WO2012112012A2 - 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트 - Google Patents

호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a kit for simultaneous diagnosis of a disease caused by a respiratory virus, and more particularly, to a method for diagnosing a disease caused by a respiratory virus by detecting a gene specific to a causative virus causing a respiratory disease.
  • the present invention relates to a primer set for diagnosing a disease caused by a respiratory virus, a composition for diagnosing a disease due to a respiratory virus comprising the primer set, and a kit for co-diagnosis of a disease due to a respiratory virus comprising the composition.
  • Respiratory viruses are the leading cause of acute respiratory infections and are the most common diseases regardless of age or gender. In particular, infants and the elderly, people with reduced cardiopulmonary function and immune function are known to cause sequelae and death. Diseases associated with respiratory viruses most often begin with cold symptoms, ranging from pharyngitis, exacerbation of chronic asthma, and pneumonia. Early diagnosis of these respiratory viruses can prevent the abuse of unnecessary antibiotics, and early detection of the type of virus can provide appropriate patient care.
  • Diagnostic methods of such respiratory viruses include traditional cell culture, rapid cell culture, rapid antigen non-immunofluorescence, rapid antigen immunofluorescence, and molecular diagnostics using electrophoresis.
  • cell culture method which is the standard test method, it takes more than 5-9 days to confirm the test result, it is difficult for early diagnosis and treatment of respiratory virus infection.
  • Sensitivity such as R-mix virus culture, which is similar to the traditional culture, is being implemented, but also shows limitations in early diagnosis and treatment.
  • the rapid antigen non-immunofluorescence test can confirm the results in a short time, but the sensitivity is lower than that of the traditional culture method, and there are many disadvantages of false negatives.
  • the molecular diagnosis method using the electrophoresis method the sensitivity problem has been solved. Problems can occur and take a long time.
  • each primer set capable of amplifying genes specific for 14 viruses and Probes were developed, and when using the primer sets and probes developed above, it was confirmed that 14 types of respiratory viruses can be diagnosed simultaneously with high sensitivity and specificity, and thus, the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide a method for diagnosing a disease caused by a respiratory virus by detecting a gene specific for a causative virus causing a respiratory disease.
  • Another object of the present invention is to provide a primer set for diagnosing diseases caused by the respiratory virus used in the method.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing a disease due to a respiratory virus comprising the primer set.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for simultaneous diagnosis of a disease caused by a respiratory virus comprising the composition.
  • the present invention provides a primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1-14 and 17-33, so that the respiratory virus can be infected.
  • diagnosis of the present invention means confirming a pathological state.
  • diagnosis is to confirm the presence or absence of expression of genes specific to various existing respiratory viruses to confirm the onset of diseases caused by the respiratory virus and the prognosis in the antiviral drug treatment process after the onset.
  • the term "primer” refers to a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and is the starting point for template strand copying. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different deoxynucleoside triphospates (dNTPs) at appropriate buffers and temperatures. According to the invention, the primer is preferably composed of each of the forward and reverse nucleic acids having 10 to 30 base sequences.
  • the primer may amplify a gene specific for the respiratory virus through a polymerase chain reaction so as to check whether the respiratory virus is infected.
  • the respiratory virus is not particularly limited thereto, but the corona virus 229E and corona may be amplified.
  • Virus OC43 Corona Virus NL63, Influenza A Virus, Influenza B Virus, Parainfluenza Virus 1, Parainfluenza Virus 2 Parainfluenza Virus 2), Parainfluenza Virus 3, Rs Virus A (Respiratory Syncytial Virus A), Rs Virus B (Respiratory Syncytial Virus B), Adeno Virus, Rhinovirus A, B, C ( Rhino Virus A, B, C), Metatapneumovirus, Boca Virus, and the like.
  • Genes that can distinguish each respiratory virus from other viruses are not particularly limited, but may include the nucleoprotein (N) gene of corona virus 229E and the nucleoprotein (N) gene of corona virus OC43.
  • polyprotein (1a) gene of corona virus NL63 polyprotein (1a) gene of corona virus NL63, matrix protein (M) gene of influenza A virus, hemeglutinin of influenza B virus Hemagglutinin (HA) gene, hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 1, hemagglutinin of parainfluenza virus 2 Hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene, hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 3, hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene, and Rs of virus A Fusion protein Fusion protein gene, fusion protein gene of Rs virus B, hexon protein gene of adenovirus, or 5'TR of rhinoviruses A, B, C, nucleus of metapneumovirus Protein (N) gene, nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene
  • the primer provided in the present invention is not particularly limited thereto, but may include a primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 capable of amplifying a nuclear protein (N) gene of corona virus 229E; A primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 capable of amplifying a nuclear protein (N) gene of corona virus OC43; A primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6 capable of amplifying the polyprotein (1a) gene of corona virus NL63; Primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 capable of amplifying the hemeglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 1; Primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10 capable of amplifying the hemeglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 2; Prim
  • the primers may incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers that serve as a starting point for DNA synthesis.
  • the primer nucleic acid sequences of the present invention may, if necessary, include a label that can be detected directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotopes (eg 32P), fluorescent molecules, chemical groups (eg biotin), and the like. have.
  • primers can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods.
  • nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art, preferably methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, various linkages (eg, methyl phosphonates, phosphates) Forster ester, phosphoramidate, carbamate, phosphorothioate, phosphorodithioate) and the like can be modified by a method such as, but is not particularly limited thereto.
  • the present invention provides a respiratory virus co-diagnostic composition comprising the primer set.
  • the respiratory virus co-diagnosis composition of the present invention comprises a primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 capable of amplifying the nuclear protein (N) gene of the above-described corona virus 229E; A primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 capable of amplifying a nuclear protein (N) gene of corona virus OC43; A primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6 capable of amplifying the polyprotein (1a) gene of corona virus NL63; Primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 capable of amplifying the hemeglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 1; Primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10 capable of amplifying the hemeglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 2;
  • composition may further comprise a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 to 40 and 42 to 52 to more effectively detect the specific gene of the respiratory virus.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases capable of specific binding with complementary nucleotide sequences. You can check the presence. Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes and the like. In addition, in order to perform real-time PCR, fluorescently labeled probes may be used. More specifically, in the case of using a TaqMan probe, oligonucleotide modified at 5 'end with fluorescent material and 3' end with quencher material is added to the PCR reaction solution.
  • real-time PCR using Cycling probe is a high sensitivity detection method consisting of a chimeric probe consisting of RNA and DNA and RNAse H. Again, the 5 'end of the probe is labeled with the fluorescent material and the 3' end with the quencher material.
  • the probe is not particularly limited thereto, but may be a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 capable of detecting a nuclear protein (N) gene of corona virus 229E, or a sequence capable of detecting a nuclear protein (N) gene of corona virus OC43 Probe having the nucleotide sequence of No.
  • a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 capable of detecting a gene a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38 capable of detecting a hemeglutinin-neuramidase (HN) gene of parainfluenza virus 2
  • Probe influenza, having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 capable of detecting hemeglutinin-neuramidase (HN) gene of parainfluenza virus 3
  • a primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 15 and 16 or a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 is added as an internal control primer targeting Human RNase P. It can be included as.
  • the probe provided in the present invention may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method, or other well-known methods.
  • Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art, preferably methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, various linkages (eg, methyl phosphonates, phosphates) Forster ester, phosphoramidate, carbamate, phosphorothioate, phosphorodithioate) and the like can be modified by a method such as, but is not particularly limited thereto.
  • the respiratory virus diagnostic composition of the present invention may further include not only the probe, but also a DNA polymerase for performing a polymerase chain reaction, but the DNA polymerase is not particularly limited thereto, and hot start Taq DNA polymerase is not limited thereto. Preference is given to using.
  • composition for diagnosing the respiratory virus of the present invention may use RNA extracted from a sample as a sample.
  • a reverse transcriptase polymerase chain reaction is additionally performed and the reaction product of the reverse transcription PCR reaction is used.
  • the composition may further include a reverse transcriptase for performing reverse transcriptase polymerase chain reaction in addition to the probe and DNA polymerase.
  • the present invention provides a respiratory virus simultaneous diagnostic kit comprising the primer set or composition.
  • the respiratory virus diagnostic kit of the present invention may be used to simultaneously diagnose two or more of the respiratory viruses described above, including two or more of the above primer sets, or including the composition, similarly to the respiratory virus diagnostic composition described above.
  • kits of the present invention may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the diagnostic kit of the present invention from each primer pair specific for the detection gene, from RNA, a gene of the respiratory virus which is a component necessary for performing reverse transcription and real-time multiplex PCR.
  • Reverse transcriptase to synthesize complementary cDNA DNA polymerase to amplify complementary DNA, tubes or other suitable containers, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), hot start Taq-polymers
  • reaction buffers pH and magnesium concentrations vary
  • dNTPs deoxynucleotides
  • hot start Taq-polymers It may be a kit for simultaneous diagnosis of respiratory virus, further comprising enzymes such as lyase and reverse transcript, DNase, RNase inhibitor, DEPC-water, sterile water, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the present invention provides a method for diagnosing a disease caused by a respiratory virus or a method for providing information for diagnosing a disease caused by a respiratory virus using the composition or kit.
  • the method for diagnosing a disease caused by the respiratory virus of the present invention comprises the steps of: (i) mixing the primers, the probes, DNA polymerase and reverse transcriptase to obtain a reaction mixture; (ii) adding DNA or RNA obtained from the sample to the reaction mixture to sequentially perform reverse transcription and real time PCR reactions to obtain a reaction product; And (iii) analyzing the reaction product to simultaneously detect 1 to 14 of the causal viruses.
  • the respiratory virus is not particularly limited to this, Corona virus 229E, Corona virus OC43, Corona virus NL63, Influenza A virus, Influenza B virus, Parainfluenza virus 1, Parainfluenza virus 2, Parainfluenza virus 3, Rs virus A , Rs virus B, adenovirus, rhinovirus A, B, C, metapneumovirus, boca virus and the like are preferably used.
  • sample refers to acupuncture or sputum (Nasopharyngeal swabs (NPS), Nasla swabs (NS), Throat swabs (TS)), which differ in expression levels of genes specific for each virus by various respiratory viral infections. Samples such as, but not limited to, nasal aspirates (NA)).
  • the respiratory virus diagnostic primer set of the present invention it is possible to diagnose the respiratory disease caused by these viruses by simultaneously detecting 14 kinds of respiratory viruses in one reaction through real-time multiple reverse transcription polymerase chain reaction. It may be widely used for the diagnosis and treatment of rapid respiratory diseases.
  • NPS Nesopharyngeal swabs
  • NS Nasal swabs
  • TS Throat swabs
  • NA Nasal aspirates
  • the present inventors have primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, which can amplify the nuclear protein (N) gene of corona virus 229E, and SEQ ID NOs: 3 and 4, which can amplify the nuclear protein (N) gene of corona virus OC43.
  • Primer having a nucleotide sequence of primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 5 and 6 that can amplify the polyprotein (1a) gene of corona virus NL63, heme glutinin-neuramidase of parainfluenza virus 1 (HN ) SEQ ID NOs: 9 and 10, which can amplify a primer capable of amplifying the genes of SEQ ID NOs: 7 and 8, and SEQ ID NOs: 9 and 10, which can amplify the hemeglutinin-neuramidase (HN) gene of parainfluenza virus 2.
  • Primer having a base sequence of SEQ ID NOs: 11 and 12 capable of amplifying the hemeglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 3 Determination of primers, primers with nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14, which can amplify the substrate protein (M) gene of influenza A virus, and internal controls targeting RNase P, provide a criterion for the effectiveness of RNA extraction.
  • HN hemeglutinin-neuraminidase
  • Primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 and 16 primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17 and 18, which can amplify the hemeglutinin (HA) gene of influenza B virus, and a fusion protein gene of Rs virus
  • Primers having base sequences of SEQ ID NOs: 25 and 26, 5'UTR of rhinoviruses A, B, C Primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 27 and 31 which can be amplified, primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 23 and 24, which can amplify the nuclear protein (N) gene of metapneumovirus, and nucleocapsid protein (NP) ) and primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 32 and 33 capable of amplifying the Viral protein (VP) gene were constructed using conventional methods, respectively (see Table 1).
  • the inventors of the present invention provide a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 capable of detecting a nuclear protein (N) gene of corona virus 229E, and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 capable of detecting a nuclear protein (N) gene of corona virus OC43.
  • a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36 capable of detecting a polyprotein (1a) gene of corona virus NL63, and a hemeglutinin-neuraminidase (HN) gene of parainfluenza virus 1 can be detected.
  • Probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 capable of detecting agglutinin-neuramidase (HN) gene, substrate protein of influenza A virus (M) a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40 capable of detecting a gene, a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 capable of detecting RNase P as an internal control, a hemeglutinin (HA) of influenza B virus
  • the reagents in Table 3 below were prepared. They were thawed by standing at room temperature before use, and preferably at least 30 minutes at room temperature.
  • PIV3 primer / probe mix (Cy5) 7-8, 379-10, 3810-11, 39 4 Primer / probe Mixture3 Influenza Virus / RNase P primer / probe mix1. Influenza A pirmer / probe mix (FAM) 2. RNase P primer / probe mix (HEX) 3. Influenza B primer / probe mix (Cy5) 13-14, 4015-16, 4117-18, 42 5 Primer / probe Mixture4 Respiratory syncytial Virus (RSV) primer / probe mix1. RSV A primer / probe mix (FAM) 2.
  • RSV Respiratory syncytial Virus
  • RSV B primer / probe mix (Cy5) 3.Metapneumovirus primer / probe mix (HEX) 19-20, 4321-22, 4423-24, 45 6 Primer / probe Mixture 5 Adeno Virus / Rhino Virus primer probe mix1. Adeno Virus primer / probe mix (FAM) 2. Rhino Virus A, B, C primer / probe mix (HEX) 3. Boca Virus primer / probe mix (Cy5) 25-26, 46-4927-31, 50-5132-33, 52 7 Positive Control Positive control containing 12 types of Respiratory Virus, RNase P primer / probe binding sequences 8 Negative Control Negative control containing RNase P primer / probe binding sequences
  • Nasopharyngeal aspirates or swab samples Nasopharyngeal swabs (NPS), Nasal swabs (NS), Throat swabs (TS), Nasal aspirates (NA) were used.
  • RNA was extracted from the sample prepared in Example 2-2 using an RNA extraction kit.
  • a 200 ⁇ l PCR tube in which 10 ⁇ l of RT-PCR Premix was dispensed was prepared by adding the sample, the positive control solution, and the negative control solution.
  • 5 ⁇ l of the RVP primer / probe mixture and 5 ⁇ l of the extracted sample or positive and negative control solution were added to each RT-PCR Premix tube which was pre-dispensed (see Table 4).
  • the PCR reaction result was measured in real time by a real-time PCR detection system, and after completion of the reaction, a cut-off value (device name: SLAN, FAM: 0.06, HEX: 0.06, CY5: 0.04) was input.
  • the Ct value (threshold cycle) when the control group reacted was as follows (see Tables 6 and 7), and the Ct value of the sample was determined for each item (FAM, HEX, and CY5). All were determined positive when they were 37 or less (see Tables 6 and 7).
  • the Ct value of the positive control should be within the range of 30 ⁇ 3 for each wavelength, and in the case of the negative control, only the internal control RNase P showed the Ct value, and the remaining respiratory viruses had a Ct value. It was found that the result was valid if No Ct was found.
  • Table 8 is a result analysis table for each type representing the determination of yin and yang of respiratory virus. For example, if the primer probe mixture 1 is used and the Ct value is less than 37 (positive) only in the FAM item, it means that it is infected with coronavirus 229E. In addition, the retest in the table means that the internal control was not detected and must be retested.

Abstract

호흡기 질환을 유발하는 원인 바이러스에 특이적인 유전자를 검출함으로써 호흡기 바이러스로 인한 질환을 진단하는 방법, 상기 방법에 사용되는 호흡기 바이러스로 인한 질환 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환 동시진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하면, 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 1번의 반응만으로 14종의 호흡기 바이러스를 동시에 검출하여 이들 바이러스에 의한 호흡기 질환의 발병여부를 진단할 수 있으므로, 보다 신속한 호흡기 질환의 진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트
본 발명은 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 호흡기 질환을 유발하는 원인 바이러스에 특이적인 유전자를 검출함으로써 호흡기 바이러스로 인한 질환을 진단하는 방법, 상기 방법에 사용되는 호흡기 바이러스로 인한 질환 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환 동시진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트에 관한 것이다.
호흡기 바이러스는 급성 호흡기 감염의 주요 원인이며, 나이나 성별에 관계없이 가장 흔한 질병이라 할 수 있다. 특히 영아나 노인, 심폐기능과 면역기능이 저하된 사람들의 경우 후유증을 유발하여 사망에 이를 수 있는 것으로 알려져 있다. 호흡기 바이러스와 관련된 질환은 가장 흔하게는 감기 증상으로 시작하여, 인두염, 만성 천식의 악화, 폐렴에 이르기까지 다양하다. 이런 호흡기 바이러스를 조기에 진단하게 되면 불필요한 항생제의 남용을 예방할 수 있고, 바이러스의 유형을 조기에 발견하여 적절한 환자 치료를 수행할 수 있는 장점이 있다.
이러한 호흡기 바이러스의 진단방법은 전통세포배양법, 신속세포배양법, 신속 항원 비면역형광검사법, 신속 항원면역형광검사법, 전기영동방식을 이용한 분자진단법 등이 있다. 현재 표준 검사법인 세포 배양법의 경우는 검사결과를 확인하는데 5~9일 이상이 소요되어 호흡기 바이러스 감염의 조기 진단과 치료에 어려움이 있으며, 이런 단점을 보안하기 위해 24~72시간 내에 결과를 확인하면서 민감도는 전통 배양법과 비슷한 R-mix 바이러스 배양법 등이 시행되고 있지만 역시 조기 진단과 치료에는 한계를 보이고 있다. 신속 항원 비면역형광검사법은 빠른 시간에 결과를 확인할 수 있지만 민감도가 전통 배양법 보다 낮아 위음성이 많은 단점이 있고, 전기영동 방식을 이용한 분자진단법의 경우는 민감도 문제는 해결했으나, 2 단계로 진행되어 오염의 문제가 발생할 수 있고, 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 민감도, 오염 및 장시간이 소요되는 호흡기 바이러스 진단법의 문제점을 극복할 수 있는 방법을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 14종의 바이러스에 특이적인 유전자를 증폭할 수 있는 각 프라이머 세트 및 프로브를 개발하고, 상기 개발된 각 프라이머 세트 및 프로브를 사용할 경우 높은 민감도와 특이도로 14종의 호흡기 바이러스를 동시에 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 호흡기 질환을 유발하는 원인 바이러스에 특이적인 유전자를 검출함으로써 호흡기 바이러스로 인한 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 호흡기 바이러스로 인한 질환 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환 동시진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있도록, 서열번호 1-14 및 17-33의 염기서열을 포함하는 프라이머를 제공한다.
본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 기존의 다양한 호흡기 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 유무를 확인하여 호흡기 바이러스에 의해 야기되는 질병의 발병 여부 및 발병 후 항바이러스 약제 치료과정에서의 예후를 확인하는 것이다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면, 상기 프라이머는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 각각의 정방향 및 역방향의 핵산으로 구성됨이 바람직하다.
상기 프라이머는 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있도록 호흡기 바이러스에 특이적인 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시킬 수 있는데, 상기 호흡기 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E(Corona Virus 229E), 코로나 바이러스 OC43(Corona Virus OC43), 코로나 바이러스 NL63(Corona Virus NL63), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A Virus), 인플루엔자 B 바이러스(Influenza B Virus), 파라인플루엔자 바이러스 1(Parainfluenza Virus 1), 파라인플루엔자 바이러스 2(Parainfluenza Virus 2), 파라인플루엔자 바이러스 3( Parainfluenza Virus 3), Rs 바이러스 A(Respiratory Syncytial Virus A), Rs 바이러스 B(Respiratory Syncytial Virus B), 아데노 바이러스(Adeno Virus), 라이노 바이러스 A, B, C(Rhino Virus A, B, C), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 보카바이러스(Boca Virus) 등을 들 수 있고, 상기 각 호흡기 바이러스를 다른 바이러스와 구별시킬 수 있는 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자(nucleoprotein (N) gene), 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자(nucleoprotein (N) gene), 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자(polyprotein (1a) gene), 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자(matrix protein (M) gene), 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자(hemagglutinin (HA) gene), 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자(hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene), 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자(hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene), 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자 (hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene), Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자(fusion protein gene), Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자(fusion protein gene), 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자(hexon protein gene), 또는 라이노 바이러스 A, B, C의 5'TR, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자(nucleoprotein (N) gene), 보카 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 유전자(nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 제공하는 프라이머는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머; 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 프라이머; 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 갖는 프라이머; 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머; 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머; 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머; 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머; 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 갖는 프라이머; Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 19 및 20의 염기서열을 갖는 프라이머; Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 프라이머; 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머; 라이노 바이러스 A, B, C의 5'UTR을 증폭시킬 수 있는 서열번호 27 내지 31의 염기서열을 갖는 프라이머; 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 23 및 24의 염기서열을 갖는 프라이머; 보카 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 32 및 33의 염기서열을 갖는 프라이머 등을 사용함이 바람직하다.
또한, 상기 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
아울러, 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있는데, 바람직하게는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 다양한 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)의 부가 등의 방법으로 변형시킬 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 바이러스 동시진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 호흡기 바이러스 동시진단용 조성물은 상술한 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머; 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 프라이머; 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 갖는 프라이머; 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머; 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머; 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머; 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머; 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 갖는 프라이머; Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 19 및 20의 염기서열을 갖는 프라이머; Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 프라이머; 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머; 라이노 바이러스 A, B, C의 5'UTR을 증폭시킬 수 있는 서열번호 27 내지 31의 염기서열을 갖는 프라이머; 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 23 및 24의 염기서열을 갖는 프라이머; 보카 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 32 및 33의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하고, 바람직하게는 상기 프라이머쌍으로 구성된 세트중에서 2이상을 포함하여, 상술한 호흡기 바이러스중에서 둘 이상을 동시에 진단하는데 사용할 수 있다.
상기 조성물은 호흡기 바이러스의 특이적인 유전자를 보다 효과적으로 검출할 수 있도록 서열번호 34 내지 40 및 제 42 내지 52의 염기서열을 가지는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 상보적인 염기서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 염기서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광표지된 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 quencher 물질로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응액에 첨가한다. 또한, Cycling 프로브를 이용한 실시간 PCR은 RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 프로브와 RNAse H로 구성된 고감도의 검출방법이다. 이 역시 프로브의 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 quencher 물질로 표식한다.
본 발명자들은 실시간 PCR을 수행하여 그 증폭 산물을 검출하는 경우에는 그 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 DNA 및 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 오염의 위험이 적음에 착안하여, 실시간 PCR 방법을 이용하여 호흡기 바이러스를 보다 효과적으로 진단하고자 형광표식 프로브를 제작하였다. 상기 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 34의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 35의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 36의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 37의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 38의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 39의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 40의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 42의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 43의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 44의 염기서열을 가지는 프로브, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 45의 염기서열을 가지는 프로브, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 46-49의 염기서열을 가지는 프로브, 라이노 바이러스 A, B, C의 5'UTR을 검출할 수 있는 서열번호 50-51의 염기서열을 가지는 프로브, 보카 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 유전자(nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene)을 검출할 수 있는 서열번호 52의 염기서열을 가지는 프로브 등을 사용함이 바람직하다.
또한, RNA 추출과정의 유효성에 대한 판단기준을 제공하기 위하여, Human RNase P를 표적으로 하는 내부대조군 프라이머로서 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머 또는 서열번호 41의 염기서열을 가지는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 상술한 프라이머와 동일하게, 본 발명에서 제공하는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있는데, 바람직하게는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 다양한 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)의 부가 등의 방법으로 변형시킬 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 조성물은 상기 프로브 뿐만 아니라, 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수도 있는데, 상기 DNA 중합효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, Hot start Taq DNA 중합효소를 사용함이 바람직하다.
또한, 본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 조성물은 시료에서 추출된 RNA를 시료로서 이용할 수도 있는데, 이처럼 RNA를 시료로서 이용하기 위하여는 역전사 중합효소 연쇄반응을 추가로 수행하고 상기 역전사 PCR 반응의 반응산물을 대상으로하여 호흡기 바이러스의 특이적인 유전자가 존재하는지의 여부를 확인하여야만 하므로, 상기 조성물은 상기 프로브와 DNA 중합효소 이외에도 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 역전사 효소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스 동시진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 키트는 상술한 호흡기 바이러스 진단용 조성물과 동일하게, 상기 프라이머 세트 중 둘 이상을 포함하거나 또는 상기 조성물을 포함하여, 상술한 호흡기 바이러스중에서 둘 이상을 동시에 진단하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 진단용 키트는, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 역전사 반응 및 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 구성요소인 호흡기 바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 표소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 추가로 포함하는, 호흡기 바이러스 동시 진단용 키트가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용한 호흡기 바이러스로 인한 질환의 진단방법 또는 호흡기 바이러스로 인한 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 호흡기 바이러스로 인한 질환의 진단방법은 (i) 상기 프라이머, 상기 프로브, DNA 중합 효소 및 역전사 효소를 혼합하여 반응 혼합물을 수득하는 단계; (ii) 상기 반응 혼합물에 검체로부터 수득한 DNA 또는 RNA를 가하여, 역전사 반응 및 실시간 PCR 반응을 순차적으로 수행하여 반응산물을 수득하는 단계; 및, (iii) 상기 반응산물을 분석하여 1 내지 14종의 상기 원인 바이러스를 동시에 검출하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 호흡기 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E, 코로나 바이러스 OC43, 코로나 바이러스 NL63, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1, 파라인플루엔자 바이러스 2, 파라인플루엔자 바이러스 3, Rs 바이러스 A, Rs 바이러스 B, 아데노 바이러스, 라이노 바이러스 A, B, C, 메타뉴모바이러스, 보카 바이러스 등을 사용함이 바람직하다.
본 발명의 용어 "검체"란, 다양한 호흡기 바이러스 감염에 의해 상기 각 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 수준이 차이 나는 침 또는 가래(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasla swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA))와 같은 시료를 포함하나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하면, 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 1번의 반응만으로 14종의 호흡기 바이러스를 동시에 검출하여 이들 바이러스에 의한 호흡기 질환의 발병여부를 진단할 수 있으므로, 보다 신속한 호흡기 질환의 진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 호흡기 바이러스 특이적인 프라이머 및 프로브의 제작
비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasal swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA)) 를 대상으로 호흡기 바이러스 14종의 검출 및 구분을 수행하기 위한 프라이머 및 프로브를 제작하였다.
실시예 1-1 : 호흡기 바이러스 특이적인 프라이머의 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 가지는 프라이머, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 가지는 프라이머, RNase P를 표적으로 하는 내부 대조군으로서 RNA 추출과정의 유효성에 대한 판단기준을 제공하는 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 프라이머, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 프라이머, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 프라이머, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 프라이머, 라이노 바이러스 A, B, C의 5’UTR을 증폭시킬 수 있는 서열번호 27 및 31의 염기서열을 가지는 프라이머, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 프라이머, 보카 바이러스의 nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene을 증폭시킬 수 있는 서열번호 32 및 33의 염기서열을 가지는 프라이머를 통상의 방법을 이용하여 각각 작제하였다(참조: 표 1).
표 1 프라이머의 염기서열
이름 염기서열 길이 서열번호
229E-F CAGTCAAATGGGCTGATGCA 20 1
229E-R AAAGGGCTATAAAGAGAATAAGGTATTCT 29 2
OC43-F AYGAGGCTATTCCGACTAGGT 21 3
OC43-R CTTCCTGAGCCTTCAATATAGTAACC 26 4
NL63-F ACGTACTTCTATTATGAAGCATGATATTAA 30 5
NL63-R AGCAGATTTAATGTTATACTTAAAACTACG 30 6
PIV1-F GTTGTCAATGTCTTAATYCGTATCAATAATT 31 7
PIV1-R TAGCCTMCCYTCGGCACCTAA 21 8
PIV2-F TTTCCAATYTTCAGGACTATGAA 25 9
PIV2-R TCCTGGTATRGCAGTGACTGAA 26 10
PIV3-2-F CAGGATATAGGAAAATCATATCAAGT 26 11
PIV3-2-R ACATGACTTYCTATTGTCATTTATGTT 27 12
IfA-F AGACCAATYYTGTCACCTCT 20 13
IfA-R TGGACAAAKCGTCTACGCT 19 14
RNaseP-F AGATTTGGACCTGCGAGCG 19 15
RNaseP-R GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 20 16
IfB-F AARTACGGTGGATTAAAYAAAAGCAA 26 17
IfB-R AATAGTTTTGCAGGMGGTCTATATTTGG 28 18
RSV A-1-F ATTGTTATCATTAATTGCTGTTGGA 25 19
RSV A-1-R CTAAATGCAATATTATTTATACCACTCAG 29 20
RSV B-1-F TGCAGTRACAGAATTACAGCTACTT 25 21
RSV B-1-R TTAGTGGTATTGATTGTRTAGTTCA 25 22
MPV-2-F TCATCAGGYAAYATYCCACA 20 23
MPV-2-R ACTTCTATDGTTGATGCTAGYTT 23 24
AdV-F CACNGTGGGGTTTCTRAACTT 21 25
AdV-R CARTGGKCWTACATGCAYATC 21 26
RV-1-F TGTGAAGAGCCSCRTGTG 18 27
RV-2-F TGTGAAGACTCGCATGTGCT 20 28
RV-3-F GTGYGAAGAGYCTANTGTGCT 21 29
RV-R GGACRCCCAAAGTAGTYGGTYC 22 30
RV-2-R GGACAYCCAAAGTAGTYGGTYC 22 31
BoV-1-F GAAATGCTTTCTGCTGYTGAAAG 23 32
BoV-1-R GGTTCACCGTTWTCAAGWGGATT 23 33
실시예 1-2 : 호흡기 바이러스 특이적인 프로브의 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 34의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 35의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 36의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 37의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 38의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 39의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 40의 염기서열을 가지는 프로브, 내부 대조군으로서 RNase P를 검출할 수 있는 서열번호 41의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 42의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 43의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 44의 염기서열을 가지는 프로브, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 45의 염기서열을 가지는 프로브, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 46 내지 49의 염기서열을 가지는 프로브, 라이노 바이러스 A, B, C의 5'UTR을 검출할 수 있는 서열번호 50 및 51의 염기서열을 가지는 프로브, 보카바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 52의 염기서열을 가지는 프로브를, 통상의 방법을 이용하여 각각 제작하였다(참조: 표 2).
표 2 프로브의 염기서열
이름 5 염기서열 3 길이 서열번호
229E-P-rev FAM CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA TAMRA 24 34
OC43-P HEX CGCCTGGCACGGTACTCCCTC TAMRA 21 35
NL63-P Cy5 ATTGCCAAGGCTCCTAAACGTACAGGTGTT BHQ3 30 36
PIV1-P FAM AGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACWATTCCAAT TAMRA 32 37
PIV2-P HEX CYATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAA TAMRA 31 38
PIV3-2-P Cy5 CAGACTTGGTACCTGACTTAAATCCYAGGA BHQ3 30 39
IfA-P FAM ACGCTCACCGTGCCCAGT TAMRA 18 40
RNaseP-P HEX TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG TAMRA 23 41
IfB-P Cy5 TGCAAARGCMATAGGRAATTGCCCA BHQ3 25 42
RSV A-1-P FAM CTGTAAGGCCAGAAGCACACCARTCACAC TAMRA 29 43
RSV B-1-P Cy5 CGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTA BHQ3 26 44
MPV-2-P HEX CAGAGRCCYTCAGCACCAGACACAC TAMRA 25 45
AdV-1-P FAM TGCACCAGCCCGGGGCTCAGGTACT TAMRA 25 46
AdV-2-P FAM TGCACCAGACCSGGACTCAGGTACT TAMRA 25 47
AdV-3-P FAM TGCACCAGGCCCGGGCTCAGRTACT TAMRA 25 48
AdV-4-P FAM TGCACCAGCCCGGKACTCAGGTAYT TAMRA 25 49
RV-P HEX CCGGCCCCTGAATGYGGCTAAYC TAMRA 23 50
RV-2-P HEX CCGGCYCCYGAATGTGGCTAACC TAMRA 23 51
BoV-1-P Cy5 CCTRGAGGGTGGGTGCTKCCT BHQ3 21 52
실시예 2 : 호흡기 바이러스 진단
실시예 2-1 : 필요 용액의 준비
하기 표 3의 시약을 준비하였다. 이들은 사용 전에 상온에 방치하여 해동시켰으며, 상온에서 30분 이상 방치하지 않는 것이 바람직하다.
표 3 구성물 및 구성성분
번호 구성 구성성분 서열번호
1 RT-PCR Premix One-step RT-PCR premix
2 프라이머/프로브 혼합액1(primer/probe Mixture1) Corona Virus primer/probe mix1. 229E primer probe mix (FAM)2. OC43 primer probe mix (HEX)3. NL63 primer probe mix (Cy5) 1-2, 343-4, 355-6, 36
3 프라이머/프로브 혼합액2(primer/probe Mixture2) Parainfluenza Virus (PIV)primer/probe mix1. PIV1 primer/probe mix (FAM)2. PIV2 primer/probe mix (HEX)3. PIV3 primer/probe mix (Cy5) 7-8, 379-10, 3810-11, 39
4 프라이머/프로브 혼합액3(primer/probe Mixture3) Influenza Virus/ RNase P primer/probe mix1. Influenza A pirmer/probe mix (FAM)2. RNase P primer/probe mix (HEX)3. Influenza B primer/probe mix (Cy5) 13-14, 4015-16, 4117-18, 42
5 프라이머/프로브 혼합액4(primer/probe Mixture4) Respiratory syncytial Virus (RSV) primer/probe mix1. RSV A primer/probe mix (FAM)2. RSV B primer/probe mix (Cy5)3.Metapneumovirus primer/probe mix (HEX) 19-20, 4321-22, 4423-24, 45
6 프라이머/프로브 혼합액5(primer/probe Mixture5) Adeno Virus / Rhino Virus primer probe mix1. Adeno Virus primer/probe mix (FAM)2. Rhino Virus A,B,C primer/probe mix (HEX)3. Boca Virus primer/probe mix (Cy5) 25-26, 46-4927-31, 50-5132-33, 52
7 양성대조액(Positive Control) Positive control containing 12 types of Respiratory Virus, RNase P primer/probe binding sequences
8 음성대조액(Negative Control) Negative control containing RNase P primer/probe binding sequences
실시예 2-2 : 검체의 준비
비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasal swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA))를 사용하였다.
실시예 2-3 : 호흡기 바이러스 진단방법
상기 실시예 2-2에서 준비된 검체에서 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다. RT-PCR Premix가 10㎕씩 분주되어 있는 200㎕ PCR 튜브를 시료와 양성대조액, 음성대조액을 더한 수 만큼 준비하였다. 미리 분주되어 제공된 각 RT-PCR Premix 튜브에 RVP 프라이머/프로브 혼합액 5㎕와 추출한 시료 혹은 양성, 음성대조액을 5㎕씩 첨가하였다(참조: 표 4).
표 4 검체 및 구성물
검체 및 구성물명 1 테스트당 사용량(㎕)
RT-PCR Premix 10
RV 프라이머/프로브 혼합액 5
투입검체양 추출한 시료, 양성대조액 또는 음성대조액 5
합 계 20
뚜껑을 닫고 원심분리 한 후 잘 섞어 주었다. 원심분리한 후 실시간 PCR 싸이클러(real-time PCR cycler)에 넣어 반응을 진행하였다. 구체적인 실시간 PCR 반응 조건은 하기와 같다(참조: 표 5).
표 5 실시간 PCR 반응 조건
진행 온도 시간 반복 회수(회)
Reverse-transcription Step 1 45℃ 10분 1회
Step 2 94℃ 5분
PCR 반응 Step 3 94℃ 5초 40회(* Signal detection 반응 구간)
Step 4 53℃ 30초
Step 5* 72℃ 30초
PCR반응 결과는 real-time PCR detection system에 의해 실시간으로 측정하고, 반응이 완료된 후에 한계값(Cut-off value)(기기명: SLAN, FAM: 0.06, HEX: 0.06, CY5: 0.04)을 입력하였다.
실시예 2-4 : 결과 판정
(1) 각 대조군 별 Ct값
대조군을 대상으로 반응하였을 때의 Ct값(threshold cycle : 한계값을 통과하는 사이클 수)은 다음과 같고(참조: 표 6 및 표 7), 시료의 Ct값이 각 항목(FAM, HEX 및 CY5) 모두 37 이하인 경우에 양성으로 판정하였다(참조: 표 6 및 표 7).
표 6 양성대조액의 판정기준
양성대조액 FAM HEX CY5
프라이머/프로브 혼합액1 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액2 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액3 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액4 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액5 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
표 7 음성대조액의 판정기준
음성대조액 FAM HEX CY5
프라이머/프로브 혼합액1 No Ct No Ct No Ct
프라이머/프로브 혼합액2 No Ct No Ct No Ct
프라이머/프로브 혼합액3 No Ct 30 ± 3 No Ct
프라이머/프로브 혼합액4 No Ct No Ct No Ct
프라이머/프로브 혼합액5 No Ct No Ct No Ct
상기 표 6 및 7에서 보듯이, 양성대조액의 경우 Ct값이 각 파장별로 30 ± 3의 범위내에 들어와야 하고, 음성대조액의 경우는 인터널 컨드롤인 RNase P만 Ct값이 나타나고 나머지 호흡기 바이러스들은 Ct값이 나오지 않아야(No Ct) 결과가 유효함을 알 수 있었다.
(2) 결과 분석
각 반응별로 FAM, HEX, CY5 파장의 시그널 형성을 확인하여 다음 표와 같이 반응 유효성과 양성, 음성을 분석하였다(참조: 표 8).
표 8 반응 유효성 및 양성과 음성의 분석기준
항목 FAM HEX CY5 결과 해석
프라이머 프로브 혼합액 1 + - - 229E
- + - OC43
- - + NL63
- - - Corona Virus 음성
프라이머 프로브 혼합액 2 + - - PIV1
- + - PIV2
- - + PIV3
- - - Parainfluenza Virus 음성
프라이머 프로브 혼합액 3 + + - Influenza A
- + + Influenza B
- + - Influenza A/B 음성
- - - 재시험
프라이머 프로브 혼합액 4 + - - RSV A
- - + RSV B
- - + Metapneumovirus
- - - RSV A/B/Metapneumovirus 음성
프라이머 프로브 혼합액 5 + - - Adeno Virus
- + - Rhino Virus A,B,C
- - + Boca Virus
- - - Adeno/Rhino/Boca Virus 음성
상기 표 8은 호흡기바이러스의 음양성 판단을 나타내는 각 유형별 결과 분석표이다. 예를 들어 프라이머프로브 혼합액 1을 사용하여 FAM 항목에서만 Ct값이 37보다 작은 숫자로 나올 경우(양성), 코로나바이러스 229E에 감염되었음을 의미한다. 아울럿, 상기 표에서 재시험으로 표시된 것은 인터널 컨트롤이 검출되지 않아, 다시 실험해야 한다는 것을 의미한다.

Claims (13)

  1. (i) 호흡기 질환이 발병하거나 또는 발병이 의심되는 개체에서 분리된 시료내의 DNA 또는 RNA를 서열번호 1 내지 14 및 17 내지 33의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 프라이머로 증폭시키는 단계; 및
    (ii) 코로나 바이러스 229E(Corona Virus 229E), 코로나 바이러스 OC43(Corona Virus OC43), 코로나 바이러스 NL63(Corona Virus NL63), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A Virus), 인플루엔자 B 바이러스(Influenza B Virus), 파라인플루엔자 바이러스 1(Parainfluenza Virus 1), 파라인플루엔자 바이러스 2(Parainfluenza Virus 2), 파라인플루엔자 바이러스 3(Parainfluenza Virus 3), Rs 바이러스 A(Respiratory Syncytial Virus A), Rs 바이러스 B(Respiratory Syncytial Virus B), 아데노 바이러스(Adeno Virus), 라이노 바이러스 A(Rhino Virus A), 라이노 바이러스 B, 라이노 바이러스 C, 메타뉴모 바이러스(Metapneumovirus) 및 보카 바이러스(Boca Virus)로 구성된 군으로 부터 선택되는 1종 이상의 바이러스를 각각 독립적으로 또는 동시에 검출하는 단계를 포함하는, 호흡기 바이러스로 인한 질환의 진단방법.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머는 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 특이적으로 증폭하고; 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 프라이머는 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 갖는 프라이머는 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 특이적으로 증폭하고; 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 갖는 프라이머는 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 9 또는 10의 염기서열을 갖는 프라이머는 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 특이적으로 증폭하고; 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 갖는 프라이머는 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 13 또는 14의 염기서열을 갖는 프라이머는 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 특이적으로 증폭하고; 서열번호 17 또는 18의 염기서열을 갖는 프라이머는 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 19 또는 20의 염기서열을 갖는 프라이머는 Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 특이적으로 증폭하고; 서열번호 21 또는 22의 염기서열을 갖는 프라이머는 Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 25 또는 26의 염기서열을 갖는 프라이머는 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 특이적으로 증폭하고; 서열번호 27 내지 31로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 프라이머는 라이노 바이러스 A, B, C의 5'UTR을 특이적으로 증폭하며; 서열번호 23 또는 24의 염기서열을 갖는 프라이머는 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 특이적으로 증폭하고; 및 서열번호 32 또는 33의 염기서열을 갖는 프라이머는 보카 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 유전자를 특이적으로 증폭하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    내부 대조군으로서 RNase P를 검출할 수 있는 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 유전자를 특이적으로 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유전자를 서열번호 34 내지 40 및 42 내지 52의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 프로브를 이용하여 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    내부 대조군으로서 RNase P를 검출할 수 있는 서열번호 41의 염기서열을 가지는 프로브를 이용하여 유전자를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (i) 단계는 1 내지 5개의 반응용기에서 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 침 또는 가래(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasla swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA))인 것인 방법.
  8. 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머 세트; 서열번호 27 내지 29의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머와 서열번호 30 및 31의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머의 조합으로 구성된 프라이머 세트; 및, 서열번호 32 및 33의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 구성된 그룹으로 선택되는 호흡기 바이러스로 인한 질환 진단용 프라이머 세트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 바이러스는 코로나 바이러스 229E(Corona Virus 229E), 코로나 바이러스 OC43(Corona Virus OC43), 코로나 바이러스 NL63(Corona Virus NL63), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A Virus), 인플루엔자 B 바이러스(Influenza B Virus), 파라인플루엔자 바이러스 1(Parainfluenza Virus 1), 파라인플루엔자 바이러스 2(Parainfluenza Virus 2), 파라인플루엔자 바이러스 3(Parainfluenza Virus 3), Rs 바이러스 A(Respiratory Syncytial Virus A), Rs 바이러스 B(Respiratory Syncytial Virus B), 아데노 바이러스(Adeno Virus), 라이노 바이러스 A(Rhino Virus A), 라이노 바이러스 B, 라이노 바이러스 C, 메타뉴모 바이러스(Metapneumovirus) 또는 보카 바이러스(Boca Virus)인 것인 프라이머 세트.
  10. 제8항의 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환 동시진단용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    서열번호 34 내지 40 및 제 42 내지 52의 염기서열로부터 선택되는 염기서열을 가지는 프로브를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    Hot start Taq DNA 중합효소 및 역전사 효소를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스로 인한 질환의 동시진단용 키트.
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