WO2021177773A2 - Sars-cov-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 sars-cov-2의 진단방법 - Google Patents

Sars-cov-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 sars-cov-2의 진단방법 Download PDF

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    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing whether or not a novel coronavirus (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) is infected, a kit comprising the composition, and a method for diagnosing whether or not a novel coronavirus is infected using the same it's about
  • the present invention relates to a composition for diagnosing infection with a novel coronavirus, including a nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying by targeting a leader sequence most abundantly present in cells infected with the novel coronavirus , to a kit comprising the composition and a method for diagnosing whether or not a novel coronavirus is infected using the same.
  • Coronavirus is a virus composed of a single fragment of a (+) strand RNA genome of about 27-32 kb and is distributed in humans and other mammals. It is known that coronavirus produces 6-8 pieces of genome-RNA and subgenomic RNA having a common mRNA at the 3' end through replication and transcription (Imbert I et al.; A second, non-canonical RNA-dependent RNA polymerase in SARS Coronavirus. The EMBO Journal. 2006, 25:4933-4942).
  • SSP-PCR Single Specific Primer-Polymerase Chain Reaction
  • real-time PCR PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism analysis)
  • sequencing PCR-restriction fragment length polymorphism analysis
  • RT-real time PCR Reverse transcription-real time PCR
  • the test method developed by the US Centers for Disease Control and Prevention is a method of amplifying three regions of the N gene that makes the nucleocapsid protein of SARS-CoV-2.
  • the method developed by the WHO is a one-step real time PCR method that can screen and confirm at the same time.
  • -2 This is a method of amplifying the RdRP (RNA dependent RNA polymerase) gene that can specifically detect SARS-CoV-2 for confirmation of infection ( FIG. 1 ).
  • E gene and RdRP gene have low abundance in virus-infected cells, there may be cases in which detection may not be possible depending on experimental errors or RNA safety of the sample.
  • the US Centers for Disease Control and Prevention and WHO used the human RNase P gene as an internal control gene for determining the suitability of an RNA sample, and disclosed primer and probe sequences for amplifying RNase P cDNA.
  • the disclosed primer and probe sequences are primers that target the inside of the first exon without considering RNA splicing, and that false-positive amplification may occur when applied to genomic DNA. Since genomic DNA is often not completely removed when RNA is extracted from a sample at the test site, an error may occur in the determination of sample suitability.
  • the inventors of the present application developed a new detection method targeting the leader sequence most abundantly present in the initially infected cells for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection.
  • primers for the internal control RNase P gene were prepared in consideration of RNA splicing so that false-positive amplification derived from genomic DNA does not occur.
  • the present invention includes a nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying a coronavirus (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) leader comprising the sequence of SEQ ID NO: 10. It relates to a composition for diagnosis of coronavirus.
  • SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • the present invention also relates to a kit for diagnosing coronavirus comprising the composition.
  • the present invention further provides a step of treating the sample with a nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying a coronavirus (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) leader comprising the sequence of SEQ ID NO: 10. It relates to a method of providing information for a diagnosis of coronavirus, including.
  • SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • 1 shows a gene for diagnosing the novel coronavirus according to the WHO recommendation.
  • Figure 2 shows the mechanism by which coronavirus sub-genomic RNA (sub-genomic RNA) is expressed.
  • FIG. 3 shows the results of detecting the SARS-CoV-2 leader RNA sequence by performing RT-qPCR according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows the results of amplifying a leader sequence from SARS-CoV-2 RNA by performing RT-qPCR according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a shows the structure of the RNase P gene and the site to be amplified by the nucleic acid oligomer of the present invention.
  • 5B shows the results of amplification of the RNase P gene by performing RT-qPCR.
  • the inventors of the present application confirmed that the novel coronavirus infection can be quickly and accurately diagnosed through a new detection method targeting the leader sequence most abundant in the initially infected cells for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection. did.
  • the present invention is a coronavirus comprising a nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying a coronavirus (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) leader comprising the sequence of SEQ ID NO: 10. It relates to a diagnostic composition.
  • SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • the present invention provides a step of treating a sample with a nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying a coronavirus (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) leader comprising the sequence of SEQ ID NO: 10. It relates to a method of providing information for a diagnosis of coronavirus, including.
  • SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • leader sequence genomic RNA and transcriptionally expressed subgenomic mRNA in coronavirus have a leader sequence composed of about 72 to 77 bp at the 5' end in common, which is a unique feature of coronavirus.
  • viral sequences it is the most abundant target in infected cells. This is a leader joining phenomenon in which a leader RNA corresponding to about 72 bp derived from the 5' end of the genomic RNA of all subgenomic RNAs of the coronavirus binds to the 5' end of each subgenomic RNA. because it indicates
  • the leader sequence has the highest copy number among viral genes in the cell, and the second highest copy number of the subgenomic RNA encoding the N protein. Therefore, it can be said that it is most effective to use a leader sequence as a target for detection for effective detection of coronaviruses present in low amounts in early infection with mild symptoms.
  • a nucleic acid oligomer may refer to a material including two or more nucleotides produced by polymerization of a nucleic acid as a monomer.
  • the nucleic acid oligomer may function as a primer or a probe.
  • a 'primer' as used herein refers to a single-stranded oligonucleotide capable of serving as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and a polymerase) in a suitable temperature and buffer solution.
  • suitable conditions ie, four different nucleoside triphosphates and a polymerase
  • the primers can be constructed to have "substantially" complementarity with each strand of the gene locus to be amplified. This means that the primer has sufficient complementarity to hybridize with the corresponding nucleic acid strand under the conditions for performing the polymerization reaction.
  • the nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying a coronavirus (SARS-CoV-2) leader comprising the sequence of SEQ ID NO: 10 comprises, for example, the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 It may be a primer that
  • the primers may be used simultaneously by pairing forward and reverse primers for, for example, PCR.
  • a forward primer that specifically amplifies the SARS-CoV-2 leader sequence including the sequence of SEQ ID NO: 10 it may include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the reverse primer may include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the internal control gene is an oligonucleotide for determining suitability of an RNA sample, and may not have complementarity with a target gene.
  • the human RNase P gene was used as a conventional internal control gene.
  • the primers and probe sequences for amplifying RNase P cDNA published by the CDC are primers targeting the inside of the first exon without considering RNA splicing, and it was confirmed that false-positive amplification may occur when applied to genomic DNA. Since genomic DNA is often not completely removed when RNA is extracted from a sample at the test site, an error may occur in the determination of sample suitability.
  • a nucleic acid oligomer capable of specifically amplifying RNase P comprising the sequence of SEQ ID NO: 11 may be further included.
  • the nucleic acid oligomer may be, for example, a primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9.
  • the primer according to the present invention targeted a sequence complementary to the 5' region of the second exon, and it was confirmed that false-positive amplification did not occur when applied to genomic DNA.
  • the primers may be used simultaneously by pairing forward and reverse primers for, for example, PCR.
  • a forward primer that specifically amplifies RNase P comprising the sequence of SEQ ID NO: 11 it may include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the reverse primer may include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the present invention may further comprise a probe capable of complementary hybridization to a coronavirus leader or RNase P product specifically amplified by a nucleic acid oligomer.
  • the probe refers to an oligonucleotide capable of hybridizing with an amplification product under specific conditions.
  • the conditions used to achieve a specific level of stringency vary depending on the nature of the nucleic acids to be hybridized. For example, the length of the nucleic acid site to be hybridized, the degree of homology, the nucleotide sequence composition (eg, GC/AT composition ratio), and the nucleic acid type (eg, RNA, DNA) are considered in selecting the hybridization conditions. A further consideration is whether the nucleic acid is immobilized, for example on a filter or the like.
  • Examples of very stringent conditions are as follows: 2X SSC/0.1% SDS at room temperature (hybridization conditions); 0.2X SSC/0.1% SDS at room temperature (low stringency conditions); 0.2X SSC/0.1% SDS at 42°C (conditions with moderate stringency); 0.1X SSC at 68°C (conditions with high stringency).
  • the washing process may be performed using one of these conditions, for example, a high stringency condition, or each of the above conditions may be used, in the order described above, for 10 to 15 minutes each, all or all of the conditions described above Some iterations can be done. However, as described above, the optimal conditions vary depending on the specific hybridization reaction involved, and can be determined through experiments. Generally, conditions with high stringency are used for hybridization of important probes.
  • the probe capable of hybridizing complementary to the amplified coronavirus leader may include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the probe capable of hybridizing complementary to the amplified RNase P product used as an internal control may include the sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the probe is detectably labeled, for example, a radioisotope, a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelate, or an enzyme.
  • a radioisotope for example, a radioisotope, a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelate, or an enzyme.
  • Appropriate labeling of the probe as described above is a technique well known in the art, and can be performed by a conventional method.
  • the amount of the amplification product can be detected by a fluorescence signal.
  • Amplification according to the present invention can be performed through real-time quantitative amplification using reverse transcriptase, for example, real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR), and PCR amplification in real-time polymerase chain reaction
  • the amount of product can be detected by a fluorescence signal.
  • the intensity of the fluorescence signal increases according to the increasing amount of polynucleotide, and an amplification profile curve is obtained showing the intensity of the fluorescence signal according to the number of amplification cycles.
  • the amplification profile curve includes a baseline region in which a fluorescence signal in the background that does not reflect the actual polynucleotide amount, an exponential region in which a fluorescence signal increase according to an increase in the polynucleotide product amount, and PCR When the reaction reaches saturation, it is divided into a plateau region where there is no increase in the intensity of the fluorescence signal.
  • the fluorescence signal intensity at the point at which the baseline region transitions from the baseline region to the exponential region, that is, when the amount of PCR amplification product reaches an amount detectable by fluorescence is called a threshold
  • the value corresponding to the threshold value in the amplification profile curve The number of amplification cycles is called a threshold cycle (Ct) value.
  • the methylation specific sensitivity and / or specificity can be determined.
  • the sample may include a wide range of all biological fluids obtained from body fluids, cell lines, tissue culture, etc. derived from a suspected patient or individual or individual to be diagnosed, for example, sputum in the lower respiratory tract, oropharynx in the upper respiratory tract. It may be a smear and/or a nasopharyngeal smear, a culture sample, a tissue sample, or blood, but is not limited thereto.
  • the step of extracting the nucleic acid from the sample may be further included, and the extraction of the nucleic acid may be performed using, for example, various commercially available kits or extraction reagents.
  • the present invention relates to a kit comprising the composition.
  • the kit may include a compartmentalized carrier means containing a sample, a container containing a reagent, and a container containing a nucleic acid oligomer. In some cases, it may further include a container including a probe for detecting each of the gene amplification products.
  • the carrier means is suitable for containing one or more containers, such as bottles and tubes, each container containing independent components for use in the method of the present invention.
  • containers such as bottles and tubes
  • each container containing independent components for use in the method of the present invention.
  • a person of ordinary skill in the art can readily dispense the required formulation in a container.
  • the kit according to the present invention may optionally include reagents necessary for conducting a nucleic acid amplification PCR reaction, such as a polymerase, a buffer, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
  • reagents necessary for conducting a nucleic acid amplification PCR reaction such as a polymerase, a buffer, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
  • the kit according to the present invention may further comprise various polynucleotide molecules, various buffers and reagents.
  • the optimal amount of reagents, buffers or reactants used for a specific reaction in the kit may be determined by those skilled in the art, and may be prepared as separate packages or compartments containing each of the aforementioned primers or probes. have.
  • Example 1 Design of primers and probes for SARS-CoV-2 detection and internal control gene detection
  • RNA corresponding to the leader sequence of SARS-CoV-2 DNA corresponding to 110 bp (SEQ ID NO: 13) including 72 bp (SEQ ID NO: 10) of the leader sequence in SARS-CoV-2 was synthesized (NeoProbe , Korea).
  • 180 bp DNA SEQ ID NO: 2 corresponding to the RNase P sequence was synthesized.
  • RNA was prepared by in vitro transcription by linking the T7 promoter sequence to the 5' end of each synthesized DNA.
  • MEGAScriptTM T7 Transcruption kit Invitrogen
  • RT-qPCR was performed as follows. The composition of the reaction solution is shown in the table below, and AB 7500 Fast (ThermoFisher, USA) equipment was used for the RT-qPCR reaction. In the first reverse transcription (RT) step, cDNA complementary to RNA was made, and in the second real-time PCR (qPCR) step, cDNA was amplified.
  • RT reverse transcription
  • qPCR real-time PCR
  • Leader RNA (104 copies), Leader DNA used for in vitro transcription (104 copies), human genomic DNA (10 ng) and human total RNA (10 ng) to confirm the detection of cDNA complementary to the SARS-CoV-2 leader RNA sequence ) was used to perform one-step RT-qPCR (FIG. 3). As a result, amplification was confirmed only in Leader cDNA and Leader DNA, and it was confirmed that there was no non-specific amplification in the remaining templates (Table 5).
  • RNA isolated by culturing SARS-CoV-2 isolated from Koreans at the National Pathogen Resources Bank of Korea was used.
  • One-Step RT-qPCR was performed in the same manner as above.
  • the leader RNA of SARS-CoV-2 was normally amplified (Fig. 4, Table 6).
  • RNase P gene Human RNase P gene was used as an internal control gene for determining the suitability of an RNA sample.
  • Primers and probes for amplifying RNase P RNA have sequences disclosed by the US Centers for Disease Control and Prevention, but as a result of confirmation by the inventor of the present application, primers are produced inside the first exon without considering RNA splicing, and in genomic DNA False positive amplification occurred.
  • the RNase P gene is a gene composed of a total sequence of about 36.6 kb, and is composed of a total of 11 exons.
  • the present inventors solved the problem of false-positive amplification by genomic DNA by newly preparing a reverse primer for a region complementary to the 5' region of the second exon that is about 2.8 kb away.
  • amplification of IVT-treated RNase P RNA and human total RNA it was confirmed that normal amplification occurred (Table 7).
  • the RNase P gene was used as an internal control (see IC CT values in Table 8).
  • RT-qPCR was performed by the method described in Example 3 (Table 8).
  • results can be confirmed within a short time, so that it is possible to quickly diagnose whether or not a novel coronavirus infection is present, and accurate diagnosis is possible by preventing false positives from occurring.

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Abstract

본 발명은 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신종 코로나바이러스에 감염된 세포에서 가장 풍부하게 존재하는 리더 (leader) 서열을 타겟으로 하여 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

SARS-COV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-COV-2의 진단방법
본 발명은 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신종 코로나바이러스에 감염된 세포에서 가장 풍부하게 존재하는 리더 (leader) 서열을 타겟으로 하여 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
코로나바이러스 (Coronavirus)는 약 27-32 kb 정도의 (+) strand RNA genome 단일 조각으로 구성된 바이러스로서 사람과 다른 포유동물들에 분포한다. 코로나바이러스는 복제와 전사과정을 거쳐서 게놈-RNA (genome-RNA)와 3’ 말단에 공통의 mRNA를 가지는 서브게놈 RNA (subgenomic RNA) 6~8개를 생산한다고 알려져 있다 (Imbert I et al.; A second, non-canonical RNA-dependent RNA polymerase in SARS Coronavirus. The EMBO Journal. 2006, 25:4933-4942).
대부분의 사람에서 코로나바이러스 감염은 가벼운 증상을 나타내나 감염력이 높아 지난 20여 년간 10,000명 이상의 사람에 SARS (중증호흡기증후군, 치사율 10%) 코로나바이러스 및 MERS (중동호흡기증후군, 치사율 37%) 코로나바이러스가 감염되었다 (Chaolin Huang, Yeming Wang, Xingwang Li, Lili Ren, Jianping Zhao, Yi Hu et al.; Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 2020).
다만, 최근에 발견된 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 감염증은 2019년 12월 1일 중국에서 발견 (Chaolin Huang, Yeming Wang, Xingwang Li, Lili Ren, Jianping Zhao, Yi Hu et al.; Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 2020) 되어 2019년 12월 12일 최초 보고된 급성 호흡기 증후군으로, 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등의 증세를 보인다.
2020년 1월부터는 중국 국외로도 광범위하게 전파되었으며, 중국내 춘절 연휴를 전후하여 빠른 전염으로 감염자 급증, 우한시 도시 기능 전체가 마비되는 등 우려할 사태로 발전하고 있다.
일반적으로 바이러스의 게놈을 분석하는 데는 SSP-PCR (Single Specific Primer-Polymerase Chain Reaction), 실시간 PCR, PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism analysis) 및 시퀀싱 등의 방법이 사용되고 있다. SARS-CoV-2의 감염 여부 진단은 1차로 판코로나바이러스 검사를 통해 코로나바이러스 검출 여부를 확인하고, 이후 실시간 PCR과 시퀀싱 방법이 접목된 방법을 사용하였다. 이에 따라, 감염 여부 진단 시간이 24시간 이상 걸리는 문제가 있었다.
최근에 미국 질병관리본부와 WHO에서는 검사시간을 단축하기 위하여 RT-실시간 PCR (reverse transcription-real time PCR)법을 개발하여 공급하고 있다 (Real time RT-PCR Panel for detection 2019-Novel Coronavirus. Centers for Disease Control and Prevention, Respiratory Viruses Branch, Division of Viral Diseases). 미국 질병관리본부가 개발한 검사법은 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 단백질을 만드는 N 유전자의 3군데 부위를 증폭하는 방법이다. WHO에서 개발한 방법은 스크리닝과 확진이 동시에 가능한 단일 단계 실시간 PCR (One-step real time PCR) 방법으로 기존 사스 관련 바이러스와 서열 일치도가 높은 E 유전자 부위를 스크리닝을 위한 목적으로 사용하고, SARS-CoV-2 감염 여부 확진을 위해서 SARS-CoV-2를 특이적으로 검출할 수 있는 RdRP (RNA dependent RNA polymerase) 유전자를 증폭하는 방식이다 (도 1).
그러나, E gene 및 RdRP 유전자는 바이러스 감염 세포내에서 존재량이 낮기 때문에 실험적 에러나 검체의 RNA 안전성에 따라 검출이 불가능한 경우가 있을 수 있다.
또한, 미국 질병관리본부와 WHO에서는 RNA 검체 적합성 판정을 위한 내부 대조군 유전자로 사람 RNase P 유전자를 사용하였으며, RNase P cDNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브 서열을 공개한 바 있다. 그러나, 본 출원 발명자는 공개된 프라이머 및 프로브 서열은 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫번째 엑손 내부를 타겟하는 프라이머로, 게놈 DNA에 적용시 위양성 증폭이 발생할 수 있음을 확인하였다. 검사현장에서 검체로부터 RNA 추출시 게놈 DNA가 완벽히 제거되지 않는 경우가 빈번하므로, 검체적합성 판정에 에러가 발생할 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위해 초기 감염세포내에 가장 풍부하게 존재하는 리더 서열을 타겟으로 하는 새로운 검출방법을 개발하였다. 또한, 게놈 DNA 유래 위양성 증폭이 발생하지 않도록 RNA 스플라이싱을 고려하여 내부 대조군 RNase P 유전자에 대한 프라이머를 제작하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 정확하면서도 위양성 발생없이 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단할 수 있는 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 코로나바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 코로나바이러스 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
도 1는 WHO 권고에 따른 신종 코로나바이러스 진단을 위한 유전자를 나타낸 것이다.
도 2는 코로나바이러스 서브-게놈 RNA (sub-genomic RNA)가 발현되는 기작을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 SARS-CoV-2 리더 RNA 서열을 RT-qPCR을 수행하여 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 SARS-CoV-2 RNA로부터 리더 서열을 RT-qPCR을 수행하여 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 RNase P 유전자 구조 및 본 발명의 핵산 올리고머가 증폭하는 부위를 나타낸 것이다.
도 5b는 RNase P 유전자를 RT-qPCR을 수행하여 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 출원의 발명자들은 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위해 초기 감염세포내에 가장 풍부하게 존재하는 리더 서열을 타겟으로 하는 새로운 검출방법을 통해 신종 코로나바이러스 감염 여부를 신속 및 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
이러한 관점에서, 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 코로나바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
상기 리더 서열과 관련하여, 코로나바이러스 중 게놈 RNA와 전사 발현된 서브 게놈 mRNA (subgenomic mRNA)들은 5‘ 말단에 약 72~77 bp로 구성된 리더 서열을 공통으로 가지고 있으며, 이는 코로나바이러스의 독특한 특징으로서 바이러스 서열 중 감염세포에서 가장 풍부하게 존재하는 타겟이다. 이는 코로나바이러스의 모든 서브 게놈 RNA는 게놈 RNA의 5’ 말단로부터 유도된 약 72 bp에 해당하는 리더 서열 (leader RNA)이 각 서브 게놈 RNA의 5' 말단에 결합하는 리더 조이닝 (leader joining) 현상을 나타내기 때문이다.
따라서, 리더 서열은 세포내에서 바이러스 유전자 중 가장 복제수가 높으며, N 단백질을 코딩하는 서브 게놈 RNA의 복제수가 그 다음으로 높다. 따라서, 경미한 증상의 초기감염에서 낮은 양으로 존재하는 코로나바이러스의 효과적인 검출을 위해서는 리더 서열을 검출의 표적으로 이용하는 것이 가장 효과적이라 할 수 있다.
본 명세서에서 핵산 올리고머는 핵산을 단량체로 하여 중합하여 생성되는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 핵산 올리고머는 프라이머 또는 프로브로 기능할 수 있다.
본 명세서에서 ‘프라이머’는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 증폭될 유전자 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작될 수 있다. 이는 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다.
하나의 실시예에서, 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 리더를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머는 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 예를 들어, PCR을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 쌍으로 만들어서 동시에 사용할 수 있다. 서열번호 10의 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 리더 서열을 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다. 상기 역방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
또한, RNA 스플라이싱을 고려하여 내부 대조군 RNase P 유전자에 대한 프라이머를 제작하여 게놈 DNA 유래 위양성 증폭이 발생하지 않음을 확인하였다.
내부 대조군 유전자는 RNA 검체 적합성 판정을 위한 올리고뉴클레오티드로, 표적 유전자와 상보성이 없을 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 종래 내부 대조군 유전자로 사람 RNase P 유전자를 사용하였다.
CDC에 의해 공개된 RNase P cDNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브 서열은 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫번째 엑손 내부를 타겟하는 프라이머로, 게놈 DNA에 적용시 위양성 증폭이 발생할 수 있음을 확인하였다. 검사현장에서 검체로부터 RNA 추출시 게놈 DNA가 완벽히 제거되지 않는 경우가 빈번하므로, 검체적합성 판정에 에러가 발생할 수 있다.
하나의 실시예에서, 서열번호 11의 서열을 포함하는 RNase P를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 추가로 포함할 수 있다.
상기 핵산 올리고머는 예를 들어, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 서열을 포함하는 프라이머일 수 있다. 본원발명에 따른 프라이머는 두번째 엑손의 5’부위에 상보적인 서열을 타겟으로 하여, 게놈 DNA에 적용시 위양성 증폭이 발생하지 않음을 확인하였다.
상기 프라이머는 예를 들어, PCR을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 쌍으로 만들어서 동시에 사용할 수 있다. 서열번호 11의 서열을 포함하는 RNase P를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 7의 서열을 포함할 수 있다. 상기 역방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 8의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산 올리고머에 의해 특이적으로 증폭된 코로나바이러스 리더 또는 RNase P 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프로브와 관련하여, 특정 조건에서 증폭 산물과 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
혼성화 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
하나의 실시예에서, 상기 증폭된 코로나바이러스 리더에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브는 예를 들어, 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 내부 대조군으로 사용된 상기 증폭된 RNase P 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브는 서열번호 9의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 증폭 산물의 양은 형광신호에 의해 검출할 수 있다. 프로브가 결합된 증폭산물의 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(intercalator)을 사용하는 인터컬레이팅(Intercalating)법, 5' 말단은 형광물질, 3' 말단은 소광자(quencher)로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 등이 있다.
본원발명에 따른 증폭은 역전사 효소 (Reverse transcriptase)를 이용하여 실-시간 정량 증폭 예를 들어 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-Time PCR)을 통해 수행될 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응에 있어 PCR 증폭 산물의 양은 형광 신호에 의해 검출할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응이 진행되면서 증가하는 폴리뉴클레오티드 양에 따라 형광 신호의 세기가 증가하게 되고, 증폭 사이클 횟수에 따른 형광 신호 세기를 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선을 얻게 된다.
증폭 프로파일 곡선은 일반적으로 실질적인 폴리뉴클레오티드 양이 반영되지 않은 배경의 형광신호가 나타나는 베이스라인(baseline) 영역, 폴리뉴클레오티드 생성물량의 증가에 따른 형광신호 증가가 나타나는 지수적 영역(exponential region), 및 PCR 반응이 포화 상태에 이르러 형광신호 세기의 증가가 나타나지 않는 정체 상태 영역(plateau region)으로 나누어 진다.
통상적으로 베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 지점, 즉 PCR 증폭 산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달한 때의 형광신호 세기를 임계값(threshold)이라고 하고 증폭 프로파일 곡선에서 임계값에 대응되는 증폭 사이클 횟수를 임계 사이클(threshold cycle: Ct)값이라고 한다.
상기 Ct값을 측정하고 표준물질에 대한 Ct(threshold cycle)값을 기반으로 농도가 결정된 표준곡선을 분석하여, 증폭된 유전자의 농도를 확인함으로써, 메틸화 특이적 민감도 및/또는 특이도를 결정할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 검체는 의심 환자 또는 진단 대상 개개인 또는 개개인 유래의 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함할 수 있고, 예를 들어 하기도의 가래, 상기도의 구인두도말물 및/또는 비인두도말물, 배양검체, 조직검체 또는 혈액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검체로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 핵산의 추출은 예를 들어 상업화 되어 공급되고 있는 다양한 키트 또는 추출 시약을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기, 핵산 올리고머를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 유전자 증폭 산물 각각을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 용기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 경우에 따라, 중합효소, 버퍼, 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 프라이머 또는 프로부 각각을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: SARS-CoV-2 검출 및 내부대조유전자 검출용 프라이머 및 프로브 설계
SARS-CoV-2 (GenBank No. MN988668.1: 서열번호 12)의 리더 서열 cDNA (서열번호 10) 및 또한 내부대조유전자 RNase P (서열번호 11)의 증폭을 위한 프라이머 및 프로브는 Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 프로그램을 이용하여 설계하였다 (표 1).
Figure PCTKR2021002735-appb-T000001
실시예 2: SARS-CoV-2 Leader 및 RNase P 유전자 RNA 합성
SARS-CoV-2의 리더 서열에 해당하는 RNA를 합성하기 위하여 SARS-CoV-2 중 리더 서열 72 bp (서열번호 10)를 포함하는 110 bp (서열번호 13)에 해당하는 DNA를 합성하였다 (NeoProbe, 한국). RNase P 유전자 (GenBank No. NC_000010.11: 서열번호 14)의 RNA를 합성하기 위하여 RNase P 서열에 해당하는 180 bp DNA (서열번호 2)를 합성하였다. 각 합성된 DNA의 5’말단에는 T7 프로모터 서열을 연결하여 in vitro transcription 방법으로 RNA를 제작하였다.
(1) In vitro transcription (IVT)
두 개의 주형 PCR 산물을 50 ng씩 사용하여 MEGAScriptTM T7 Transcruption kit, Invitrogen)를 사용하여 제조사 지침에 따라 아래와 같이 수행하였다.
Figure PCTKR2021002735-appb-T000002
2시간 동안의 반응이 끝난 후, 잔여 DNA 제거를 위해 DNase 4 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 15분간 반응하였다. 합성된 리더 및 RNase P RNA는 QIAamp RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 제조사 지침에 따라 정제하였다. 최종적으로 합성된 RNA는 50 ㎕ RNase-free DW로 용출하였다.
실시예 3: 역전사 중합효소 실시간 SARS-CoV-2 Leader cDNA 및 RNase P cDNA 검출
RT-qPCR은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 반응액의 조성은 아래 표와 같으며, RT-qPCR 반응은 AB 7500 Fast (ThermoFisher, USA) 장비를 사용하였다. 첫 번째 역전사단계 (Reverse transcription; RT)에서 RNA에 상보적인 cDNA를 만들고, 두 번째 실시간 PCR (qPCR) 단계에서 cDNA를 증폭하였다.
Figure PCTKR2021002735-appb-T000003
Figure PCTKR2021002735-appb-T000004
(1) SARS-CoV-2 Leader RNA 서열 검출 결과
SARS-CoV-2 Leader RNA 서열에 상보적인 cDNA 검출을 확인하기 위하여 Leader RNA (104 copies), In vitro transcription에 사용한 Leader DNA (104 copies), human genomic DNA (10 ng) 및 human total RNA (10 ng)을 사용하여 One-step RT-qPCR을 수행하였다 (도 3). 그 결과, Leader cDNA 및 Leader DNA에서만 증폭이 확인되었고, 나머지 주형들에서의 비특이적인 증폭은 없는 것을 확인하였다 (표 5).
Figure PCTKR2021002735-appb-T000005
실제 SARS-CoV-2 Leader RNA의 증폭 여부를 확인하기 위하여, 한국국가병원체자원은행에서 한국인에서 분리한 SARS-CoV-2를 배양하여 분리한 RNA를 사용하였다. One-Step RT-qPCR은 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 시험결과, SARS-CoV-2의 Leader RNA가 정상적으로 증폭되는 것을 확인하였다 (도 4, 표 6)
Figure PCTKR2021002735-appb-T000006
(2) RNase P RNA 검출 결과
RNA 검체 적합성 판정을 위한 내부대조군 유전자는 사람 RNase P 유전자를 사용하였다. RNase P RNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브는 미국 질병관리본부가 공개한 서열이 있으나, 본 출원의 발명자가 확인한 결과 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫 번째 엑손 내부에서 프라이머가 제작되어, 게놈 DNA에서 위양성 증폭이 발생하였다.
이는 검체로부터 RNA 추출시 게놈 DNA가 완벽히 제거되지 않는 경우가 빈번하므로, 검체적합성 판정에 에러가 발생할 수 있기 때문에 본 발명자들은 이런 문제를 해결하기 위하여 RNA 스플라이싱을 고려하여 게놈 DNA 유래 위양성 증폭이 발생하지 않도록 신규 역방향 프라이머를 제작하였다.
도 5a에서와 같이, RNase P 유전자는 총 36.6 kb 정도의 서열로 구성된 유전자로 총 11개의 엑손으로 구성되어 있다.
미국 질병관리본부가 제공하는 RNase P 유전자 서열에 해당하는 프라이머 및 프로브는 전부 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫 번째 엑손에 해당하는 부위에서 제작되어 사람 게놈 DNA를 대상으로 증폭하였을 때, 위양성 증폭이 일어났다 (도 5b의 (a)). 반면에 본 발명자들이 개발한 역방향 프라이머를 사용한 경우에는 인간 게놈 DNA로부터 위양성 증폭이 발생하지 않았다 (도 5b의 (b)).
따라서, 본 발명자는 약 2.8 kb 떨어진 두 번째 엑손의 5’ 부위에 상보적인 부위에 대한 역방향 프라이머를 신규로 제작함으로써 게놈 DNA에 의한 위양성 증폭 문제를 해결하였다. IVT한 RNase P RNA와 사람 전체 RNA를 대상으로 증폭한 결과, 정상적인 증폭이 일어남을 확인하였다 (표 7).
Figure PCTKR2021002735-appb-T000007
실시예 4: 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 진단능력 평가
서열번호 10의 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2의 진단능력을 평가하기 위하여 영남대학교 병원 (IRB No. YUMC 2020-07-001)에 보관중인 이미 SARS-CoV-2 진단결과를 알고 있는 상기도 검체 (음성 180예, 양성 76예)로부터 QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen, Cat. No: 52904 or 52906)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. RNase P 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다 (표 8의 IC CT값 참조).
SARS-CoV-2 감염여부를 진단하기 위하여 RT-qPCR은 실시예 3에 기술된 방법으로 수행하였다 (표 8).
Figure PCTKR2021002735-appb-T000008
Figure PCTKR2021002735-appb-I000001
Figure PCTKR2021002735-appb-I000002
Figure PCTKR2021002735-appb-I000003
Figure PCTKR2021002735-appb-I000004
Figure PCTKR2021002735-appb-I000005
Figure PCTKR2021002735-appb-I000006
Figure PCTKR2021002735-appb-I000007
Figure PCTKR2021002735-appb-I000008
Figure PCTKR2021002735-appb-I000009
리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 진단결과, 민감도는 100% (76/76) 그리고 특이도는 100% (180/180)로 우수함을 확인하였다 (표 9). 따라서, 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 진단의 유효성이 있을 확인하였다.
Figure PCTKR2021002735-appb-T000009
본 발명을 통해, 빠른 시간 내에 결과 확인이 가능하여 신종 코로나바이러스 감염 여부를 신속하게 진단할 수 있으며, 위양성이 발생하지 않도록 함으로써 정확한 진단이 가능하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (10)

  1. 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 코로나바이러스 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코로나바이러스 리더를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 올리고머에 의해 특이적으로 증폭된 코로나바이러스 리더 서열의 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭된 코로나바이러스 리더에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브는 서열번호 3의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 코로나바이러스 진단용 키트.
  6. 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 코로나바이러스 리더를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 핵산 올리고머에 의해 특이적으로 증폭된 코로나바이러스 리더 서열의 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 증폭된 코로나바이러스 리더에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브는 서열번호 3의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 증폭은 RT-qPCR (Quantitative reverse transcription PCR)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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