WO2021201601A1 - Rt-lamp를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 sars-cov-2의 검출용 pna 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 - Google Patents

Rt-lamp를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 sars-cov-2의 검출용 pna 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 Download PDF

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gene
primer set
primers
coronavirus infection
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이시석
김한결
이한우
박희경
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주식회사 시선바이오머티리얼스
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting SARS-CoV-2 causing coronavirus infection-19 using RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification), and more particularly, SARS-CoV-2 using RT-LAMP It relates to a PNA probe and primer for the detection of , and a method for determining whether or not infection is present using the same.
  • RT-LAMP Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • Coronavirus is an enveloped, single-stranded, positive RNA virus with a genome size of 25-32 kb, which belongs to a relatively large virus among RNA viruses known so far. It has a specific structure in the shape of a flame or a crown because the spike protein, which is a club-shaped projection, is embedded in the outer skin, and the name of the virus is derived from Corona, which means crown in Latin.
  • coronaviruses found in various birds and animals such as bats, birds, cats, dogs, cattle, pigs, and mice have been divided into four groups (Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- corona virus).
  • coronavirus groups mainly infect mammals, while the gamma and delta coronavirus groups can be found in birds.
  • Coronaviruses are known to cause a variety of diseases in animals, such as gastrointestinal and respiratory diseases.
  • Human coronaviruses that infect humans are HCoV-229E and HCoV-OC43 discovered in the 1960s, and HCoV-NL63 (2004) and HCoV-HKU1 (2005) discovered after the SARS pandemic, which are generally not associated with upper respiratory tract infections. It is known that it can lead to serious lung disease in immunodeficiency patients.
  • SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome
  • HCS-EMC Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus
  • Coronavirus Infectious Disease-19 is a viral respiratory disease that occurred in Wuhan, China in December 2019. It is also called 'Wuhan pneumonia', 'coronavirus infection', 'corona 19'. It is an epidemic disease caused by the novel coronavirus, which is transmitted through the respiratory tract and shows strong contagious characteristics in the early stages of infection with few symptoms. After infection, symptoms such as sore throat, high fever, cough, and shortness of breath develop into pneumonia. After it spread worldwide in March 2020, the World Health Organization declared the disease a pandemic.
  • Coronavirus Infectious Disease-19 (Covid-19) is mainly transmitted by respiratory tract. When infected, the virus invades the lungs, causing symptoms such as high fever, coughing, and shortness of breath, and after showing symptoms similar to pneumonia, in severe cases, the alveoli are damaged, leading to death from respiratory failure.
  • the incubation period is 3-7 days, but can last up to 14 days. On January 30, 2020, China announced that there were cases where the incubation period was extended to 23 days. It has been reported that COVID-19 is transmitted even during the incubation period when symptoms do not appear.
  • the isolation and management of patients by early detection is very important because the virus spreads rapidly to adjacent areas due to its contagious nature and strong contagiousness even during the asymptomatic incubation period of COVID-19.
  • SARS-CoV-2 which currently causes COVID-19, is basically diagnosed by 'conventional PCR' and sequencing.
  • the pan-coronavirus test method first tests for the presence of all coronaviruses, including the novel coronavirus, and if it is negative, it means that it is not a coronavirus infection. If it is positive, whether it is another coronavirus that causes a cold or a novel coronavirus is determined through gene sequencing. Therefore, it takes 1 to 2 days to diagnose.
  • the LAMP method (short for Loop-Mediated Isothermal Amplification) is a gene amplification method developed by Aiken Chemical (Notomi T et al., Nucleic Acids Res >> 28 (12): E63, US6410278). This is a method of amplifying a target gene using chain substitution reaction using 4 primers that are combined by selecting 6 regions from the target gene.
  • the primer to be used is designed to have a loop structure at the primer binding site of the first amplification product. Since the loop portion is a single strand, the following primers can be annealed.
  • the LAMP method does not need to denaturate the sample nucleic acid from one strand to two strands, and the reaction proceeds at a temperature of 60 to 65 ° C. It does not require equipment such as a thermal cycler.
  • the amplification rate is fast and the specificity is high (it is difficult to amplify anything other than the target nucleic acid), so it can be confirmed whether the template (target) is amplified just by checking the cloudy (white cloudy) of the reaction solution.
  • the PNA (Peptide Nucleic Acid, Peptide Nucleic Acid) probe has improved sensitivity and specificity by using the feature that it can bind to the target DNA faster and stronger than the DNA probe because it has better recognition and binding ability for target DNA than DNA.
  • the present inventors made intensive efforts to develop a method for diagnosing SARS-CoV-2, which causes coronavirus infection-19, at isothermal temperature while having higher sensitivity and specificity than conventional RT-PCR.
  • a PNA probe When detecting the target nucleic acid of SARS-CoV-2 by the RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, it is more convenient and faster than the conventional PCR method or RT-PCR method to detect the target nucleic acid. It was confirmed, and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for conveniently and rapidly detecting SARS-CoV-2, which causes COVID-19.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing coronavirus infection-19.
  • the present invention provides a primer set for diagnosing coronavirus infection-19, comprising:
  • the primer set may further include a primer set for detecting the following RNaseP gene:
  • a primer set for detecting an internal control material RNaseP gene consisting of a pair of primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
  • the present invention also relates to a reporter (reporter) and a quencher (quencher) are combined, and the sequence represented by SEQ ID NO: 19 and a sequence complementary thereto, which detects the ORF1ab gene amplification product selected from the group consisting of a coronavirus infection-19 A PNA probe for diagnosis is provided.
  • the present invention also provides a PNA probe for detecting internal control material RNaseP selected from the group consisting of a reporter and a quencher bound, and a sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a sequence complementary thereto. .
  • the present invention also provides a composition for diagnosing coronavirus infection-19 comprising the primer set.
  • the present invention also provides a method for detecting SARS-CoV-2, a virus causing COVID-19, comprising the following steps;
  • the present invention also provides a primer set for diagnosing coronavirus infection-19, comprising;
  • a primer set for detecting N gene consisting of a pair of primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • the primer set may further include a primer set for detecting the following RNaseP gene:
  • a primer set for detecting an internal control material RNaseP gene consisting of a pair of primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
  • the present invention also relates to a reporter (reporter) and a quencher (quencher) are combined, and a sequence represented by SEQ ID NO: 20 and a sequence complementary thereto to detect the N gene amplification product selected from the group consisting of a coronavirus infection-19 A PNA probe for diagnosis is provided.
  • the present invention also provides a PNA probe for detecting internal control material RNaseP selected from the group consisting of a reporter and a quencher bound, and a sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a sequence complementary thereto. .
  • the present invention also provides a composition for diagnosing coronavirus infection-19 comprising the primer set.
  • the present invention also provides a method for detecting SARS-CoV-2, a virus causing COVID-19, comprising the following steps;
  • the present invention also provides a method for diagnosing coronavirus infection-19, comprising the steps of;
  • FIG. 1 shows a method for preparing a standard nucleic acid of SARS-CoV-2 used in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the rapid analysis of the SARS-CoV-2 ORF1ab gene and the N gene using a PNA probe.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the LAMP reaction conditions for confirming whether or not SARS-CoV-2 infection.
  • FIG 4 shows the detection result of SARS-CoV-2 according to the method of the present invention, where A shows the SARS-CoV-2 detection result, and B shows the SARS-CoV-2 non-detection result.
  • FIG. 6 shows the results of confirming the specificity of the SARS-CoV-2 diagnostic kit through cross-reaction confirmation of the method according to the present invention.
  • FIG. 7 shows the results of verifying the utility of the PNA-based SARS-CoV-2 diagnostic kit according to the present invention using a clinical sample confirmed positive for SARS-CoV-2.
  • RT-LAMP Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • human RNaseP gene which is a primer and internal control material, that can specifically amplify the ORF1ab gene and N gene of SARS-CoV-2 virus causing coronavirus infection-19 at isothermal temperature.
  • a primer that can specifically amplify isothermal was also designed.
  • ORF1ab gene, N gene, and RNaseP gene amplified by the primers are hybridized using a PNA (Peptide Nucleic Acid, peptide nucleic acid) probe using PNA, which has superior recognition and binding ability for target DNA than DNA. was confirmed.
  • PNA Peptide Nucleic Acid, peptide nucleic acid
  • the present invention in one aspect, relates to a primer set for diagnosing coronavirus infection-19, comprising:
  • the primer set may further include a pair of primers for detecting the ORF1ab gene of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the primer set may further include a primer set for detecting the following RNaseP gene:
  • a primer set for detecting an internal control material RNaseP gene consisting of a pair of primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
  • the primer set may further include a pair of primers for detecting the RNaseP gene of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • the primer set may further include a primer set for detecting the following N gene:
  • the primer sets are primers for analysis using the LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, preferably RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) for analysis using the method.
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • RT-LAMP Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • the present invention is a reporter (reporter) and a quencher (quencher) is combined, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 and a sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a sequence complementary thereto, selected from the group consisting of a coronavirus It relates to a PNA probe for diagnosing Infectious Disease-19.
  • the reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) and Cy5 It may be characterized in that at least one selected from the group consisting of, the quencher is at least one selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 and Dabcyl. can be done with TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 and Dabcyl.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing coronavirus infection-19 comprising a primer set.
  • composition of the present invention may further include a PNA probe for diagnosing the coronavirus infection-19 and a probe for identifying an internal control material.
  • the present invention relates to a method for detecting SARS-CoV-2, a virus causing COVID-19, comprising the following steps.
  • the present invention relates to a primer set for diagnosing coronavirus infection-19, comprising:
  • a primer set for detecting N gene consisting of a pair of primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • the primer set may further include a pair of primers for detecting the N gene of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • the primer set may further include a primer set for detecting the following RNaseP gene:
  • the primer set includes a pair of primers for detecting the RNaseP gene of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 may further include.
  • the primer set may further include a primer set for detecting ORF1ab gene:
  • (g') a pair of primers of SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6; A primer set for N gene detection consisting of.
  • the primer sets are primers for analysis using the LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, preferably RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) for analysis using the method.
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • RT-LAMP Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • the present invention relates to a composition for diagnosing coronavirus infection-19 comprising a primer set.
  • composition of the present invention may further include a PNA probe for diagnosing the coronavirus infection-19 and a probe for identifying an internal control material.
  • the present invention relates to a method for detecting SARS-CoV-2, a virus causing COVID-19, comprising the following steps.
  • the present invention relates to a method for diagnosing coronavirus infection-19 comprising the steps of;
  • PNA peptide nucleic acid
  • Peptide nucleic acid is artificially synthesized as one of the gene recognition materials such as LNA (Locked nucleic acid) or MNA (Mopholino nucleic acid), and the basic skeleton is composed of polyamide.
  • PNA has excellent affinity and selectivity, and is not degraded by existing restriction enzymes because of its high stability to nucleases. In addition, thermal/chemical properties and stability are high, so storage is easy and it is not easily decomposed.
  • PNA forms a double strand through a hybridization reaction with a natural nucleic acid of a complementary base sequence.
  • PNA/DNA duplexes are more stable than DNA/DNA duplexes, and PNA/RNA duplexes are more stable than DNA/RNA duplexes for the same length.
  • the ability of PNA to detect single nucleotide polymorphism (SNP) is superior to that of natural nucleic acids because the degree of double-strand instability due to single base mismatch is large.
  • the PNA-DNA binding force is much better than the DNA-DNA binding force, so there is a difference of about 10-15°C even for one nucleotide miss match. Using this difference in binding force, it is possible to detect single-nucleotide polymorphism (SNP) and changes in In/Del nucleotides.
  • SNP single-nucleotide polymorphism
  • specimen sample includes various samples, and preferably, a biosample is analyzed using the method of the present invention. More preferably, it may be a sample mixed with the virus species described in the present invention or a sample from an individual (eg, human, etc.) infected with the virus, and is an organism of plant, animal, human, fungus, bacterial and viral origin. A sample may be analyzed. When analyzing a sample of mammalian or human origin, the sample may be derived from a specific tissue or organ.
  • organs include bronchus, lung, nasal cavity, eye, brain, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testis, ovary, uterus, Rectal, nervous system, glandular and internal blood vessels are included.
  • a biological sample to be analyzed includes any cell, tissue, fluid from a biological source, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, which includes human, animal, human or animal consumption.
  • samples obtained from food prepared for In addition, biological samples to be analyzed include bodily fluid samples, which include saliva, sputum, runny nose, droplet, blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, eye fluid, saliva, semen, brain extract (eg, brain grinding). water), spinal fluid, appendix, spleen and tonsil tissue extracts.
  • bodily fluid samples include saliva, sputum, runny nose, droplet, blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, eye fluid, saliva, semen, brain extract (eg, brain grinding). water), spinal fluid, appendix, spleen and tonsil tissue extracts.
  • the 'target nucleic acid', 'synthetic DNA' or 'artificial oligo' of the present invention means a nucleic acid sequence to be detected or not, and a nucleic acid sequence of a 'target gene' encoding a protein having physiological and biochemical functions. It contains a specific site and is annealed or hybridized with a primer or probe under hybridization, annealing or amplification conditions.
  • Hybridization' in the present invention means that complementary single-stranded nucleic acids form double-stranded nucleic acids. Hybridization may occur when complementarity between two nucleic acid strands is perfect (perfect match) or even when some mismatched bases are present. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on hybridization conditions, and in particular may be controlled by temperature.
  • the PNA probe containing the reporter and quencher of the present invention generates a fluorescence signal after hybridization with the target nucleic acid. As the temperature rises, the PNA probe rapidly melts with the target nucleic acid at the appropriate melting temperature of the probe to quench the fluorescence signal. The presence or absence of a target nucleic acid can be detected through high-resolution melting curve analysis obtained from the fluorescence signal according to the present invention.
  • a PNA probe was prepared for specific amplification analysis of the ORF1ab gene and N gene of SARS-CoV-2 and the specific amplification analysis of the Human RNaseP gene. For melting temperature analysis, fluorescence and quencher were combined at both ends of the probe sequence ( Table 2).
  • the LAMP reaction solution for ORF1ab gene detection is 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2 ⁇ M ORF1ab gene outside forward primer (Outer forward primer, Table 1), 0.2 ⁇ M ORF1ab gene outside reverse direction Primer (Outer reverse primer, Table 1), 2 ⁇ M ORF1ab gene inside forward primer (Inner forward primer, Table 1), 2 ⁇ M ORF1ab gene inside reverse primer (Inner reverse primer, Table 1), 0.8 ⁇ M ORF1ab gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1), 0.8 ⁇ M ORF1ab gene loop reverse primer (Loop reverse primer, Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP Outer forward primer (Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP Outer reverse primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner forward primer (Inner forward primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner reverse primer (Table 1), 0.
  • the LAMP reaction solution is 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2 ⁇ M N gene outer forward primer (Outer forward primer, Table 1), 0.2 ⁇ M outside the N gene Reverse primer (Outer reverse primer, Table 1), 2 ⁇ M N gene inner forward primer (Table 1), 2 ⁇ M N gene inner reverse primer (Table 1), 0.8 ⁇ M N gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1), 0.8 ⁇ M N gene loop reverse primer (Loop reverse primer, Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP gene outer forward primer (Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP gene outer reverse primer , Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner forward primer (Inner forward primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner reverse primer (Table 1), 0.08 ⁇ M RNaseP gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1) 1), 0.08 ⁇ M RNaseP gene loop reverse primer (Loop reverse primer (Loop
  • the primers and PNAs prepared in Examples 2 and 3 were targeted for standard material 1 and standard material 2 including the SARS-CoV-2 ORF1ab gene and N gene, respectively.
  • PCR was performed on a CFX96J Real-Time system (BIO-RAD, USA) using the probe.
  • Each standard was diluted from a concentration of 1X10 5 copies to a concentration of 1X10 0 copies, and the LAMP reaction solution for ORF1ab gene detection was 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO 4 , 1.8mM dNTPs, so that the total volume of the LAMP reaction was 30 ⁇ l.
  • the LAMP reaction solution for N gene detection is 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2 ⁇ M N gene outer forward primer (Outer forward primer, Table 1), 0.2 ⁇ M N gene outside reverse direction Primer (Outer reverse primer, Table 1), 2 ⁇ M N gene inner forward primer (Table 1), 2 ⁇ M N gene inner reverse primer (Table 1), 0.8 ⁇ M N gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1), 0.8 ⁇ M N gene loop reverse primer (Loop reverse primer, Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP gene outer forward primer (Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP gene outer reverse primer (Outer reverse primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner forward primer (Inner forward primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner reverse primer (Table 1), 0.08 ⁇ M RNaseP gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1) ), 0.08 ⁇ M RNaseP gene loop reverse primer
  • the reactants SARS-CoV-2 standard material 1 and standard material 2, and 14 non-specific materials, and the internal control material, Human RNaseP, were used.
  • PCR was performed on the CFX96TM Real-Time system (BIO-RAD, USA) using the primers and PNA probes prepared in Examples 2 and 3 for standard 3 and 14 non-specific substances.
  • the LAMP reaction solution is 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2 ⁇ M ORF1ab gene outer forward primer (Table).
  • the LAMP reaction solution was 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2 ⁇ M N gene outer forward primer (Table 1), 0.2 ⁇ M N gene outer reverse primer (Table 1), 2 ⁇ M N gene inner forward primer (Table 1) , 2 ⁇ M N gene inner reverse primer (Inner reverse primer, Table 1), 0.8 ⁇ M N gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1), 0.8 ⁇ M N gene loop reverse primer (Loop reverse primer, Table 1) 10 ⁇ l Standard 2 DNA, SEQ ID NO: 2 After the addition of the fluorescent PNA probe (Table 2) of 0, fluorescence detection analysis was performed during the LAMP operation, and the LAMP reaction for RNaseP detection had a total volume of 30 ⁇ l.
  • the LAMP reaction solution was 2X reaction buffer, 9.6 mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.02 ⁇ M RNaseP gene outside forward primer (Outer forward primer, Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP gene outside reverse primer (Table 1), 0.16 ⁇ M inside RNaseP gene Forward primer (Inner forward primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner reverse primer (Table 1), 0.08 ⁇ M RNaseP gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1), 0.08 ⁇ M RNaseP gene loop reverse primer (Loop reverse primer, Table 1) After adding 10 ⁇ l standard 3 DNA and fluorescent PNA probe of SEQ ID NO: 21 (Table 2), fluorescence detection analysis was performed in the middle of LAMP, and the experiment was performed 3 times each repeated execution.
  • Example 7 Verification of a PNA-based SARS-CoV-2 diagnostic kit using clinical samples
  • RNA was extracted from the clinical tissue suspected of SARS-CoV-2 infection the primers and PNA probes prepared in Examples 2 and 3 were applied to the RNA of clinical samples 1-3 confirmed by the existing real-time PCR method. PCR was performed using a CFX96TM Real-Time system (BIO-RAD, USA).
  • the LAMP reaction solution for ORF1ab gene detection is 2X reaction buffer, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2 ⁇ M ORF1ab gene outside forward primer (Outer forward primer, Table 1), 0.2 ⁇ M ORF1ab gene outside reverse direction Primer (Outer reverse primer, Table 1), 2 ⁇ M ORF1ab gene inside forward primer (Inner forward primer, Table 1), 2 ⁇ M ORF1ab gene inside reverse primer (Inner reverse primer, Table 1), 0.8 ⁇ M ORF1ab gene loop forward primer (Loop forward primer, Table 1), 0.8 ⁇ M ORF1ab gene loop reverse primer (Loop reverse primer, Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP Outer forward primer (Table 1), 0.02 ⁇ M RNaseP Outer reverse primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner forward primer (Inner forward primer, Table 1), 0.16 ⁇ M RNaseP gene inner reverse primer (Table 1), 0.
  • the present invention it is possible to amplify and discriminate the ORF1ab gene and the N gene of SARS-CoV-2 more conveniently and quickly compared to the PCR and RT-PCR methods used for the conventional diagnosis of coronavirus infection-19, and SARS-CoV- 2 Infection can be quickly diagnosed, and at the same time, the entire process of isolating target nucleic acids from specimens can be verified through the human RNaseP gene, an internal control material.

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Abstract

본 발명은 RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 RT-LAMP를 이용한 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 PCR과 RT-PCR 방법에 비해 편리하고 신속하게 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 증폭 및 판별할 수 있어, SARS-CoV-2 감염 여부를 빠르게 진단할 수 있다.

Description

RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-COV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법
본 발명은 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 RT-LAMP를 이용한 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법에 관한 것이다.
코로나바이러스는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스이며 게놈 크기는 25-32kb로 지금까지 알려진 RNA 바이러스 중에서는 비교적 큰 바이러스에 속한다. 외피에 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 또는 왕관 모양의 특이적 구조를 가지고 있으며, 라틴어로 왕관이라는 뜻인 Corona로부터 바이러스 이름이 유래되었다. 1937년 닭에서 처음으로 발견된 후 박쥐, 새, 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐 등 다양한 조류와 동물에서 발견된 코로나바이러스는 4개의 그룹(Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- corona virus)으로 나누어진다. 알파와 베타코로나바이러스 그룹은 포유류에 주로 감염되고 감마와 델타코로나바이러스 그룹은 조류에서 찾을 수 있다. 코로나바이러스는 동물들에서 위장병 및 호흡기질환과 같은 다양한 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 사람에게 감염되는 사람 코로나바이러스는 1960대 발견된 HCoV-229E와 HCoV-OC43, 사스 대유행 이후 발견된 HCoV-NL63(2004년)과 HCoV-HKU1(2005년)로 이들은 일반적으로 상기도 감염증과 관계가 있다고 알려져 있으나 면역결핍환자들에게는 심각한 폐질환을 유도하기도 한다. 주로 겨울이나 이른 봄에 코로나바이러스에 대한 감염률이 증가된다고 보고되고 있고, 성인 감기환자 중 코로나바이러스가 원인 병원체인 비율이 상당히 높다고 알려져 있다. 2003년 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 일으키는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)가 처음 발견되었으며 세계보건기구(WHO) 보고에 따르면 2002년에서 2003년 동안 전 세계적으로 8,273명의 환자와 775명의 사망자(치사율 약 10%)가 발생하였고, 2004년까지 추가적인 환자 발생과 사망자가 보고되었다(Saif LJ., Rev. Sci. Tech., 23:643, 2004).
2012년 9월 사스와 유사한 고열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 나타내는 중중 호흡기질환 환자가 발생하였고, 이 원인 병원체는 기존의 알려진 바이러스와는 다른 신종 코로나바이러스(HCoV-EMC)로 밝혀졌다. 이 바이러스는 중동호흡기 증후군 코로나바이러스 또는 메르스 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus; MERS-CoV)로 불리며, 사람에게 감염되었을 때에 중증의 호흡기 질환을 유발하여 사망에 이르게 하며(Zaki AM et al., N Engl J Med, 367:1814, 2012), 2015년 5월 우리나라에서 발생하여 38명의 사망자를 낸 바 있다.
코로나바이러스감염증-19는 2019년 12월 중국 우한시에서 발생한 바이러스성 호흡기 질환이다. '우한 폐렴', '신종코로나바이러스감염증', '코로나19'라고도 한다. 신종 코로나바이러스에 의한 유행성 질환으로 호흡기를 통해 감염되며, 증상이 거의 없는 감염 초기에 전염성이 강한 특징을 보인다. 감염 후에는 인후통, 고열, 기침, 호흡곤란 등의 증상을 거쳐 폐렴으로 발전한다. 2020년 3월 전세계로 확산되자, 세계보건기구는 이 질환에 대해 팬데믹을 선언했다.
코로나바이러스감염증-19(Covid-19)는 주로 호흡기로 전염된다. 감염되었을 경우 바이러스는 폐를 침범하며, 고열과 기침, 호흡곤란 등의 증상이 발생하고 폐렴과 유사한 증상을 보인 끝에 심한 경우 폐포가 손상되어 호흡 부전으로 사망에 이르기도 한다. 잠복기는 3~7일이지만 최장 14일까지 이어지기도 한다. 2020년 1월 30일 중국에서는 잠복기가 23일까지 늘어난 사례가 있다고 발표했다. 코로나바이러스감염증-19는 증상이 나타나지 않는 잠복기 중에도 전염되는 사례가 있다고 보고되었다.
코로나바이러스감염증-19의 잠복기 무증상 시에도 전염되는 특성과 강한 전염성으로 인해 인접한 지역으로 신속하게 확산되기 때문에 조기 검출에 의한 환자의 격리 및 관리가 매우 중요하다.
현재 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2는 기본적으로 '판코로나바이러스 검사법(Conventional PCR)'과 염기서열 분석으로 진단한다. 판코로나바이러스 검사법은 신종코로나바이러스를 포함한 모든 코로나바이러스의 존재 유무를 우선 검사하는 것으로, 음성으로 판정되면 코로나바이러스 감염이 아님을 의미한다. 만일 양성인 경우에는 감기를 일으키는 다른 코로나바이러스인지, 신종코로나바이러스인지 유무를 유전자염기서열 분석을 통해 판단한다. 이에 따라 진단에 1~2일 정도 소요된다.
한국의 질병관리본부는 2020년 1월 31일부터는 검사속도와 편의성이 향상된 '실시간 유전자 증폭검사(Real Time RT-PCR)'를 통해 진단하고 있는데 이 검사방법으로는 6시간 이내에 결과 확인이 가능하다.
하지만 검사속도와 편의성, 민감도 및 특이도가 보다 향상된 효과적인 검출이 가능한 검출 가능한 방법이 필요하다.
한편, LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification의 줄임말)은 에이켄화학이 개발한 유전자 증폭법이다(Notomi T et al.,Nucleic Acids Res》 28 (12): E63, US6410278). 표적유전자에서 6개의 영역을 선택하여 조합한 4개의 프라이머를 사용하여 표적 유전자를 사슬치환반응을 이용해 증폭시키는 방법이다. 사용되는 프라이머를 처음의 증폭산물의 프라이머 결합부위에 루프 구조를 생기게 디자인한다. 루프부분은 한가닥이므로, 다음의 프라이머가 결합(Annealing)가능하다. 사슬치환활성이 높은 특수한 DNA 합성효소를 사용하여, 진행방향에 있는 두 가닥 DNA를 해리시키면서, 스스로의 신장반응을 진행해간다. 최종적으로 원래의 표적서열의 약 정수배의 길이의 증폭산물이 65℃ 1시간정도의 반응에서 축적된다. 따라서 반응산물을 전기영동하면 사다리 모양의 결과를 얻을 수 있다. LAMP법은 기존의 PCR법과 비교하여, 검체 핵산을 한 가닥에서 두 가닥으로 변성시킬 필요가 없어, 60~65℃의 온도에서 반응이 진행하는 특징이 있고, 서멀사이클러와 같은 기기가 필요 없다. 또한, 증폭속도가 빠르고, 특이성도 높아(표적 핵산 이외의 것이 증폭되기 어려움), 반응액의 백탁(뽀얗게 흐려짐)을 확인하는 것만으로도 템플릿(표적)이 증폭되었는지 확인할 수 있다.
또한, PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어나 DNA 프로브보다 빠르고 강하게 타겟 DNA와 결합할 수 있는 특징을 사용하여 민감도와 특이도를 개선하였다.
이에, 본 발명자들은 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 기존의 RT-PCR보다 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 등온에서 진단하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PNA 프로브를 사용하여, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)법으로 SARS-CoV-2의 표적 핵산을 검출하는 경우, 기존의 PCR 방법이나 RT-PCR 방법보다 편리하고, 신속하게 표적 핵산을 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 편리하고, 신속하게 진단하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 편리하고, 신속하게 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스감염증-19의 진단방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다:
(a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍 또는; 및
(b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c) 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(d) 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 19로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 ORF1ab 유전자 증폭산물을 검출하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다;
(a') 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c') 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(d') 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 N 유전자 증폭산물을 검출하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 SARS-CoV-2 감염을 판정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19의 진단방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 코로나바이러스감염증-19을 진단하는 단계.
도 1은 본 발명에서 사용한 SARS-CoV-2의 표준핵산 제작방법을 나타낸 것이다.
도 2는 PNA 프로브를 사용하여 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 신속하게 분석하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 3은 SARS-CoV-2 감염여부를 확인하기 위한 LAMP 반응조건을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따른 SARS-CoV-2의 검출 결과를 나타낸 것으로, A는 SARS-CoV-2 검출 결과를 나타낸 것이고, B는 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 SARS-CoV-2의 최소검출한계를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 방법의 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 SARS-CoV-2 양성이 확인된 임상샘플을 사용하여 본 발명에 따른 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 활용성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 기존의 RT-PCR 보다 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 등온에서 진단하는 방법으로, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)법을 사용하였으며, 코로나바이러스감염증-19를 일으키는 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF1ab 유전자(ORF1ab gene)과 N 유전자(N gene)을 등온에서 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 내부 대조물질인 Human RNaseP 유전자를 등온에서 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머도 디자인하였다. 아울러 상기 프라이머에 의해 증폭된 ORF1ab 유전자와, N유전자, RNaseP 유전자는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어난 PNA를 사용한 PNA(Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 혼성화하여 증폭산물을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트에 관한 것이다:
(a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c) 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 N 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(e) 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍;
(f) 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍; 및
(g) 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트들은 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용 프라이머이며, 바람직하게는 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 상기 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브와 내부대조 물질을 확인하기 위한 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것이다.
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화 시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트에 관한 것이다:
(a') 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 11 및 서열번호 12의 N 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c') 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 ORF1ab 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(e') 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
(f') 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
(g') 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트들은 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용 프라이머이며, 바람직하게는 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 상기 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브와 내부대조 물질을 확인하기 위한 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것이다.
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화 시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 SARS-CoV-2 감염을 판정하는 단계.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19의 진단방법에 관한 것이다;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 코로나바이러스감염증-19을 진단하는 단계.
본 발명에 있어서, "펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)"은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.
펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기서열의 천연핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다.
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 사람 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 기관의 대표적인 예로는, 기관지, 폐, 비강, 눈, 뇌, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 타액, 가래, 콧물, 비말, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 유무를 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 표적 핵산 준비
SARS-CoV-2의 진단을 위하여 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자 300bp(서열번호 22)와 N 유전자 300bp(서열번호 23)를 합성하고, 내부대조물질인 RNaseP의 증폭확인을 위하여 Human의 RNaseP 유전자 400bp(서열번호 24)을 합성하여 각각 pUC57 벡터에 클로닝 후 표준물질로 사용하여 확인하였다(도 1).
실시예 2: SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, N 유전자 및 Human RNaseP 유전자 증폭을 위한 프라이머 제작
SARS-CoV-2의 표적물질에 대한 LAMP 반응 (Loop-mediated isothermal amplification)을 위해 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, ORF1ab 유전자를 증폭하는 서열번호 1~6의 프라이머와, N 유전자를 증폭하는 서열번호 7~ 12의 프라이머를 제작하였으며, 내부대조 물질에 대한 LAMP반응을 위해 Human RNaseP 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 13~18의 프라이머를 제작하였다. (표 1).
Figure PCTKR2021004009-appb-T000001
Figure PCTKR2021004009-appb-I000001
실시예 3: 형광 PNA 프로브 제작
SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자와 N 유전자의 특이적 증폭분석과 Human RNaseP 유전자의 특이적 증폭분석을 위하여 PNA 프로브를 제작하였으며, 융해온도 분석을 위해 프로브 서열 양 끝에 각각 형광과 소광자를 결합시켰다(표 2).
Figure PCTKR2021004009-appb-T000002
실시예 4: 표준물질을 이용한 SARS-CoV-2 검출 키트의 검증
실시예 1에서 합성된 SARS-CoV-2의 표적핵산과 RNaseP의 표적핵산을 실시예 2와 실시예 3에서 합성된 프라이머 및 PNA 프로브와 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)를 이용하여 LAMP 반응을 수행하여 형광을 측정하였다.
ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 1 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 19의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다.
N 유전자 검출을 위한, LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 2 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 20의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정은 도 2에 나타내었으며, 도 3의 조건으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 SARS-CoV-2 표준물질이 있을 경우에만 FAM 형광이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: SARS-CoV-2 의 최소검출한계 확인
SARS-CoV-2 진단 키트의 검출한계를 확인하기 위하여 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 각각 포함한 표준물질 1 및 표준물질 2를 대상으로 실시예 2 및 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96쪠 Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
각 표준물질은 1X105 copies 농도부터 1X100 copies 농도로 희석하여 사용하였으며, LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 1 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 19의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, N 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 2 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 20의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다. 실험은 각각 3회 반복 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 검출방법을 사용할 경우, 표준물질의 10 copies까지 검출이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6: 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도 확인
SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도 확인을 위하여 표 3에서 제시된 바와 같이 반응물질인 SARS-CoV-2 표준물질 1 및 표준물질 2 와 14개의 비특이물질을, 내부대조물질 반응물질인 Human RNaseP 표준물질3 과 14개의 비특이물질을 대상으로 실시예 2와 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 10㎕ 표준물질 1 DNA, 서열번호 19의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, N 유전자 검출을 위한 LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 10㎕ 표준물질 2 DNA, 서열번호 20의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, RNaseP 검출을 위한 LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 10㎕ 표준물질 3 DNA, 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였으며, 실험은 각각 3회 반복 실행하였다.
그 결과 도 6와 같이 SARS-CoV-2는 검출이 확인된 반면, 14개의 비반응물질에서는 표적핵산의 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였으며, 내부대조물질 Human RNaseP도 마찬가지로 검출이 확인된 반면, 14개의 비반응물질에서는 표적 핵산의 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2021004009-appb-T000003
실시예 7: 임상샘플을 사용한 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 검증
SARS-CoV-2 감염이 의심되는 임상조직에서 DNA를 추출한 후 기존 real-time PCR 방식으로 확인된 임상샘플 1-3의 RNA를 대상으로 실시예 2 및 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 1 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 19의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, N 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 2 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 20의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정의 도식은 도 2에 나타내었으며, 도 3의 조건으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 기존 방법으로 SARS-CoV-2 양성으로 확인된 샘플에서, 본 발명의 RT-LAMP 방법을 사용하여서도 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자의 형광이 검출되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 PCR과 RT-PCR 방법에 비해 편리하고 신속하게 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 증폭 및 판별할 수 있어, SARS-CoV-2 감염 여부를 빠르게 진단할 수 있으며, 동시에 내부 대조물질인 Human RNaseP 유전자를 통하여 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 전과정에 대한 검증도 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (33)

  1. 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
    (a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 및
    (b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
    (c) 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
    (b) 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 6의 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 하기 N 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
    (e) 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍;
    (f) 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍; 및
    (g) 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
  5. 제2항에 있어서, 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
  6. 제1항에 있어서, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  7. 제6항에 있어서, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  8. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 19로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 ORF1ab 유전자 증폭산물을 검출하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  10. 제8항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  11. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브.
  12. 제11항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  13. 제11항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 제8항의 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 제11항의 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 N 유전자 증폭산물 검출용 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  18. 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법;
    (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
    (b) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 증폭하는 단계;
    (c) 제8항의 프로브, 제12항의 프로브 또는 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열을 가지는 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
    (d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
  19. 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
    (a') 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및
    (b') 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
  20. 제19항에 있어서, 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
    (c') 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
    (b') 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
  21. 제19항에 있어서, 서열번호 11 및 서열번호 12의 N 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
  22. 제19항에 있어서, 하기 ORF1ab 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
    (e') 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
    (f') 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
    (g') 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 세트.
  23. 제20항에 있어서, 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
  24. 제19항에 있어서, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  25. 제24항에 있어서, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  26. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  27. 제26항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  28. 제26항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
  29. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 제26항의 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 제11항의 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 제8항의 ORF1ab 유전자 증폭산물을 검출하는 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
  33. 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법;
    (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
    (b) 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 증폭하는 단계;
    (c) 제26항의 프로브, 제8항의 프로브 또는 제12항의 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화 시키는 단계; 및
    (d) 형광검출 측정을 통해 SARS-CoV-2 감염을 판정하는 단계.
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