATTTACAATAGTGA-3'
서열번호 2(T1-3): 5’-ACGACCAGATAAGTTTGGCAGCA-3'
또한, 하기에 기재된 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍 T2-5/T2-3는 HPV-2를 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 특이 유전자를 약 222bp로 증폭시켰다.
서열번호 3(T2-5): 5’-ATACATTTCAAGGCCTGCCTCCGCA-3'
서열번호 4(T2-3): 5’-ACGTATGGCGAAATAATAACGACTA-3'
또한, 하기에 기재된 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍 T3-5/T3-3는 HPV-3을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 특이 유전자를 약 348bp로 증폭시켰다.
서열번호 5(T3-5): 5’-TACTATTTGTGCAGGCTTTCTCTGT-3'
서열번호 6(T3-3): 5’-ACAGGTGACCTGCAACTACAACCT-3'
또한, 하기에 기재된 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍 T4-5/T4-3는 HPV-4를 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 특이 유전자를 약 437bp로 증폭시켰다.
서열번호 7(T4-5): 5’-TCTGGAATGTTTTATTCTGCCAGGA-3'
서열번호 8(T4-3): 5’-ATTTTCCACCACTCCCGGTGCAAA-3'
또한, 하기에 기재된 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍 T27-5/T27-3는 HPV-27을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 특이 유전자를 약 174bp로 증폭시켰다.
서열번호 9(T27-5): 5’-TAATTGTGACATATCGCCACCAT-3'
서열번호 10(T27-3): 5’-TAAGCCAATGAGGGTGAGAA-3'
또한, 하기에 기재된 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍 T57-5/T57-3는 HPV-57을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 특이 유전자를 약 511bp로 증폭시켰다.
서열번호 11(T57-5):5’-GYAACATTTCACAGCCTGTATCAT-3'
서열번호 12(T57-3): 5’-GTTTATTGACACGYAGCAATACA-3'
따라서 본 발명의 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 쌍은 6종류의 인체유두종바이러스 즉, HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 각각에 대하여 특이성을 가지고 있을 뿐만 아니라 특이 유전자를 서로 다른 크기로 증폭시킬 수 있기 때문에 6종류의 인체유두종바이러스 각각을 탐지할 수 있으며, 상기 6종류의 인체유두종바이러스를 동시에 탐지할 수도 있다. 나아가, 본 발명의 상기 프라이머는 HPV 감염여부, 감염된 HPV 유전형의 확인, HPV 역학조사, HPV 백신의 유효성 및 위해도 조사 등에 효과적으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인체유두종바이러스를 검출할 수 있는 프로브를 제공한다.
본 발명에 따른 인체유두종바이러스를 검출할 수 있는 상기 프로브는 바람직하게 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍으로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 제1프라이머 쌍은 HPV-1의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제2프라이머 쌍은 HPV-2의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제3프라이머 쌍은 HPV-3의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제4프라이머 쌍은 HPV-4의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제5프라이머 쌍은 HPV-27의 DNA를 증폭하는 프라이머이고, 상기 제6프라이머 쌍은 HPV-57의 DNA를 증폭하는 프라이머인 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 “프로브”란 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 또한 상기 프로브에는 표지(labeling)가 되어 있어 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 바이오틴, FITC, 로다민 및 DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위원소 등으로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 프로브 또는 프라이머가 기질 상에 고정되는 것을 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 또는 프라이머의 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기질 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인체유두종바이러스와 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브를 이용하여 인체유두종바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 인체유두종바이러스를 검출할 수 있는 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 다중중합효소연쇄반응(Multiplex polymerase chain reaction), 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse transcriptase PCR), DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR-RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), 노던 블럿(Northern blot) 및 서던 블럿(Southern blot)으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 “중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)”은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 1985년 물리스(Mullis) 등에 의해 개발되었고, DNA 분자의 어느 부분이든지 그 경계 서열만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제1단계인 변성단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시키고, 제2단계인 결합단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다. 그리고, 제3단계인 합성단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 25 내지 30회 반복한다.
본 발명의 상기 인체유두종바이러스 검출방법에서 사용될 수 있는 프라이머 또는 프로브는, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 HPV-1 검출용 제1프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 HPV-2 검출용 제2프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 HPV-3 검출용 제3프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 HPV-4 검출용 제4프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 HPV-27 검출용 제5프라이머 쌍; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 HPV-57 검출용 제6프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 다중중합효소연쇄반응(M-PCR)의 방법으로 인체유두종바이러스 중 6가지 아형만을 특이적으로 검출하는 방법이 예시되어 있다. 즉, HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57의 6가지 아형별 특이 DNA 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 6가지 아형별 인체유두종바이러스를 각각 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 6쌍의 프라이머쌍을 모두 포함하는 프라이머 세트를 이용한 다중중합효소연쇄반응으로 HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 중 하나 이상의 타입을 증폭된 DNA의 크기로 구분하여 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 사마귀 피부조직을 채취하여 프로테나제 K(proteinase K)를 처리하여 조직으로부터 DNA를 추출한 후, 이를 주형 DNA로 하여 PCR 프라이머 혼합액을 이용한 다중중합효소연쇄반응을 수행한다. 다중중합효소연쇄반응이 끝나면 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 겔 상으로 전기 영동하여 특이 DNA 염기서열 증폭 유뮤와 그 크기에 따라 아형을 확인 및 판정하였다(도 1 내지 도 3 참조).
상기와 같이, HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57에 각각 특이한 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 다중중합효소연쇄반응을 수행한 결과 각각의 아형에 특이적인 프라이머쌍은 다른 타입의 인체유두종바이러스 DNA를 증폭하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 검출방법은 제1프라이머 쌍 내지 제6프라이머 쌍 중 선택된 1종류의 프라이머 쌍을 이용하여 각각의 인체유두종바이러스 아형을 특이적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 6종류의 프라이머 쌍을 모두 함유하는 프라이머 세트를 이용하여 다중중합효소연쇄반응을 수행함으로써 6가지 타입(HPV-1, 2, 3, 4, 27, 59)의 인체유두종바이러스를 한 번에 신속하게 검출할 수 있는 특징이 있다.
또한, 본 발명은 피부 또는 점막에 발생하는 각종 사마귀의 아형을 보다 쉽고 빠르게 확인할 수 있으며, 그동안 매우 낮은 유병율을 보이고 있는 고위험군 사마귀 보다는 실제로 가장 흔하게 접할 수 있는 사마귀 유형을 중심으로 진단적 가치를 높일 수 있는 특징이 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명에 따른 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 검출용 키트는 본 발명에 따른 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 키트는 바이러스 검출키트의 통상적인 구성성분을 포함할 수 있고, 상기 통상적인 구성성분으로는 반응완충액, DNA 중합효소 및 dNTP 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 인체유두종바이러스 검출용 키트는 본 발명에 따른 서열번호 1-12의 염기서열을 갖는 6쌍의 프라이머 쌍(T1-5/T1-3; T2-5/T2-3; T3-5/T3-3; T4-5/T4-3; T27-5/T27-3; T57-5/T57-3)을 함유하는 프라이머 세트, 반응완충액 및 Taq DNA 중합효소를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
6가지 아형의 특이 DNA 염기서열 증폭용 프라이머의 설계 및 합성
본 발명자들은 피부점막 사마귀를 일으키는 HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57을 서로 교차 반응이 일어나지 않고, 한 번에 탐지할 수 있도록 표 1과 같이 HPV 유전자 사이의 인터제닉 시퀀스(intergenic sequence)를 대상으로 각각 타입에 특이적인 염기서열로서 검출용 PCR 프라이머를 설계 및 합성하였다.
표 1
서열번호 프라이머 검출타입 염기서열 염기서열위치(뉴클레오티드번호)
서열번호1 T1-5 HPV 1 5’-GTGAACCATCATTTACAATAGTGA-3' L1-3'끝 사이(7101)
서열번호2 T1-3 HPV 1 5’-ACGACCAGATAAGTTTGGCAGCA-3' L1-3'끝 사이(7676)
서열번호3 T2-5 HPV 2 5’-ATACATTTCAAGGCCTGCCTCCGCA-3' E2-L2 사이(3801)
서열번호4 T2-3 HPV 2 5’-ACGTATGGCGAAATAATAACGACTA-3' E2-L2 사이(4113)
서열번호5 T3-5 HPV 3 5’-TACTATTTGTGCAGGCTTTCTCTGT-3' E2-L2 사이(3907)
서열번호6 T3-3 HPV 3 5’-ACAGGTGACCTGCAACTACAACCT-3' E2-L2 사이(4255)
서열번호7 T4-5 HPV 4 5’-TCTGGAATGTTTTATTCTGCCAGGA-3' L1-3'끝 사이(7346)
서열번호8 T4-3 HPV 4 5’-ATTTTCCACCACTCCCGGTGCAAA-3' L1-3'끝 사이(6909)
서열번호9 T27-5 HPV 27 5’-TAATTGTGACATATCGCCACCAT-3' E2-L2 사이(4091)
서열번호10 T27-3 HPV 27 5’-TAAGCCAATGAGGGTGAGAA-3' E2-L2 사이(4264)
서열번호11 T57-5 HPV 57 5’-GYAACATTTCACAGCCTGTATCAT-3' E2-L2 사이(3843)
서열번호12 T57-3 HPV 57 5’-GTTTATTGACACGYAGCAATACA-3' E2-L2 사이(4354)
<실시예 2>
인체유두종바이러스 검출용 키트 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 합성한 6쌍의 PCR 프라이머(서열번호(1-12)를 포함하는 다중중합효소연쇄반응 혼합액을 만들어 검출용 키트를 제조하였다. 여기서, 검출키트는 10X 반응완충액, 멀티플렉스 프라이머 혼합액(서열번호 1-12) 및 Taq DNA 중합효소(5U/㎕)로 구성되어 있다.
<실시예 3>
6가지 아형 각각의 프라이머 쌍을 이용한 다중중합효소연쇄반응 수행
본 발명자들은 6가지 아형의 스탠다드 HPV DNA를 가지고 각 아형의 증폭용 프라이머 쌍으로 다중중합효소연쇄반응을 수행하였다.
먼저 사마귀 피부조직을 채취하여 프로테나제 K(proteinase K)를 처리하여 조직으로부터 DNA를 추출한 후, 이를 주형 DNA로 하여 PCR 프라이머 혼합액을 이용한 다중중합효소연쇄반응을 수행하였다. 다중중합효소연쇄반응이 끝나면 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 겔 상으로 전기 영동하여 특이 DNA 염기서열 증폭 유무와 그 크기에 따라 아형을 확인 및 판정하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
그 결과, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍은 HPV-1의 DNA를 증폭하고, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍은 HPV-2의 DNA를 증폭하고, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍은 HPV-3의 DNA를 증폭하고, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍은 HPV-4의 DNA를 증폭하고, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍은 HPV-27의 DNA를 증폭하고, 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍은 HPV-57의 DNA를 증폭하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
<실시예 4>
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 다중중합효소연쇄반응으로 인체유두종바 이러스의 검출
본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 본 발명에서 고안한 각각의 프라이머 쌍이 인체유두종바이러스의 각 종류를 특이적으로 증폭할 수 있음을 확인하였고, 나아가 상기 각각의 프라이머 쌍을 하나의 프라이머 세트로 이용하여 6가지 아형의 인체유두종바이러스를 한번에 검출할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해 스탠다드 HPV DNA 혼합물을 주형으로 하고, 6가지 쌍의 프라이머가 혼합된 프라이머 세트를 이용하여 다중중합효소연쇄반응을 수행하였다. 실험방법은 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였으며, 실험결과는 도 2에 나타내었다.
그 결과, HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 각각의 아형에 특이적은 프라이머 쌍을 포함한 본 발명의 프라이머 세트를 사용할 경우, 각각의 프라이머 쌍은 다른 타입의 인체유두종바이러스의 DNA를 증폭하지 않고 상기 프라이머 쌍들이 증폭할 수 있는 인체유두종바이러스를 특이적으로 증폭하였다, 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 6쌍의 프라이머쌍을 포함하고 있는 본 발명의 프라이머 세트를 이용할 경우, 여러 종류의 인체유두종바이러스를 간편하고 정확하게 증폭할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 다중중합효소연쇄반응으로 인체유두종바 이러스의 검출
본 발명자들은 6가지 아형 각각의 스탠다드 인체유두종바이러스 아형 DNA를 단일 주형으로 하여 6쌍의 프라이머가 혼합된 프라이머 세트로 다중중합효소연쇄반응을 수행하였다. 상기 실험방법은 실시예 3과 동일하게 수행하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
그 결과, HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57 각각의 아형에 특이적인 본 발명의 프라이머 쌍은 다른 타입의 인체유두종바이러스 DNA를 증폭하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
다중중합효소연쇄반응을 이용한 보통사마귀 조직으로부터 인체유두종바이러 스의 탐지
사마귀 조직으로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 상기 실시예 2에서 제조한 다중중합효소연쇄반응 혼합액으로 중합효소연쇄반응을 일으켜 인체유두종바이러스의 아형별 특이 DNA 염기서열을 증폭하였다. 증폭된 DNA를 아가로스 젤 상에서 전기영동한 후, 특이 DNA의 증폭 유무와 증폭된 DNA의 크기에 따라 인체유두종바이러스의 존재 및 아형을 판정하였다.
<6-1> 사마귀 조직으로부터 DNA 분리
각각의 다른 사마귀로 판정된 조직 6개를 채취하여 1.5㎖ 원심분리용 튜브에 넣고 여기에 세포분해완충용액 400㎕를 가한 다음 37℃에서 16-18시간 처리하였다. 조직이 모두 파괴된 것을 확인한 후 95℃에서 10분간 가열하여 프로테나제 K(proteinase K)의 활성을 없애고 여기에 같은 부피의 페놀을 첨가하고 원심분리 하였다. 상등액을 다른 원심분리용 튜브로 옮기고 여기에 두 배의 에탄올을 첨가하고 -20℃에 2시간 보관하였다. 이것을 15분간 원심분리하고 상등액을 버린 다음 DNA 침전에 50㎕의 증류수를 넣고 DNA를 녹여 DNA를 분리하였다.
<6-2> PCR 반응액의 제조
각각의 사마귀조직 DNA 2㎕에 10X 반응완충액 5㎕, 2.5 mM dNTP 4㎕, 멀티플렉스 프라이머 혼합액, 즉, 본 발명의 6쌍의 프라이머가 혼합된 프라이머 혼합액 12㎕, Taq DNA 중합효소(5U/㎕) 0.5㎕를 첨가한 후, 멸균증류수로 전체 반응액 부피가 50㎕가 되도록 하여 PCR 반응액을 제조하였다.
<6-3> 다중중합효소연쇄반응의 수행
상기 <6-2>에서 제조된 PCR 반응액을 가지고 다중중합효소연쇄반응을 수행하였다. 다중중합효소연쇄반응의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 1분30초간 수행한 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation)시키고, 55℃에서 30초간 결합(annealing)시킨 후, 72℃에서 30초간 연장(extension)시키는 과정을 총 30회 반복 실시하였다.
<6-4> 인체유두종바이러스 유무 및 아형 판정
상기 <6-3>에서 반응이 끝난 PCR 반응 산물을 1.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 전개하여 HPV의 존재 및 아형을 DNA 크기로 확인하였고, 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 각각의 사마귀 조직샘플에 대하여 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용한 다중중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 DNA 산물이 각각 437bp, 575bp, 222bp, 174bp, 511bp 및 222bp의 크기인 것을 확인할 수 있었다. 따라서 증폭된 산물의 크기를 통해 437bp는 HPV-4 , 575bp는 HPV-1, 222bp는 HPV-2, 174bp는 HPV-27, 511bp는 HPV-57 및 222bp는 HPV-27인 것을 알 수 있었다.
따라서 상기 결과를 통해, 표 1에 기재된 본 발명의 프라이머들은 HPV-1, 2, 3, 4, 27, 57을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머인 것을 알 수 있었고, 본 발명의 프라이머들을 이용하여 PCR과 같은 유전자 증폭방법을 통해 피부점막 사마귀의 원인이 되는 주요 인체유두종바이러스의 존재 유무 및 타입을 신속하고 정확하게 판정할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 피부점막 사마귀의 아형을 보다 쉽게 판별할 수 있으며, 각종 사마귀의 자가접종여부, 감염경로파악, 재발의 확인, 재감염의 확인, 아형에 따른 유병률 조사, 각종 사마귀 역학조사 등에 널리 활용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 소외된 학문에 대한 연구기반조성은 물론, 사마귀의 아형에 따른 임상양상의 차이와 발생기전, 치료의 저항성 유무, 각종 예후인자에 대한 연구 등을 보다 쉽고 간편하면서도 정확하게 진단할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열목록은 12개의 염기서열을 기재하고 있으며, 이들 염기서열은 인체유두종 바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브에 포함되는 프라이머 쌍을 구성한다.

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 쌍;
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 쌍;
    서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 쌍;
    서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 제5프라이머 쌍; 및
    서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 제6프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1프라이머 쌍은 HPV-1의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제2프라이머 쌍은 HPV-2의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제3프라이머 쌍은 HPV-3의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제4프라이머 쌍은 HPV-4의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제5프라이머 쌍은 HPV-27의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제6프라이머 쌍은 HPV-57의 DNA를 증폭하는 프라이머인 것을 특징으로 하는 인체유두종바이러스 검출용 프라이머 또는 프로브.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 또는 프로브가 기질 상에 고정된 인체유두종바이러스 검출용 마이크로어레이.
  4. 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인체유두종바이러스 검출용 키트.
  5. 제1항에 따른 인체유두종바이러스 검출용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)으로 인체유두종바이러스를 탐지하는 단계를 포함하는 인체유두종바이러스의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인체유두종바이러스는 HPV-1, 2, 3, 4, 27 및 57으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인체유두종바이러스의 검출방법.
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