WO2021215556A1 - 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 - Google Patents

코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2021215556A1
WO2021215556A1 PCT/KR2020/005337 KR2020005337W WO2021215556A1 WO 2021215556 A1 WO2021215556 A1 WO 2021215556A1 KR 2020005337 W KR2020005337 W KR 2020005337W WO 2021215556 A1 WO2021215556 A1 WO 2021215556A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
coronavirus
gene
probe
diagnostic kit
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/005337
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김주형
차고운
Original Assignee
(주)오상헬스케어
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)오상헬스케어 filed Critical (주)오상헬스케어
Priority to PCT/KR2020/005337 priority Critical patent/WO2021215556A1/ko
Priority to KR1020217005120A priority patent/KR20230002017A/ko
Priority to US17/274,748 priority patent/US11976338B2/en
Publication of WO2021215556A1 publication Critical patent/WO2021215556A1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a coronavirus diagnostic kit, a coronavirus diagnostic kit prepared therefrom, and a method for diagnosing coronavirus using the same.
  • coronavirus SARS-CoV-2; Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2
  • Coronavirus Disease-19 COVID-19
  • a diagnostic kit for coronavirus using real-time polymerase chain reaction is being used.
  • a diagnostic kit using real-time PCR is based on a method of extracting viral RNA from a sample and then performing a reverse transcription reaction on the extracted viral RNA to amplify and confirm only a specific gene.
  • a plurality of primer pairs and corresponding probes are required for the purpose of amplifying a specific part of the RNA of the virus.
  • a diagnostic kit is used when diagnosing a target virus after putting a pair of primers specifically binding to each target gene and a probe corresponding thereto in separate containers.
  • the user has no choice but to handle a plurality of containers at the same time, so there is a difficulty in use.
  • the amount of sample used is high and contamination frequently occurs during the course of the experiment, which may increase this difficulty.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a coronavirus diagnostic kit with high reliability of analysis of coronavirus even including a plurality of primer pairs and probes.
  • One aspect of the present invention is a method for manufacturing a coronavirus diagnostic kit.
  • a method for preparing a coronavirus diagnostic kit is a primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, a primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
  • a primer set comprising a primer pair consisting of, and a primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
  • the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10
  • the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 are mixed to form a one-component primer/probe mixture comprising the steps of preparing
  • the method comprises a plasmid containing the RdRp gene of coronavirus, a plasmid containing the N gene of corona virus, a plasmid containing the E gene of corona virus, and a plasmid containing the human RNase P gene Composition comprising It may further comprise the step of preparing.
  • the one-component primer/probe mixture may be prepared in a separate container from the composition containing the plasmid.
  • the coronavirus diagnostic kit prepared by the above method can be used for real-time PCR.
  • Another aspect of the present invention is a coronavirus diagnostic kit.
  • the coronavirus diagnostic kit is manufactured by the method of manufacturing the coronavirus diagnostic kit of the present invention.
  • Another aspect of the present invention is a method for diagnosing coronavirus.
  • the coronavirus diagnostic method includes using the coronavirus diagnostic kit of the present invention.
  • the present invention provides a method of manufacturing a coronavirus diagnostic kit that allows a user to conveniently detect a coronavirus.
  • the present invention provides a method of manufacturing a coronavirus diagnostic kit with high reliability of corona virus analysis even including a plurality of primer pairs and probes.
  • diagnosis means identifying a pathological condition.
  • diagnosis is to confirm the presence or absence of the expression of genes specific to various existing coronaviruses to confirm the occurrence of diseases caused by coronaviruses and the prognosis in the course of antiviral drug treatment after the onset.
  • the term "primer” refers to a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for template strand copying. do.
  • the primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for the polymerization reaction (DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different types of dNTPs in an appropriate buffer solution and temperature.
  • the primer is preferably composed of nucleic acids in the forward and reverse directions each having a nucleotide sequence of about 20 nucleotides or less.
  • coronavirus may refer to a novel coronavirus (SARS-CoV-2).
  • a primer pair of a specific combination that amplifies only a specific site from the full-length nucleotide sequence of the corona virus through a polymerase chain reaction, and Probes were selected and prepared by mixing them in a one-component form.
  • "one-component type" indicates that the primer and the probe are contained in one container.
  • the RNA-dependent RNA polymerase gene (RdRp gene) of the corona virus As a gene that can distinguish the coronavirus from other types of viruses, the RNA-dependent RNA polymerase gene (RdRp gene) of the corona virus, the nuclear protein gene (N gene) of the corona virus, and the corona virus envelope Protein gene (E gene) and the like were used.
  • RdRp gene RNA-dependent RNA polymerase gene
  • N gene nuclear protein gene
  • E gene corona virus envelope Protein gene
  • the present invention includes a forward nucleic acid (SEQ ID NO: 1) amplifying the RdRp gene of coronavirus, and a reverse nucleic acid (SEQ ID NO: 2) amplifying the RdRp gene of a coronavirus.
  • the present invention includes a forward nucleic acid (SEQ ID NO: 3) amplifying the N gene of the corona virus and a reverse nucleic acid (SEQ ID NO: 4) amplifying the N gene of the corona virus.
  • the present invention includes a forward nucleic acid (SEQ ID NO: 5) amplifying the E gene of the corona virus and a reverse nucleic acid (SEQ ID NO: 6) amplifying the E gene of the corona virus.
  • human ribonucleic acid hydrolysis as an internal control primer It further includes a forward nucleic acid (SEQ ID NO: 7) amplifying a degrading enzyme gene (RNase P gene), and a reverse nucleic acid (SEQ ID NO: 8) amplifying a human RNase P gene.
  • SEQ ID NO: 7 amplifying a degrading enzyme gene
  • SEQ ID NO: 8 reverse nucleic acid
  • SEQ ID NO: 7 are the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, the primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, the primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 When combined in a one-component form, coronavirus When identifying genes of
  • the primer may include additional features within the scope that does not change the basic properties of the primer serving as the starting point of DNA synthesis.
  • the primer nucleic acid sequence of the present invention may include a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels may be enzymes, radioisotopes, fluorescent molecules, chemical groups, and the like.
  • a probe is included to detect a specific gene of the corona virus.
  • the present inventors perform real-time PCR to detect the amplification product, the increase in the amplification product can be monitored in real time, so that accurate quantification of DNA and RNA is possible, and there is no need for electrophoresis, so it can be analyzed quickly and easily and contamination There is little risk of, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1-2, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3-4, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5-6, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7-8 when confirming the gene of the coronavirus Mixing did not cause any problems in analytical specificity, analytical sensitivity, reproducibility, repeatability and coherence.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as DNA or RNA that can form a specific binding with a complementary nucleotide sequence, and corresponds to several bases to several hundred bases as short as possible. Since the probe is labeled, the presence or absence of a specific nucleotide sequence can be confirmed.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
  • a fluorescently-labeled probe may be used. More specifically, when using a TaqMan probe, an oligonucleotide modified with a fluorescent material at the 5' end and a quencher at the 3' end is added to the PCR reaction solution.
  • the fluorescent material may be FAM, JOE, Texas Red, Cy5, Cal Red 610, VIC, Quaser 670, or the like, but is not particularly limited thereto.
  • the scavenging material may be a black hole quencher (BHQ), an SFC quencher (SFCQ), or the like, but is not particularly limited thereto.
  • BHQ black hole quencher
  • SFCQ SFC quencher
  • a probe (SEQ ID NO: 9) for detecting the RdRp gene of the coronavirus a probe (SEQ ID NO: 10) for detecting the N gene of the corona virus, and a probe (SEQ ID NO: 11) for detecting the E gene of the corona virus ) and a probe (SEQ ID NO: 12) for detecting the human RNase P gene.
  • Primers and/or probes of the present invention may be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods.
  • Such nucleic acid sequences can be modified using a number of means known in the art. Examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of nucleotides with homologues, and the like.
  • the primer/probe mixture may further include a buffer (eg, TE-buffer) commonly used by those skilled in the art for storage and maintenance of primers and probes.
  • a buffer eg, TE-buffer
  • the above-mentioned primers and probes may each be included in an amount of 50 pmol to 150 pmol per 1 ⁇ l in the above-mentioned mixture, but is not particularly limited thereto.
  • the above primer/probe mixture may be stored and stored in a container including a tube or other suitable ampoule or the like.
  • the method of the present invention may further comprise the step of preparing a composition for performing real-time PCR.
  • the composition may be stored in a separate container from the primer/probe mixture described above.
  • the composition is a reverse transcriptase (Reverse Transcriptase) for synthesizing complementary cDNA (complementary DNA) from RNA, which is a gene of coronavirus, Taq polymerase for amplifying cDNA, reaction buffer (pH and magnesium concentration can be variously adjusted ), deoxynucleotides (dNTPs, dATP, dTTP, dGTP, dCTP), RNase inhibitors, DEPC-treated water, and the like.
  • Reverse Transcriptase reverse Transcriptase
  • RNA complementary DNA
  • RNA complementary DNA
  • Taq polymerase for amplifying cDNA
  • reaction buffer pH and magnesium concentration can be variously adjusted
  • deoxynucleotides dNTPs, dATP, dTTP, dGTP, dCTP
  • RNase inhibitors DEPC-treated water, and the like.
  • the method of the present invention may further include the step of preparing a composition for a positive control to increase reliability in the detection of coronavirus.
  • the composition may be stored in a separate container from the primer/probe mixture described above.
  • the composition may be stored in a separate container from the composition for performing the above-described real-time PCR.
  • the composition for positive control may include a plasmid containing the RdRp gene of coronavirus, a plasmid containing the N gene of coronavirus, a plasmid containing the E gene of corona virus, and a plasmid containing the human RNase P gene.
  • plasmids can be prepared by conventional methods known to those skilled in the art with the RdRp gene, N gene, E gene, and human RNase P gene of the coronavirus, respectively.
  • composition for the positive control may further include a buffer (eg, TE-buffer) commonly used by those skilled in the art for storage and maintenance of the plasmid.
  • a buffer eg, TE-buffer
  • the method of the present invention may further include the step of preparing a composition for a negative control to increase reliability in the detection of coronavirus.
  • the composition may be stored in a separate container from the primer/probe mixture described above.
  • the composition may be stored in a separate container compared to the composition for performing the above-described real-time PCR and the composition for the positive control.
  • composition for the negative control may include ultrapure water and the like, but is not limited thereto.
  • the coronavirus diagnostic kit of one embodiment of the present invention includes a first container containing the above-mentioned primer/probe mixture.
  • the container may be a tube or other suitable ampoule or the like.
  • the coronavirus diagnostic kit may include a second container containing the composition for performing the above-described real-time PCR, a third container containing the above-described composition for positive control, and a fourth container containing the above-described composition for negative control. have.
  • Coronavirus diagnostic kits can enable a patient to determine whether a disease caused by a coronavirus has developed, and can also provide information for a diagnosis of the coronavirus.
  • the coronavirus diagnostic kit has high analytical specificity, analytical sensitivity, reproducibility, repeatability, and no interference problems, and allows users to conveniently diagnose coronavirus.
  • the corona virus diagnosis method of an embodiment of the present invention includes a method of diagnosing a sample RNA using the coronavirus diagnosis kit of an embodiment of the present invention.
  • the method for diagnosing coronavirus includes performing a reverse progenitor reaction and a real-time PCR reaction using the sample.
  • sample may be extracted from a respiratory tract suspected of having a coronavirus infection.
  • the sample may include, but is not limited to, alveolar lavage fluid, throat swab, sputum, saliva, and the like.
  • Example 1-1 Corona virus-specific primer production
  • the present inventors have a primer pair having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 to amplify the RdRp gene of the coronavirus, SEQ ID NO: 3 to amplify the N gene of the corona virus, a primer pair having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, corona Primer pairs having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for amplifying the E gene of the virus were prepared using a conventional method, respectively.
  • primer pairs having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for amplifying the human RNase P gene as internal control primers were prepared using a conventional method, respectively.
  • Example 1-2 Preparation of specific probes for coronavirus
  • the present inventors detect a probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 capable of detecting the RdRp gene of the coronavirus, the probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 capable of detecting the N gene of the corona virus, and detecting the E gene of the coronavirus
  • a pair of probes having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 capable of detecting the nucleotide sequence and primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 capable of detecting the human RNase P gene were prepared using a conventional method, respectively.
  • the primer pairs and probes prepared in Tables 1 and 2 were put into a 50 ml tube at a volume of 100 pmol per 1 ⁇ l of TE buffer, respectively, and then mixed to prepare a one-component primer/probe mixture.
  • Example 3 Preparation of a composition for a positive control and a composition for a negative control
  • RdRp gene, N gene, E gene, and human Rnase P gene of corona virus was collected from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and GISAID, respectively. DNA was synthesized by confirming the DNA sequence for the specific amplification section considering the primer pair and probe to be used in the present invention.
  • TE buffer 50 ⁇ l of TE buffer was added to the plasmid clone containing the RdRp gene, N gene, E gene, and RNase P gene, and vortexed for 1 minute to completely dissolve the clone.
  • 2 ⁇ l (10 ng/ ⁇ l) of each clone synthesized in 100 ⁇ l Hit-DH5 alpha Competent cell (RBC) was added, tapped lightly, and left on ice for 5 minutes.
  • LB ampicillin+
  • LB (ampicillin+) agar plate After preparing another LB (ampicillin+) agar plate, 30 ⁇ l of the competent cell mixture containing each clone was spread using a spreader. These two agar plates were incubated at 37° C. for 18 hours. Among these two agar plates, a colony with a well-generated single colony was selected, and the transformed colony was selected again and cultured with shaking in LB Broth for 16 hours.
  • Example 3-4 Preparation of composition for positive control
  • Each of the prepared plasmids was put into a 50 ml tube at a volume of 10 ng per 1 ⁇ l of TE buffer, and then mixed to prepare a composition for a positive control.
  • a composition for negative control was prepared by putting ultrapure water into a 50ml tube.
  • the first container containing the primer/probe mixture prepared in Example 1, the third container containing the composition for positive control prepared in Examples 3-4, and the composition for negative control prepared in Examples 3-5 A diagnostic kit consisting of a total of four containers was prepared, including a fourth container, a second container containing a composition for real-time PCR containing reverse transcriptase, dNTP, and the like.
  • RNA was extracted from the sample using an RNA extraction kit (QIAamp Viral RNA mini kit, Qiagen, Germany).
  • a RT-PCR Matser mixture was prepared by mixing 5 ⁇ l of the primer/probe mixture per 10 ⁇ l of the composition for real-time PCR. 15 ⁇ l of the prepared RT-PCR Matser mixture was dispensed into each well, and 5 ⁇ l of the extracted RNA was added to the well and mixed well.
  • the composition for the positive control and the composition for the negative control were also treated in the same manner as the primer/probe mixture.
  • the reaction was carried out in a real-time PCR device. Specific PCR reaction conditions are shown in Table 3 below.
  • coronavirus diagnostic kit prepared in Example 4, a real-time PCR reaction was performed on the viruses in Table 5 (obtained from the Yeonso-gu Central Center (KNRRC) and the National Pathogen Resources Bank (NCCP)) and . Each DNA/RNA concentration was adjusted to 1 ng/ ⁇ l and repeated three times. As a result, negative results were obtained for all viruses. Therefore, it can be confirmed that the coronavirus diagnostic kit of the present invention has excellent analytical specificity for coronavirus.
  • KNRRC Yeonso-gu Central Center
  • NCCP National Pathogen Resources Bank
  • Target RNA was prepared at various concentrations, and a real-time PCR reaction was performed using the prepared coronavirus diagnostic kit. As a result, the calculated analytical sensitivity according to CLSI EP17-A was confirmed with 10 copies/reaction of RdRp gene, E gene, and N gene of corona virus.
  • a coronavirus diagnostic kit was prepared on another day in the same manner as in Example 4. Then, PCR was performed in the same manner with the target RNA of the corona virus at the same concentration. As a result, the reproducibility was excellent with a CV of less than 5%.
  • the diagnostic kit of Example 4 was diagnosed twice a day for 12 days with the target RNA of the corona virus at the same concentration. All diagnostic results were excellent in repeatability with a CV of less than 5%.
  • Mucin, NaCl, blood, respiratory syncytial virus A, and 1X PBS were prepared as interfering substances.
  • Each of the above-mentioned interfering substances was added to the sample by throat swab, and corona virus RNA was extracted therefrom. As a result, it was possible to determine 100% positive for the corona virus regardless of the interfering substance.
  • Example 1 the primer pair of SEQ ID NO: 13 (forward) and SEQ ID NO: 14 (reverse) (SEQ ID NO: 13: RdRp-1_F, SEQ ID NO: 14: RdRp-1_R) was used instead of the primer pair of SEQ ID NO: 1-2.
  • a virus diagnostic kit was prepared in the same manner as in Example 4, except that. Using the prepared virus diagnostic kit, the evaluation was performed in the same manner as in Experimental Examples 1 to 5 above. As a result, there was a problem in that the sensitivity of the RdRp gene of the corona virus was lowered.
  • Example 1 the primer pair of SEQ ID NO: 15 (forward) and SEQ ID NO: 16 (reverse) (SEQ ID NO: 15: NF-1, SEQ ID NO: 16: NR-1) was used instead of the primer pair of SEQ ID NO: 3-4
  • a virus diagnostic kit was prepared in the same manner as in Example 4, except that. Using the prepared virus diagnostic kit, the evaluation was performed in the same manner as in Experimental Examples 1 to 5 above. As a result, there was a problem in that the sensitivity of the N gene of the corona virus was lowered.
  • Example 1 the primer pair of SEQ ID NO: 17 (forward) and SEQ ID NO: 18 (reverse) (SEQ ID NO: 17: EF-1, SEQ ID NO: 18: ER-2) was used instead of the primer pair of SEQ ID NO: 5-6
  • a virus diagnostic kit was prepared in the same manner as in Example 4, except that. Using the prepared virus diagnostic kit, the evaluation was performed in the same manner as in Experimental Examples 1 to 5 above. As a result, there was a problem in that the sensitivity of the E gene of the corona virus was lowered.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이를 사용하여 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법이 제공된다.

Description

코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법
본 발명은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법에 관한 것이다.
최근 코로나 바이러스의 유행으로 인하여 확진자 및 사망자가 폭증하고 있는 상태에 있다. 코로나 바이러스 감염증-19(Coronavirus Disease-19; COVID-19)를 유발하는 코로나 바이러스(SARS-CoV-2; Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)는 접촉자 간에 전파 속도가 매우 빠를 뿐만 아니라 현재 유효한 치료제나 백신도 없는 상태이다. 따라서 빠른 시일 내에 코로나 바이러스에 걸린 사람들을 구별해내어 추가적인 감염 확산을 막는 방법 밖에는 없는 실정이다.
이를 위하여, 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction; 실시간 중합 효소 연쇄 반응)을 이용한 코로나 바이러스의 진단 키트가 사용되고 있다. 실시간 PCR을 이용한 진단 키트는 채취한 시료 중 바이러스의 RNA를 추출한 다음 추출한 바이러스의 RNA를 역전사 반응시켜 특정 유전자만을 증폭시켜 확인하는 방법에 기초한다.
바이러스의 진단 신뢰성을 높이기 위해서는 바이러스의 RNA 중 특정 부위를 증폭할 목적으로 타깃하는 복수 개의 프라이머 쌍과 이에 맞는 프로브가 필요하다. 통상적으로 진단 키트는 각각의 타깃 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍과 이에 맞는 프로브를 별개의 용기에 각각 넣은 다음 타깃 바이러스를 진단할 때 각각 사용하였다. 그런데, 이러한 경우 사용자는 복수 개의 용기를 동시에 다룰 수 밖에 없어 사용상 어려움이 있었다. 특히, 바이러스 진단 키트의 경우 검체 사용량이 많고 실험 과정상에서 오염이 빈번히 발생할 수 밖에 없어 이러한 어려움은 더 커질 수 있다.
그렇다고 무작정 복수 개의 프라이머 쌍과 프로브를 혼합할 경우 바이러스 진단시 분석 신뢰성이 떨어질 수 있다는 문제점이 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이 바이러스 RNA는 수 개의 염기 서열로 이루어진만큼 해당 염기 서열 중에서 어느 부위를 특이하게 증폭하느냐에 따라 검사 결과가 달라질 수 있다. 또한, 바이러스 RNA의 증폭 부위에 따라서는 프라이머들 간에 간섭이 일어날 수도 있어 바이러스 진단시 신뢰성에 문제가 생길 수 있다.
본 발명의 목적은 사용자로 하여금 코로나 바이러스를 편리하게 검출할 수 있게 하는 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 복수 개의 프라이머 쌍과 프로브를 포함하더라도 코로나 바이러스의 분석 신뢰성이 높은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 관점은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법이다.
코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 코로나 바이러스의 RdRp gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 N gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 E gene이 포함된 플라스미드, 인간 RNase P gene이 포함된 플라스미드를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 1액형의 프라이머/프로브 혼합물은 상기 플라스미드를 포함하는 조성물 대비 별개 용기에서 제조될 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 코로나 바이러스 진단 키트는 실시간 PCR에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 코로나 바이러스 진단 키트이다.
코로나 바이러스 진단 키트는 본 발명의 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 또 다른 관점은 코로나 바이러스 진단 방법이다.
코로나 바이러스 진단 방법은 본 발명의 코로나 바이러스 진단 키트를 사용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 사용자로 하여금 코로나 바이러스를 편리하게 검출할 수 있게 하는 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하였다.
본 발명은 복수 개의 프라이머 쌍과 프로브를 포함하더라도 코로나 바이러스의 분석 신뢰성이 높은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하였다.
첨부한 실시예에 의해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 측정자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 다른 용어로 사용될 수 있다. 그러므로 그 정의는 특허청구범위를 포함한 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 결정되어야 한다.
본 발명은 사용자로 하여금 코로나 바이러스를 편리하게 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위해, 본 발명 일 실시예의 코로나 바이러스의 진단 키트의 제조 방법은 코로나 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있도록 하기 위하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브 및 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1 액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 기존의 다양한 코로나 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 유무를 확인하여 코로나 바이러스에 의해 야기되는 질병의 발생 여부 및 발병 후 항바이러스 약제 치료 과정에서의 예후를 확인하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍과 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합 반응을 위한 시약(DNA 중합 효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4개 종류의 dNTP의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면 상기 프라이머는 20 뉴클레오타이드 내외의 염기 서열을 가지는 각각의 정방향 및 역방향의 핵산으로 구성되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 "코로나 바이러스"는 신종 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)를 의미할 수 있다.
본 발명에서는 코로나 바이러스를 검출하는데 필요한 프라이머 쌍과 프로브를 독립적으로 별개의 용기에 포함시키는 대신에, 코로나 바이러스의 전장 염기 서열 중에서 특이적인 부위만을 중합 효소 연쇄 반응을 통해 증폭시키는 특정 조합의 프라이머 쌍과 프로브를 선택하고 이를 1 액형으로 혼합하여 제조하였다. 본 명세서에서 "1액형"은 프라이머와 프로브를 하나의 용기에 함유하고 있음을 나타낸다.
프라이머 쌍 및/또는 프로브를 별개 용기에 담을 경우 오염이 생길 가능성이 높고 프라이머 쌍 및/또는 프로브의 개수만큼 용기가 더 필요하다는 문제점이 있다. 그렇다고 무작정 코로나 바이러스의 전장 염기 서열 중에서 특이적인 부위를 인식하는 프라이머 쌍과 프로브를 가져와 혼합한다고 하더라도 코로나 바이러스의 유전자 확인이 어렵거나 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제가 발생될 수 있다. 반면에, 본 발명에서는 하기에서 설명되는 특정 서열의 조합으로 프라이머 쌍 및 프로브를 선택하고 이를 1 액형으로 프라이머와 프로브를 모두 포함하는 하나의 혼합물로 혼합함으로써 목적으로 하는 코로나 바이러스의 유전자 확인시 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제도 발생하지 않도록 하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스를 다른 종류의 바이러스와 구별시킬 수 있는 유전자로서, 코로나 바이러스의 RNA-dependent RNA polymerase 유전자(RdRp gene), 코로나 바이러스의 핵 단백질 유전자(N gene), 코로나 바이러스의 외피 단백질 유전(E gene) 등을 사용하였다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 RdRp gene을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 1), 코로나 바이러스의 RdRp gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 2)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 N gene을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 3), 코로나 바이러스의 N gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 4)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 E gene을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 5), 코로나 바이러스의 E gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 6)을 포함한다.
한편, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 유전자 확인 시 RNA 추출 과정의 유효성에 대한 판단 기준을 제공하고, 핵산 추출 및 증폭 과정 상의 오류를 확인하기 위하여, 인터널 콘트롤 프라이머(internal control primer)로서 인간 리보핵산 가수분해 효소 유전자(RNase P gene)을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 7), 인간 RNase P gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 8)을 추가로 포함한다. 이들 서열번호 7, 서열번호 8은 상기 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머 쌍과 1액형으로 조합시 코로나 바이러스의 유전자 확인시 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제도 발생하지 않도록 할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본적인 성질을 변화시키지 않는 범위 내에서 추가적인 특징을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 될 수 있다.
본 발명에서는 코로나 바이러스의 특이적인 유전자를 검출할 수 있도록 프로브를 포함한다. 본 발명자는 실시간 PCR을 수행하여 그 증폭 산물을 검출하는 경우 그 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 DNA 및 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기 영동이 필요없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 오염의 위험이 적고, 코로나 바이러스의 유전자 확인 시 상술한 서열번호 1-2의 염기 서열, 서열번호 3-4의 염기 서열, 서열번호 5-6의 염기 서열, 및 서열번호 7-8의 염기 서열과 혼합하더라도 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제가 발생하지 않도록 하였다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 상보적인 염기 서열과 특이적 결합을 이룰 수 있으며, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 라벨링되어 있어서 특정 염기 서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단일쇄(single stranded) DNA 프로브, 이중쇄(double stranded) DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광 표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광 물질로 수식되고 3' 말단은 소거(quencher) 물질로 수식된 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응액에 첨가한다.
일 구체예에서, 형광 물질은 FAM, JOE, Texas Red, Cy5, Cal Red 610, VIC, Quaser 670 등이 될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 소거 물질은 BHQ(Black hole quencher), SFCQ(SFC Quencher) 등이 될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 RdRp gene을 검출하는 프로브(서열번호 9), 코로나 바이러스의 N gene을 검출하는 프로브(서열번호 10), 코로나 바이러스의 E gene을 검출하는 프로브(서열번호 11) 및 인간 RNase P gene을 검출하는 프로브(서열번호 12)를 포함한다.
본 발명의 프라이머 및/또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용해서 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 당해 분야에서 공지된 많은 수단을 이용해서 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 동족체로의 치환 등을 들 수 있다.
상술 프라이머/프로브 혼합물은 프라이머, 프로브의 보관 및 유지를 위하여 당업자에게 통상적으로 사용되는 완충액(예를 들면 TE-buffer)을 더 포함할 수 있다.
상술 프라이머, 프로브는 각각 상술 혼합물 내에서 1㎕ 당 50pmol 내지 150pmol로 포함될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상술 프라이머/프로브 혼합물은 튜브 또는 다른 적절한 앰플 등을 포함하는 용기 내에 담겨 보관 및 저장될 수 있다.
본 발명의 방법은 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상술한 프라이머/프로브의 혼합물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다.
상기 조성물은 코로나 바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA (complementary DNA)를 합성하기 위한 역전사 효소 (Reverse Transcriptase), cDNA를 증폭하기 위한 Taq polymerase, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양하게 조절될 수 있음), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs, dATP, dTTP, dGTP, dCTP), RNase 억제제, DEPC-처리된 water 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 코로나 바이러스의 검출시 신뢰도를 높이기 위한 양성 대조군용 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상술한 프라이머/프로브의 혼합물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다. 상기 조성물은 상술한 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다.
구체적으로, 양성 대조군용 조성물은 코로나 바이러스의 RdRp gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 N gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 E gene이 포함된 플라스미드, 인간 RNase P gene이 포함된 플라스미드를 포함할 수 있다. 이들 플라스미드는 각각 코로나 바이러스의 RdRp gene, N gene, E gene, 및 인간 RNase P gene을 가지고 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다.
상술 양성 대조군용 조성물은 플라스미드의 보관 및 유지를 위하여 당업자에게 통상적으로 사용되는 완충액(예를 들면 TE-buffer)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 코로나 바이러스의 검출시 신뢰도를 높이기 위한 음성 대조군용 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상술한 프라이머/프로브의 혼합물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다. 상기 조성물은 상술한 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물, 양성 대조군용 조성물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다.
상기 음성 대조군용 조성물은 초순수 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예의 코로나 바이러스 진단 키트는 상술 프라이머/프로브의 혼합물을 함유하는 제1 용기를 포함한다.
상기 용기는 튜브 또는 다른 적절한 앰풀 등을 들 수 있다.
코로나 바이러스 진단 키트는 상술한 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물을 함유하는 제2 용기, 상술한 양성 대조군용 조성물을 함유하는 제3 용기, 상술한 음성 대조군용 조성물을 함유하는 제4 용기를 포함할 수 있다.
코로나 바이러스 진단 키트는 환자가 코로나 바이러스로 인한 질환이 발병되었는지 여부를 확인하도록 할 수 있으며, 코로나 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공할 수도 있다. 또한, 코로나 바이러스 진단 키트는 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성이 높고 간섭성의 문제점이 없으며 사용자로 하여금 편리하게 코로나 바이러스를 진단하도록 할 수 있다.
본 발명 일 실시예의 코로나 바이러스 진단 방법은 검체 RNA를 본 발명 일 실시예의 코로나 바이러스 진단 키트를 사용해서 진단하는 방법을 포함한다.
보다 구체적으로, 코로나 바이러스 진단 방법은 상기 검체를 사용해서 역선자 반응 및 실시간 PCR 반응을 수핸하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 "검체"는 코로나 바이러스 감염이 의심되는 호흡기관으로부터 추출될 수 있다. 예를 들면 검체는 폐포 세척액(alveolar lavage fluid), 목구멍 면봉 채취에 의한 검체(throat swab), 가래(sputum), 침 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 코로나 바이러스 특이적인 프라이머 및 프로브의 제작
실시예 1-1: 코로나 바이러스 특이적인 프라이머 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스의 RdRp gene을 증폭하는 서열번호 1, 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 코로나 바이러스의 N gene을 증폭하는 서열번호 3, 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 코로나 바이러스의 E gene을 증폭하는 서열번호 5, 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍을 통상의 방법을 사용해서 각각 제작하였다. 또한, 인터널 콘트롤 프라이머로서 인간 RNase P gene을 증폭하는 서열번호 7, 서열번호 8의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍을 통상의 방법을 사용해서 각각 제작하였다.
이름 염기 서열 (5' → 3') 길이 서열번호
B_RdRP_F1 GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG 22 1
B_RdRP_R1 CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA 26 2
N_F GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 22 3
N_R CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 22 4
B_E_F1 ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT 26 5
B_E_R1 ATATTGCAGCAGTACGCACACA 22 6
Rnase_F AGATTTGGACCTGCGAGCG 19 7
Rnase_R GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 20 8
실시예 1-2: 코로나 바이러스의 특이적인 프로브의 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스의 RdRp gene을 검출할 수 있는 서열번호 9의 염기 서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스의 N gene을 검출할 수 있는 서열번호 10의 염기 서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스의 E gene을 검출할 수 있는 서열번호 11의 염기 서열을 가지는 프로브, 인간 RNase P gene을 검출할 수 있는 서열번호 12의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍을 통상의 방법을 사용해서 각각 제작하였다.
이름 5' 염기 서열 (5' → 3') 3' 길이 서열번호
B_RdRP_P2 FAM CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC SFCQ 25 9
N_P JOE TTGCTGCTGCTTGACAGATT SFCQ 20 10
B_E_P1 Texas Red ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG SFCQ 26 11
RnaseP_P Cy5 TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG SFCQ 23 12
실시예 2: 프라이머/프로브 혼합물 제조
상기 표 1과 표 2에서 제조된 프라이머 쌍과 프로브를 각각 TE buffer 1㎕ 당 100 pmol의 용량으로 50ml 튜브에 넣은 다음 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하였다.
실시예 3: 양성 대조군용 조성물과 음성 대조군용 조성물 제조
실시예 3-1: 유전자 확보
NCBI(Ntional Center for Biotechnology Information) 및 GISAID로부터 코로나 바이러스의 RdRp gene, N gene, E gene, 인간 Rnase P gene의 유전자 정보를 각각 수집하였다. 본 발명에서 사용하고자 하는 프라이머 쌍, 프로브를 고려한 특이적 증폭 구간에 대한 DNA 서열을 확인하여 DNA를 합성하였다.
실시예 3-2: 형질 전환
합성이 완료된 RdRp gene, N gene, E gene, RNase P gene을 포함하는 플라스미드 클론에 TE buffer 50㎕를 첨가하고 1분 동안 볼텍싱하여 클론을 완전히 녹였다. 100㎕ Hit-DH5 alpha Competent cell(RBC)에 합성된 각각의 클론을 2㎕(10ng/㎕) 첨가한 후 가볍게 탭핑(tapping)한 후 얼음 위에서 5분 동안 방치하였다. LB(ampicillin+) 아가 플레이트를 준비한 후 각 클론이 포함된 70㎕의 Competent cell 혼합물을 스프레더를 이용하여 도말하였다. 추가적으로 다른 LB(ampicillin+) 아가 플레이트를 준비한 후 각 클론이 포함된 30㎕의 Competent cell 혼합물을 스프레더를 이용하여 도말하였다. 이들 두개의 아가 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이들 두 개의 아가 플레이트 중에서 싱글 콜로니가 잘 생성된 콜로니를 선별하고 형질 전환된 콜로니를 다시 한번 선택하여 LB Broth에서 16시간 동안 진탕 배양하였다.
실시예 3-3: 플라스미드 제조
상기 배양한 배양액을 10000g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 가능한 많이 제거하였다. 250㎕의 Buffer S1(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가한 후 볼텡싱하여 현탁시킨 다음 새로운 1.5ml 튜브에 현탁액을 옮겼다. 250㎕의 Buffer S2(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가하고 4회간 inverting 하였다. 350㎕의 Buffer S3(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가하고 즉시 4~6회간 inverting 하였다. 1300rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 SV 컬럼에 옮긴 뒤 30초간 원심 분리하였다. SV 컬럼을 제거한 뒤 용액을 버리고 SV 컬럼을 포집 튜브에 다시 장착한다. 700㎕의 Buffer PW(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가 후 30초간 원심분리 후 SV 컬럼을 제거한 뒤 얻은 용액을 버리고 다시 포집 튜브에 장착하였다. 남아있는 수세 버퍼를 제거하기 위해 1분간 원심분리 한 뒤 SV 컬럼를 새로운 1.5ml 튜브에 옮겼다. 50ul의 Buffer EB를 첨가하거나 초순수를 첨가한 뒤 1분간 방치하고 1분간 원심 분리하여 플라스미드를 제조하였다.
실시예 3-4: 양성 대조군용 조성물의 제조
상기 제조된 플라스미드를 각각 TE buffer 1㎕ 당 10 ng의 용량으로 50ml 튜브에 넣은 다음 혼합하여 양성 대조군용 조성물을 제조하였다.
실시예: 3-5: 음성 대조군용 조성물의 제조
초순수를 50ml 튜브에 넣어 음성 대조군용 조성물을 제조하였다.
실시예 4: 코로나 바이러스 진단 키트의 제조
실시예 1에서 제조한 프라이머/프로브 혼합물을 함유하는 제1 용기, 실시예 3-4에서 제조한 양성 대조군용 조성물을 함유하는 제3 용기, 실시예 3-5에서 제조한 음성 대조군용 조성물을 함유하는 제4 용기, 그리고 역전사 효소, dNTP 등을 함유하는 실시간 PCR용 조성물을 함유하는 제2 용기 총 4개의 용기로 구성되는 진단 키트를 제조하였다.
실시예 5: 코로나 바이러스 진단 방법
검체로부터 RNA 추출 키트(QIAamp Viral RNA mini kit, Qiagen, Germany)를 사용해서 RNA를 추출하였다. 실시간 PCR용 조성물 10㎕당 프라이머/프로브 혼합물 5㎕를 혼합하여 RT-PCR Matser mixture를 제조하였다. 상기 제조한 RT-PCR Matser mixture 15㎕를 각각 웰에 분주하고 상기 추출된 RNA 5㎕ 를 상기 웰에 넣고 잘 섞었다. 양성 대조군용 조성물, 음성 대조군용 조성물도 상기 프라이머/프로브 혼합물과 동일한 방식으로 처리하였다.
실시간 PCR 장치에 넣고 반응을 진행하였다. 구체적인 PCR 반응 조건은 하기 표 3과 같다.
온도 시간 사이클
50℃ 20분 1사이클
95℃ 5분 1사이클
95℃ 15초 45사이클
58℃* 60초
*단계에서 Fluorescence scan
양성 대조군용 조성물과 음성 대조군용 조성물을 대상으로 반응시켰을 때 Ct값은 다음 표 4와 같고, 시료의 Ct 값이 각 항목 모두 35 이하인 경우에 양성으로 판정하였다.
FAM Texas Red JOE Cy5
양성 대조군 ≤40 ≤40 ≤40 ≤35
음성 대조군 No Ct No Ct No Ct No Ct
실험예 1: 분석적 특이도
실시예 4에서 제조한 코로나 바이러스 진단 키트를 사용해서 하기 표 5의 바이러스(연소구중앙센터(KNRRC) 및 국가 병원체 자원 은행(NCCP)으로부터 입수) 및 를 대상으로 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 각 DNA/RNA 농도는 1ng/㎕로 조절하여 3회 반복 실시하였다. 그 결과, 모든 바이러스에 대해 음성 판정이 나왔다. 따라서, 본 발명의 코로나 바이러스 진단 키트는 코로나 바이러스에 대한 분석적 특이성이 우수함을 확인할 수 있다.
번호 바이러스 이름
1 Influenza A (H1N1/09)
2 Influenza A (H3N2)
3 Influenza A (H5N1)
4 Influenza B
5 Rhinovirus
6 Respiratory syncytial virus (A/B)
7 Parainfluenza 1 virus
8 Parainfluenza 2 virus
9 Parainfluenza 3 virus
10 Parainfluenza 4 virus
11 Adenovirus
12 Human Bocavirus
13 Measles virus
14 Mycoplasma spp.
실험예 2: 분석적 민감도
입수한 코로나 바이러스의 표적 RNA를 이용하여 민담도 실험을 하였다. 표적 RNA를 다양한 농도로 준비하고, 상기 제조한 코로나 바이러스 진단 키트를 사용해서 실시간 PCR 반응을 진행하였다. 그 결과 CLSI EP17-A에 따른 계산된 분석적 민감도는 코로나 바이러스의 RdRp gene, E gene, N gene 10 카피/반응으로 확인되었다.
실험예 3: 재현성
실시예 4와 동일한 방법으로 코로나 바이러스 진단 키트를 다른 날에 제조하였다. 그런 다음 동일한 농도의 코로나 바이러스의 표적 RNA를 대상으로 동일한 방법으로 PCR 진행하였다. 그 결과 CV 5% 미만으로 재현성이 우수하였다.
실험예 4: 반복성
실시예 4의 진단 키트, 동일한 농도의 코로나 바이러스의 표적 RNA를 대상으로 12일 동안 하루에 2회씩 진단하였다. 모든 진단 결과는 CV 5% 미만으로 반복성이 우수하였다.
실험예 5: 간섭 반응
간섭 물질로 뮤신(mucin), NaCl, 혈액(blood), 호흡기 세포 융합 바이러스 A(respiratory syncytial virus A), 1X PBS를 준비하였다. 목구멍 면봉 채취에 의한 시료에 상술한 각각의 간섭 물질을 첨가하고 그로부터 코로나 바이러스 RNA를 추출하였다. 그 결과, 간섭 물질에 상관 없이 코로나 바이러스를 100% 양성 판정할 수 있었다.
비교예 1:
실시예 1에서 서열번호 1-2의 프라이머 쌍 대신에 서열번호 13(정방향)과 서열번호 14(역방향)(서열번호 13: RdRp-1_F, 서열번호 14: RdRp-1_R)의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스 진단 키트를 제조하였다. 제조된 바이러스 진단 키트를 사용해서 상기 실험예 1 내지 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 코로나 바이러스의 RdRp gene의 민감도가 저하되는 문제점이 있었다.
비교예 2:
실시예 1에서 서열번호 3-4의 프라이머 쌍 대신에 서열번호 15(정방향)와 서열번호 16(역방향)(서열번호 15: N-F-1, 서열번호 16: N-R-1)의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스 진단 키트를 제조하였다. 제조된 바이러스 진단 키트를 사용해서 상기 실험예 1 내지 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 코로나 바이러스의 N gene의 민감도가 저하되는 문제점이 있었다.
비교예 3:
실시예 1에서 서열번호 5-6의 프라이머 쌍 대신에 서열번호 17(정방향)과 서열번호 18(역방향)(서열번호 17: E-F-1, 서열번호 18: E-R-2)의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스 진단 키트를 제조하였다. 제조된 바이러스 진단 키트를 사용해서 상기 실험예 1 내지 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 코로나 바이러스의 E gene의 민감도가 저하되는 문제점이 있었다.
비교예 1 내지 비교예 3에서 사용된 프라이머 쌍의 염기 서열을 하기 표 6에 나타내었다.
이름 염기 서열 (5' → 3') 길이 서열번호
RdRp-1_F GTGARATGGTCATGTGTGGCGG 22 13
RdRp-1_R CARATGTTAAASACACTATTAGCATA 26 14
N-F-1 GGGGAACTTCTCCTGCTAGA 20 15
N-R-1 GACATTTTGCTCTCAAGCTG 20 16
E-F-1 CAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT 25 17
E-R-2 ATATTGCAGCAGTACGCACAC 21 18
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및
    서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 것인,
    코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 코로나 바이러스의 RdRp gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 N gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 E gene이 포함된 플라스미드, 인간 RNase P gene이 포함된 플라스미드를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 1액형의 프라이머/프로브 혼합물은 상기 플라스미드를 포함하는 조성물 대비 별개 용기에서 제조되는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법에 의해 제조된 코로나 바이러스 진단 키트는 실시간 PCR에 사용되는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법에 의해 제조된 것인, 코로나 바이러스 진단 키트.
  6. 제5항의 코로나 바이러스 진단 키트를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 단계를 포함하는, 코로나 바이러스 진단 방법.
PCT/KR2020/005337 2020-04-22 2020-04-22 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 WO2021215556A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2020/005337 WO2021215556A1 (ko) 2020-04-22 2020-04-22 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법
KR1020217005120A KR20230002017A (ko) 2020-04-22 2020-04-22 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법
US17/274,748 US11976338B2 (en) 2020-04-22 2020-04-22 Method of manufacturing coronavirus diagnostic kit, virus diagnostic kit manufactured thereby and method of diagnosing coronavirus using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2020/005337 WO2021215556A1 (ko) 2020-04-22 2020-04-22 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021215556A1 true WO2021215556A1 (ko) 2021-10-28

Family

ID=78269321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/005337 WO2021215556A1 (ko) 2020-04-22 2020-04-22 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11976338B2 (ko)
KR (1) KR20230002017A (ko)
WO (1) WO2021215556A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042915A (zh) * 2022-09-30 2023-05-02 成都中医药大学 一种氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "GeneFinder™ COVID-19 Plus RealAmp Kit", OSANG HEALTHCARE CO., LTD, XP055768566, Retrieved from the Internet <URL:https://www.fda.gov/media/137116/download> [retrieved on 20210125] *
LEE YOUNG-JAE: "Seegene achieves 10 million test exports of COVID-19 diagnostic reagent", 21 April 2020 (2020-04-21), XP009531527, Retrieved from the Internet <URL:https://www.doctorsnews.co.kr/news/articleView.html?idxno=134345> *
OSANG HEALTHCARE: "GeneFinder TM COVID-19 Plus RealAmp Kit CE-IVD", GENEFINDER, 17 March 2020 (2020-03-17), pages 1 - 21, XP055860433, Retrieved from the Internet <URL:https://cdn2.hubspot.net/hubfs/7408315/COVID19/2-OSANG%20GeneFinder%20Sales%20Material/OHC_COVID19_MD_kit_INTRODUCTION.pdf> [retrieved on 20211111] *
RAO ARUNDHATI, WOLK DONNA M, GOLDSTEIN D Y, WOLF LESLIE A, SCOTT BAYLOR, HEALTH WHITE: "Development and Evaluation of Two SARS-CoV-2 RT-PCR Laboratory Developed Tests on the ARIES ® Automated, Sample-to-Answer, Real-Time PCR System", 1 March 2020 (2020-03-01), pages 1 - 9, XP055855620, Retrieved from the Internet <URL:https://www.researchgate.net/profile/D-Goldstein/publication/341134237_Development_and_Evaluation_of_Two_SARS-CoV-2_RT-PCR_Laboratory_Developed_Tests_on_the_ARIES_R_Automated_Sample-to-Answer_Real-Time_PCR_System/links/5eb05ca645851592d6b8bcc8/Development-and-Evaluation-of-Two-SARS-CoV-2-RT-PCR-Laboratory-Developed-Tests-on-the-ARIES-R-Automated-Sample-to-Answer-Real-Time-PCR-System.pdf> [retrieved on 20211027] *
VICTOR M CORMAN, OLFERT LANDT, MARCO KAISER, RICHARD MOLENKAMP, ADAM MEIJER, DANIEL KW CHU, TOBIAS BLEICKER, SEBASTIAN BRüNIN: "Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR", EUROSURVEILLANCE, vol. 25, no. 3, 23 January 2020 (2020-01-23), FR , XP055695049, ISSN: 1560-7917, DOI: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045 *
WANG CHANGTAI: "The establishment of reference sequence for SARS-CoV-2 and variation analysis", JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY, vol. 92, no. 6, 13 March 2020 (2020-03-13), pages 667 - 674, XP055860448 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042915A (zh) * 2022-09-30 2023-05-02 成都中医药大学 一种氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法
CN116042915B (zh) * 2022-09-30 2023-11-17 成都中医药大学 一种氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230147691A1 (en) 2023-05-11
KR20230002017A (ko) 2023-01-05
US11976338B2 (en) 2024-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111118228B (zh) 一种用于新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其使用方法
WO2012112012A2 (ko) 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트
CN112063756B (zh) 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
CN113817868A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒及其变异株的引物、探针组合物及试剂盒
CN113652505B (zh) 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒
CN113046485A (zh) 一种人腺病毒四重实时荧光pcr检测引物、探针、试剂盒及检测方法
WO2021177773A2 (ko) Sars-cov-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 sars-cov-2의 진단방법
WO2014010806A1 (ko) 아이피-10 엠 알엔에이 표적 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트
WO2021215556A1 (ko) 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법
WO2012002597A1 (ko) Β형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 β형 간염 바이러스 진단 방법
KR20210113932A (ko) 신종 코로나바이러스 검출용 고감도 다중 루프매개등온증폭 프라이머 세트
KR20230062511A (ko) 코로나바이러스-19 검출용 조성물 및 이의 검출용 키트
WO2012148024A1 (ko) 신종 인플루엔자 α형 η１ｎ１의 타미플루 내성 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 진단 방법
WO2022211238A1 (ko) 치료 효율 모니터링을 위한 16s rrna 기반 결핵 분자진단 방법 및 그 응용
WO2021141179A1 (ko) 뎅기 바이러스의 4종류 혈청형 동시 검출용 올리고뉴클레오티드 및 플라스미드와 이를 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 분석 방법
WO2012002598A1 (ko) 결핵 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 결핵 진단 방법
WO2021194172A1 (ko) 신규한 가이드 rna 및 이를 이용한 코로나바이러스감염증 2019를 진단하는 방법
WO2021075912A1 (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
WO2021182850A1 (ko) Mirna 동시 다중 검출 방법 및 이를 이용한 mirna 검출용 키트
KR20220040834A (ko) 분자 비콘 프로브를 포함하는 covid-19 진단 멀티플렉스 lamp 조성물
CN111549175A (zh) 一种检测口岸输入2019新型冠状病毒多重荧光rt-pcr检测试剂
CN114807432B (zh) 快速检测新型冠状病毒及其Delta突变株的试剂盒和方法
CN114262758B (zh) 检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法
KR102189576B1 (ko) 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 에볼라 바이러스의 검출방법
WO2022177066A1 (ko) 유전자가위 기반 인플루엔자 바이러스 타입의 신속 검출

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20932749

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20932749

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1