CN108504774B

CN108504774B - 一种检测鼻病毒分型和肠道病毒的方法

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Publication number: CN108504774B
Application number: CN201810158949.2A
Authority: CN
Inventors: 吴勇; 张�成; 余丁; 徐智
Original assignee: Ningbo Health Gene Technologies Co ltd
Current assignee: Ningbo Haier Shi Gene Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2038-02-26
Also published as: CN108504774A

Abstract

本发明提供了一种单管多重RT‑PCR快速检测HRV分型以及EV的方法，包括如下步骤：a)采集样本；b)从所述样本中提取核酸；c)将所提取的核酸加入到预混RT‑PCR试剂中；d)运行RT‑PCR扩增程序；e)对RT‑PCR扩增产物进行片段分析；其中，所述预混RT‑PCR试剂包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物。所述方法操作简单，时间短，最快4小时能出结果，通量高适用于临床检测以及科学研究。本方法检测的HRV病毒分型结果可以给临床医生指导用药，也可以用于鼻病毒感染的病理研究。

Description

一种检测鼻病毒分型和肠道病毒的方法

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体地涉及一种检测鼻病毒分型和肠道病毒的方法；更具体地，本发明涉及一种鉴定HRVA(鼻病毒A型)、HRVB(鼻病毒B型)、HRVC(鼻病毒C型)、EV(非鼻病毒的肠道病毒)的方法。

背景技术

鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV)原来属于微小病毒科鼻病毒属，2008年，国际病毒分类学委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses)删除鼻病毒属，并将原鼻病毒属下的鼻病毒A型(HRVA)和鼻病毒B型(HRVB)归属到肠道病毒属；2009年，在肠道病毒属加入鼻病毒C型(HRVC)。

HRV和EV(Enterovirus；此处及下文提及EV时均指非鼻病毒的肠道病毒)具有相同的形态结构和基因组结构，都是呈球形，直径为15—30nm。核衣壳呈20面体立体对称，无包膜。基因组是单链、正链RNA长约7500个核苷酸，其中只有一个读码框，长约6500个核苷酸。读码框的开读部位位于5′端611个核苷酸处，终止密码位于聚A尾前42个核苷酸处。病毒核心外有蛋白衣壳，无包膜。壳体由4种结构蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4组成，组合成相同的60个壳粒，呈20面体围绕着核心RNA。HRV是引起人类病毒性呼吸道感染的最常见病原体，Pelon在1956年首先发现第1株HRV，至今已发现超过120个血清型，是人类血清型最多的病毒。研究结果显示，成人约50％的感冒都是由HRV感染引起的，而儿童感冒有10％～25％是由HRV致病，HRV主要是引起上呼吸道感染，但是部分型别的HRV也会引起下呼吸道感染，特别是对婴幼儿、老年人以及免疫抑制的患者会导致很严重的疾病，给患者和社会造成很大的经济损失，因此一种简单、高效、准确、灵敏的HRV检测方法显得至关重要。

目前检测HRV的方法主要是有三大类：1、组织培养病毒分离：从鼻咽分泌物及咽拭子中分离病毒，标本置于输送培养基中，4℃保存，并在3h内接种于组织培养管。标本接种于原代人胚肾细胞、人胚肺成纤维细胞或猴肾细胞及HeLa细胞等。被感染的细胞经培养2～3d后出现病变。可用标准特异中和抗体在敏感组织及细胞中做中和试验和空斑形成试验，进行特异的血清型鉴定。组织培养病毒分离加上酸稳定试验是诊断HRV感染的经典方法，但其费时费力，大约需2周才能得到结果，因而其对临床治疗的指导价值有限。2、血清学检测：包括补体结合试验、血凝抑制试验、间接免疫荧光及酶联免疫试验等，用来检测HRV抗体。但由于缺乏合适的交叉反应抗原以覆盖众多HRV血清型，使得这些方法的应用受到很大限制。3、分子生物学检测：近来逆转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)的方法已广泛用于HRV的检测，其对HRV检测较组织培养更敏感更快捷(一般2d以内得到结果)。有研究提示，用组织培养病毒分离阳性的所有鼻咽分泌物标本的RT-PCR检测均阳性，而在部分培养阴性的标本用RT-PCR检测HRV仍为阳性。

对比三大类HRV检测的方法，我们不难看出分子生物学检测是目前最行之有效的方法。在分子遗传学方面，小RNA病毒根据在5’端非编码区的内部核糖体进入位点(IRES)进行广泛的分类。根据RNA二级结构和序列相似性的研究，小RNA病毒IRES元件可以被分为三个不同的类型(即，IRESI型、IRESII型和IRESIII型)。其中EV(柯萨奇病毒和脊髓灰质炎病毒)和HRV都属于IRESI型，目前的HRV和EV的RT-PCR检测方法基本都是根据IRES区域来进行引物设计的，优点是准确度和覆盖度高，不容易出现漏检，但弊病是不能将鼻病毒跟肠道病毒区分开来。人是EV的唯一自然寄主，病毒通过人与人之间的密切接触(通过手指、餐具和食物)传播扩散。感染者的咽部和肠中都有病毒存在，从粪中排病毒的时间较长，可持续几周。因此部分EV的感染者会被误诊为鼻病毒感染。

HRVA、HRVB、HRVC三种型别的基因和氨基酸结构存在差异：1)由于基因的缺失，HRVC的基因组比HRVA和HRVB都短；2)由于HRVC的VP1区的缺失和插入，最终使得HRVC连接受体的位点发生改变，从而推断HRVC连接的分子受体可能和HRVA、HRVB有所不同；3)HRV的VP1通常有一疏水性口袋样结构用来结合抗病毒药物，例如pleconaril。目前已知全部的HRVA是对pleconaril敏感的。而HRVB的VP1包含有152位的酪氨酸(Phe152)和191位的亮氨酸(Leu191)，使得疏水性口袋结构改变，因而HRVB对pleconaril是抵抗的。而可以确定的是HRV可以抵抗pleconaril的超过50％的效用来自于这个特点。HRVC的VP1包含Phe152，可能会使得HRVC对pleconaril是抵抗的。这些基因组及蛋白结构上的差异导致三种型别的HRV在致病性、传染性、感染症状、对药物的耐药性上都有差异。另外，由于HRV及EV是RNA病毒，突变率高，同型别不同株之间的基因组保守序列少，唯一的一个保守序列IRES区域又不具有亚型特异性，不能将HRVA、HRVB、HRVC及EV进行区分，目前还没有一个方便有效的方法来进行HRV分型，测序的方法可以用来HRV分型，但是成本高，操作复杂不利于大规模进行HRV分型。因此，一种准确高效的HRV分型和EV鉴定的方法有助于HRV不同型别之间的差异性研究，也有助于临床上对于不同HRV型别以及EV的诊断与治疗。

发明内容

本发明针对上述缺陷，基于引物复合扩增及毛细管电泳片段分析方法的技术，设计了特异性针对不同HRV型别以及特异性针对EV的引物，实现了单管一次PCR反应准确鉴定HRV分型以及EV。

具体地，本发明的第一方面提供了一种单管多重RT-PCR快速检测HRV分型以及EV的方法，包括如下步骤：

a)采集样本；

b)从所述样本中提取核酸；

c)将所提取的核酸加入到预混RT-PCR试剂中；

d)运行RT-PCR扩增程序；

e)对RT-PCR扩增产物进行片段分析；

其中，所述预混RT-PCR试剂包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物。

本发明的第二方面提供了一种快速检测HRV分型以及EV的试剂盒，其特征在于包括特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物。

本发明的第三方面提供了用于快速检测HRV分型以及EV的引物组，其特征在于包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物。

本发明的方法采用单管一次PCR反应能同时检测HRVA、HRVB、HRVC以及EV。本方法操作简单，时间短，最快4小时能出结果，通量高适用于临床检测以及科学研究。本方法检测的HRV病毒分型结果可以给临床医生指导用药，也可以用于鼻病毒感染的病理研究。

附图说明

根据以下参照附图进行详细描述，本发明的上述和其他特征和优点会变得更加清楚。

图1是C7659样本经本发明方法检测得到的毛细管电泳峰图。

图2是B8460样本经本发明方法检测得到的毛细管电泳峰图。

图3是C3604样本经本发明方法检测得到的毛细管电泳峰图。

图4是C5038样本经本发明方法检测得到的毛细管电泳峰图。

图5是C7659样本测序序列在NCBI上比对的结果截图。

图6是B8460样本测序序列在NCBI上比对的结果截图。

图7是C3604样本测序序列在NCBI上比对的结果截图。

图8是C5038样本测序序列在NCBI上比对的结果截图。

图9是C7659样本经13种呼吸道病原体多重检测试剂盒检测得到的毛细管电泳峰图。

图10是B8460样本经13种呼吸道病原体多重检测试剂盒检测得到的毛细管电泳峰图。

图11是C3604样本经13种呼吸道病原体多重检测试剂盒检测得到的毛细管电泳峰图。

图12是C5038样本经13种呼吸道病原体多重检测试剂盒检测得到的毛细管电泳峰图。

图13是C7659样本经人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测得到的毛细管电泳峰图。

图14是B8460样本经人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测得到的毛细管电泳峰图。

图15是C3604样本经人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测得到的毛细管电泳峰图。

图16是C5038样本经人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测得到的毛细管电泳峰图。

图17是C7659、B8460、C3604、C5038四个样本按1:1混合的混合样本经本发明方法检测得到的毛细管电泳峰图。

具体实施方式

如上所述，本发明的第一方面提供了一种单管多重RT-PCR快速检测HRV分型以及EV的方法，包括如下步骤：

a)采集样本；

b)从所述样本中提取核酸；

c)将所提取的核酸加入到预混RT-PCR试剂中；

d)运行RT-PCR扩增程序；

e)对RT-PCR扩增产物进行片段分析；

其中，所述预混PCR试剂包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物。

在本发明的方法中，所述预混RT-PCR试剂是一种常用的RT-PCR反应混合物，其包含缓冲液、MgCl₂、KCl、DNA聚合酶、逆转录酶、dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)、引物等。

在本发明的方法中，所述样本选自咽拭子或鼻咽抽吸液。

在本发明方法的一个实施方案中，通过电泳对RT-PCR扩增产物进行分析。

在一个具体的实施方案中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳对RT-PCR扩增产物进行分析。

在一个优选的实施方案中，通过毛细管电泳对RT-PCR扩增产物进行分析。

在本发明方法中，所述HRV分型为HRVA、HRVB和HRVC。

在本发明方法的一些实施方案中，所述特异性针对HRV分型的引物分别针对HRV基因组的5’UTR区域和VP4/VP2区域。

在一个具体的实施方案中，所述特异性针对HRV分型的引物分别针对HRVA和HRVB基因组的5’UTR区域以及针对HRVC基因组的VP4/VP2区域。在一个特别具体的实施方案中，所述特异性针对HRV分型的引物分别针对HRVA和HRVB基因组的5’UTR区域中IRES区域上游100-320bp区间，以及针对HRVC基因组的VP4/VP2区域的200-460bp区间。

在本发明方法的一些实施方案中，所述特异性针对EV的引物针对EV基因组的5’UTR区域。在一个特别具体的实施方案中，所述特异性针对EV的引物针对EV基因组的5’UTR区域的IRES区域。

在本发明方法的优选实施方案中，所述特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物如SEQ ID NOs:1-11所示。

在一些实施方案中，所述引物的浓度为100-1000nM。在一个具体的实施方案中，所述引物的浓度如下：SEQ ID NO:1：600nM、SEQ ID NO:2：200nM、SEQ ID NO:3：600nM、SEQ IDNO:4：150nM、SEQ ID NO:5：150nM、SEQ ID NO:6：300nM、SEQ ID NO:7：200nM、SEQ ID NO:8：200nM、SEQ ID NO:9：200nM、SEQ ID NO:10：200nM、SEQ ID NO:11：200nM。

在一些实施方案中，所述特异性针对HRV分型的引物分别针对HRV基因组的5’UTR区域和VP4/VP2区域。

在一些实施方案中，所述特异性针对EV的引物针对EV基因组的5’UTR区域。在一个特别具体的实施方案中，所述特异性针对EV的引物针对EV基因组的5’UTR区域的IRES区域。

在一个具体的实施方案中，所述特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物如SEQ ID NOs:1-11所示。在一些实施方案中，所述引物的浓度为100-1000nM。在一个特别具体的实施方案中，所述引物的浓度如下：SEQ ID NO:1：600nM、SEQ ID NO:2：200nM、SEQ ID NO:3：600nM、SEQ ID NO:4：150nM、SEQ ID NO:5：150nM、SEQ ID NO:6：300nM、SEQID NO:7：200nM、SEQ ID NO:8：200nM、SEQ ID NO:9：200nM、SEQ ID NO:10：200nM、SEQ IDNO:11：200nM。

本发明的第三方面提供了用于检测HRV分型以及EV的引物组，其特征在于包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物。

以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。

实施例一：样本的采集和核酸的提取

一、样本采集：

1.样本类型：咽拭子或鼻咽抽吸液。

2.咽拭子的采样方法：

(1)采集器材：使用专用的无菌咽拭子(推荐使用尼龙材质的植绒拭子，不推荐棉拭子和木杆)。

(2)采样液：使用含有蛋白稳定剂和抗生素的采样液(牛血清5％，青霉素200U/mL，链霉素200U/mL，制霉菌素25U/mL)，用2％NaHCO₃调pH值至7.4(若无上述采样液，也可使用等渗磷酸盐缓冲液或生理盐水)

(3)采样管：螺旋盖，-70℃冻存。

(4)采样方法：左手用压舌板压住患者舌头，右手将拭子伸至咽峡处，适度用力擦拭咽后壁和两侧扁桃体部位数次并旋转拭子以增加接触面，应避免接触舌及口腔粘膜等处。取样后迅速将拭子放入无菌、内装3～5mL采样液的采样管中，靠近采样管顶端处折断并弃去尾部，旋紧管盖。

3.鼻咽抽吸液的采样方法：

(1)采集器材的要求：吸痰管和储液瓶。

(2)采样方法：吸引前先用生理盐水冲洗、润滑吸痰管前端；将患者平卧、头部略向后仰；用压舌板压住舌部，持吸痰管由口腔插入，在患者吸气时将吸痰管插入鼻咽部(若口腔吸引有困难时，亦可由鼻腔插入)；吸引时，吸痰管应左右旋转、自下慢慢上提、缓慢退出，以吸净分泌物；储液瓶中液体即为鼻咽抽吸液。

4.样本的保存和运输：样本采集后应立即竖直放置于冰袋中，不得倾斜或颠覆，并马上送检(如不能马上检测，放置在2～8℃保存不超过3天，在-25℃～-15℃冰箱中保存不超过2个月，避免反复冻融)。

二、核酸提取：

核酸提取试剂使用“核酸提取或纯化试剂”(宁波海尔施基因科技，备案号：浙甬械备20150246号)在自动化提取工作站Smart LabAssist-16/32(备案号：国械备20140202)上进行自动提取(也可使用“核酸提取或纯化试剂”(宁波重鼎生物技术有限公司，备案号：浙甬械备20150006号)进行手动提取)。

实施例二：检测HRV分型及EV

选取样本C7659、B8460、C3604、C5038，这四个样本分别对应于HRVA、HRVB、HRVC及EV阳性的临床样本(通过病毒分离培养并测序鉴定)，所述临床样本是来自温州医科大学附属第二医院按照实施例一所述的采集样本方法获取的呼吸道感染患者的咽拭子。根据实施例一的核酸提取方法进行核酸提取，将所提取的核酸作为模板进行RT-PCR并进行电泳分析。

具体步骤如下：

1.样本前处理

将采样管置于涡旋混匀仪上充分涡旋10秒，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，按照“核酸提取或纯化试剂”说明书的要求，吸取相应体积的样本进行提取。

2.核酸提取

使用“核酸提取或纯化试剂”(备案号：浙甬械备20150246号)在自动化提取工作站Smart LabAssist-16/32(备案号：国械备20140202)上进行自动核酸提取。

3.RT-PCR扩增

3.1配置RT-PCR体系

3.1.1本发明人利用分子信息学手段，对几千条HRVA、HRVB、HRVC和EV的基因序列进行多序列比对统计分析以寻找型别特异性区域以及型别保守性区域，最终基于HRVA和HRVB基因组的5’UTR区域(该区域存在HRVA和HRVB特异性的保守区域，例如5’UTR区域中IRES区域上游100-320bp区间)设计了特异性针对HRVA和HRVB型别的引物，针对HRVC基因组的VP4/VP2区域(该区域存在HRVC特异性的保守区域，例如VP4/VP2区域中200-460bp区间)设计了特异性针对HRVC型别的引物，并针对EV基因组的5’UTR区域(例如5’UTR区域中的IRES区域，该区域是一个肠道病毒属特异性的保守区域)通过生物信息分析利用该区域在不同型别之间的差异性设计了能排除HRV的EV的引物，以用于单管RT-PCR来检测HRV分型以及EV。在本实施例中，所使用的具体引物序列和浓度以及目标序列的大小见表1：

表1：用于检测鼻病毒分型和EV的引物表

注：EV与HRVB的片段大小相近，因此用VIC进行5’修饰，检测结果显示在VIC通道上。HRVA和HRVB因为检测位点存在插入缺失突变，因此扩增出的片段大小不是确定的值，而是一个范围的值，考虑到存在系统误差，实际的片段大小与理论的片段大小允许有±1.5bp的偏差。另外，对于HRVB，为了减少引物简并碱基数提高引物特异性，共设计了4条引物，RVB-1是反向引物，RVB-2、RVB-3和RVB-4是针对HRVB基因组5’UTR区域同一结合区的正向引物。对于HRVC，为了减少简并碱基数量提高引物特异性,共设计了3条引物，RVC-1和RVC-2是针对HRVC基因组VP4/VP2区域同一结合区的正向引物，RVC-3是反向引物。

3.1.2将反应预混液(包括上述表1中的引物、PCR缓冲液、dNTP)进行彻底涡旋，瞬时离心10秒；对RT-PCR酶液(包括逆转录酶和Taq酶)进行瞬时离心10秒后竖直置于冰上。

3.1.3在1.5mL离心管中加入预混RT-PCR试剂(包括3.1.2中的反应预混液和RT-PCR酶液)：14μL×(N+1)的反应预混液和1μL×(N+1)的RT-PCR酶液(N为样本数目，在该实施例中为4)；将离心管中的混合液颠倒混匀并瞬时离心后，竖直置于冰上。

3.1.4取15μL的混合液分装至各个PCR管或八连管中，瞬时离心10秒，将PCR管竖直置于冰上。由于混合液较粘稠，为确保分装准确，使用反向移液法(吸液时先将移液器按压至第2档，之后放松移液器以吸取混合液，推液时压至第1档结束)。

3.2加样

在上述PCR管中分别加入待检测的核酸样品各5μL；加样完成后，将PCR管瞬时离心10秒，并竖直置于冰上。

3.3RT-PCR扩增

在PCR仪上编辑如下扩增程序：见表2：

表2.扩增程序

4.扩增产物在ABI3500DX遗传分析仪上检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(0.25μLSize-500+10μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分型标准物(Allelic ladder)混合，避免产生气泡，尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。

5.结果判读：

将如上第4步ABI3500DX遗传分析仪电泳后的数据导入genemapper 5.0进行结果分析，检测结果如图1-4所示，电泳图上有两个通道，上面窗口为FAM通道，下面窗口为VIC通道。落在FAM通道的左边灰色区域内的峰为HRVB阳性峰，落在FAM通道的中间灰色区域内的峰为HRVA阳性峰，落在FAM通道的右边灰色区域内的峰为HRVC阳性峰，落在VIC通道的灰色区域内的峰为EV阳性峰。

图1-4分别表示的是样本C7659、B8460、C3604、C5038的检测结果。根据结果判读方法从所述图中可以看出，样本C7659、B8460、C3604、C5038分别为HRVA、HRVB、HRVC和EV阳性。由此表明，本发明方法能够对HRVA、HRVB、HRVC及EV进行检测鉴定。

此外，本发明人在选择现有引物组前还尝试了许多种引物(例如，基于HRVA、HRVB、HRVC和EV基因组VP1区域设计的引物，如下表3所示)，但是这些引物的检测效果都不理想，或出现非特异性峰，或出现漏检、误检等现象：

表3用于检测HRV分型和EV的其他引物列表

实施例三：用测序的方法验证所鉴定的HRV分型和EV

对从实施例二中的C7659、B8460、C3604、C5038样本提取的核酸进行测序验证。

1.RT-PCR扩增

1.1配置RT-PCR体系

1.1.1为了验证本方法检测的准确性，本发明人使用了种属保守性的引物(基于IRES区域设计的引物)进行PCR扩增并测序。

1.1.2对反应预混液(包括测序引物、PCR缓冲液、dNTP)进行彻底涡旋，瞬时离心10秒；对RT-PCR酶液(包括逆转录酶和Taq酶)进行瞬时离心10秒后竖直置于冰上。

1.1.3在1.5mL离心管中加入预混RT-PCR试剂(包括1.1.2中的反应预混液和RT-PCR酶液)：28μL×(N+1)的反应预混液和2μL×(N+1)的RT-PCR酶液(N为样本数目，在该实施例中为4)；将离心管中的混合液颠倒混匀并瞬时离心后，竖直置于冰上。

1.1.4取30μL的混合液分装至各个PCR管或八连管中，瞬时离心10秒，将PCR管竖直置于冰上。由于混合液较粘稠，为确保分装准确，使用反向移液法(吸液时先将移液器按压至第2档，之后放松移液器以吸取混合液，推液时压至第1档结束)。

1.2加样

在上述PCR管中分别加入待检测的核酸样品各10μL；加样完成后，将PCR管瞬时离心10秒，并竖直置于冰上。

1.3RT-PCR扩增

在PCR仪上编辑扩增程序(参见实施例二中的表2)。

2.扩增产物送生工生物工程有限公司进行测序

将扩增产物转移至0.6mL的离心管并用封口膜封口，用测序小袋封装后并测序订单放入冰盒，最后快递至生工生物工程有限公司。

3.测序结果的分析

测序结果如下表4所示：

表4：测序结果

将测序所得的序列使用NCBI上的blast进行序列比对，图5-8分别是C7659、B8460、C3604、C5038四个样本在NCBI上的比对结果部分截图，所得的比对结果靠前的就是跟本序列亲缘关系最近的病毒株。从图中可知，所述四个样本的测序结果与本方法的检测结果是一致。

实施例四：使用13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(海尔施基因科技PN1060144)对HRV分型和EV的检测

在该实施例中，使用了13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(海尔施基因科技PN1060144，其中含有的一个检测位点是基于IRES区域来检测鼻病毒)。对从实施例二中的C7659、B8460、C3604、C5038样本提取的核酸，用所述检测试剂盒进行检测。

1.RT-PCR扩增

1.1配置RT-PCR体系

1.1.1将试剂盒中的ResP预混液(包括引物、PCR缓冲液、dNTP)进行彻底涡旋，瞬时离心10秒；并将试剂盒中的ResP酶液(包括逆转录酶和Taq酶)进行瞬时离心10秒后竖直置于冰上。

1.1.2在1.5mL离心管中加入预混RT-PCR试剂(包括1.1.1中的ResP预混液和ResP酶液)：14μL×(N+1)的ResP预混液和1μL×(N+1)的ResP酶液(N为样本数目，在该实施例中为4)；将离心管中的混合液颠倒混匀并瞬时离心后，竖直置于冰上。

1.1.3取30μL的混合液分装至各个PCR管或八连管中，瞬时离心10秒，将PCR管竖直置于冰上。由于混合液较粘稠，为确保分装准确，使用反向移液法(吸液时先将移液器按压至第2档，之后放松移液器以吸取混合液，推液时压至第1档结束)。

1.2加样

1.3RT-PCR扩增

在PCR仪上编辑扩增程序(参见实施例二中的表2)。

2.扩增产物在ABI3500DX遗传分析仪上检测

检测结果如图9-12所示。图9-12分别是使用13种呼吸道病原体多重检测试剂盒检测C7659、B8460、C3604、C5038这4个样本的结果图。从图中可以看出，所述样本C7659、B8460、C3604、C5038的检测结果都为HRV阳性。由此表明，所述13种呼吸道病原体多重检测试剂盒只能用来检测是否有HRV病毒，不能对HRV进行分型，更不能区分所述病毒是HRV还是EV。

实施例五：使用市售可得的人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对HRV分型和EV的检测

对从实施例二中的C7659、B8460、C3604、C5038样本提取的核酸，使用市售可得的人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(朗德医疗科技有限公司)用ABI 7500的荧光定量PCR仪进行检测。

1.荧光定量PCR

1.1配制反应体系

1.1.1将试剂盒中的反应预混液(包括引物、PCR缓冲液、dNTP)进行彻底涡旋，瞬时离心10秒；对酶液(包括逆转录酶和Taq酶)进行瞬时离心10秒后竖直置于冰上。

1.1.2在1.5mL离心管中加入预混RT-PCR试剂(包括1.1.1中的反应预混液和酶液)：35.8μL×(N+1)的反应预混液和4.2μL×(N+1)的酶液(N为样本数目，在该实施例中为4)；将离心管中的混合液颠倒混匀并瞬时离心后，竖直置于冰上。

1.1.3取40μL的混合液分装至各个PCR管或八连管中，瞬时离心10秒，将PCR管竖直置于冰上。由于混合液较粘稠，为确保分装准确，使用反向移液法(吸液时先将移液器按压至第2档，之后放松移液器以吸取混合液，推液时压至第1档结束)。

1.2加样

1.3荧光定量PCR扩增

1.3.1参数设置

荧光定量PCR反应的设置参数见表5：

表5：荧光定量PCR反应的设置参数

1.3.2扩增程序

荧光定量PCR反应的扩增程序见表6：

表6荧光定量PCR反应的扩增程序

2.结果判读

扩增曲线为S型且Ct≦36则判断结果为阳性；扩增曲线为S型不明显且36<Ct<40则结果不确定需要重新检测；扩增曲线不呈S型、Ct值为UNDET或无则判断样品为阴性。

4个样本的检测结果见图13-16：

图13为C7659样本，扩增曲线有明显S型曲线，Ct＝19.9，根据结果判读规则该样本检测为HRV阳性。

图14为B8460样本，扩增曲线有S型曲线，Ct＝29.08，根据结果判读规则该样本检测为HRV阳性。

图15为C3604样本，扩增曲线没有S型曲线，Ct＝UNDET，根据结果判读规则该样本检测为HRV阴性。

图16为C5038样本，扩增曲线有S型曲线，Ct＝28.81，根据结果判读规则该样本检测为HRV阳性。

结合实施例二的结果，可知所述人鼻病毒核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)不能对HRV进行分型，也不能区分HRV跟EV，根据图15的结果可以看出对于HRVC，荧光探针法容易出现漏检，而本发明方法能够准确检测HRV并能进行分型，并且能正确区分HRV和EV。

实施例六：用本发明的方法检测C7659、B8460、C3604、C5038的混合样本

将实施例二中的C7659、B8460、C3604、C5038四个样本提取的核酸按照1:1的比例进行混合，然后使用本发明方法进行检测。

1.RT-PCR扩增

按照实施例二中的方法配制RT-PCR反应体系，添加混合样本后进行RT-PCR扩增。

2.扩增产物在ABI3500DX遗传分析仪上检测

扩增产物在ABI3500DX遗传分析仪上检测的详细步骤见实施例二。结果见图17所示，落在上面窗口FAM通道的左边灰色区域内的峰为HRVB阳性峰，落在上面窗口FAM通道的中间灰色区域内的峰为HRVA阳性峰，落在上面窗口FAM通道的右边灰色区域内的峰为HRVC阳性峰，落在下面窗口VIC通道的灰色区域内的峰为EV阳性峰。从图17中可知所述混合样本的HRVA、HRVB、HRVC、EV都有阳性峰，其中HRVC的阳性峰峰高偏低。由此可见，本发明的方法可在混合样本中准确检测鉴定出HRVA、HRVB、HRVC以及EV。

序列表

<110> 宁波海尔施基因科技有限公司

<120> 一种检测鼻病毒分型和肠道病毒的方法

<130> CP1170955/CB

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgataggc tmaarcaaat yac 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgacagac ttaagcagat cac 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaayttcc amcaccancc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agrtcaagya cttctgyttc cc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagcctcatc tgccaggtct ac 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tagcctcatc gaccaracta gtg 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtttcccmgg agcgaggtat a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttccccgg agcggagtat a 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttccccgg agctggatat ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caattgtcac cataagcagc ca 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcctgaatgc ggctaatccy aac 23

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgatagtga tttgyttkag cctatc 26

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaagatccr tckaarttya cncaacc 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagtgatccr garaarttya cnaaacc 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caagacaraa tgttggmacw caytc 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gayccmagya aattyacwga yccwgt 26

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

catgcytcwa crttrggdga rtt 23

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtacacaraa gagtggwtcn cayga 25

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcccctgaa tgcggctaat c 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtcaaagtag tcggttccgc ca 22

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgtgtccaa agtagtcggt tccgctg 27

<210> 22

<211> 398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agagcatgtt cgggtccatc cgcattgctc attacgacta gatacacact ggtttgtgtg 60

caccagctgc agggttaagg ttagccgcat tcaggggccg gaggactcaa agcgagcaca 120

cggggctctt cacaccttgt ccattatttg gcttcacacc catagggtgt gcaggcagcc 180

acgcaggctg gaacactgtc gccagtgggg tacttccagc ctcatctgcc aggtctacca 240

ggggaaatgg cggaacgacc aaccaaataa tttcaaaggt gctactaggc tttgcgtagg 300

cgctttgcgg ataacgatcg cagttgtttt tgccctgttg gagcatatca acattgaccg 360

gggaaacaga agtgcgtgtg aaattgttat ccgctcca 398

<210> 23

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgcttattg gtcgtccaga ttactcatta cgaccttaat gctgctggtt tgcaacacaa 60

ggctccgggg ttgaggttag ccgcattcag gggccggagg agtcacaacc aagcacatgc 120

gagtcttcac accatgtcca taaaaaggcg tcccagcaga tgctgggttg gccgccacgc 180

aggctaggac acggtcaccc gtggggaatt cctagcctca tcgaccaaac tagtggaggg 240

ggaatccacc tgatcgaacg ccaagttaca aacaagatgc tactagcttt tacgtagttg 300

gttggcggat aacggttaaa ggcttttggc agtgggtaca gcctatacct cgctccgggg 360

taacagaagt gcgtgtgaaa ttgttatccg ctcca 395

<210> 24

<211> 404

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcggatatcg gggtccaatc ccgtagttgc ccattacgac tgtgtttatg ctggcatgca 60

taccacagct acggggttaa ggttagccgc attcaggggc cggaggactc acttgtagcg 120

cactcgaacc ttcacaccct gtcttcatca tggcgtcccg agctgatagc tcgggcgggg 180

caccacgcgg gctacaccac cgtcgccggt gggggttgtg tagccccatt gccctgatct 240

acgtggggga aacgctgagc gaaacgccat gaagctggca aaggtgctac taatttccgc 300

gcagtacaag tgcgggtaac gaatgcttca gcttcaacct cgtgagaagt ctattcacac 360

atccggggta acagaagtgc gtgtgaaatt gttatccgct ccaa 404

<210> 25

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaaggatgtc ggggtcgcca cggacttgcg cattacgaca agcaactcac tggcctgtga 60

gcacttgctc catggttagg attagccgca ttcaggggcc ggaggactct atagtagctc 120

aatagactct tcacaccttg ttcatgtcta gcgtctcatg gttttcacca tgagtaggcc 180

gccaacgcag cctggaccac tgtcgccagt ggggtacgtc cagactcatc gacccaagct 240

acacacgggt tagtgtgctg agcgcaacgc gtcaacaatc caaaggtgat actaggtttc 300

tcgaagtact atagcggata acggataggt tgttttcaac cgtgggaaca gtttatacaa 360

ccacaccggg gtaacagaag tgcgtgtgaa attgttatcc gctccaa 407

Claims

1.一种单管多重RT-PCR快速检测HRV分型以及EV的方法，其用于非诊断目的并且包括如下步骤：

a）采集样本；

b）从所述样本中提取核酸；

c）将所提取的核酸加入到预混RT-PCR试剂中；

d）运行RT-PCR扩增程序；

e）对RT-PCR扩增产物进行片段分析；

其中，所述预混RT-PCR试剂包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物，其中所述特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物如SEQ ID NOs:1-11所示。

2.权利要求1的方法，其中通过电泳对RT-PCR扩增产物进行分析。

3.权利要求2的方法，其中所述电泳为毛细管电泳。

4.权利要求1的方法，其中所述样本选自咽拭子或鼻咽抽吸液。

5.权利要求1的方法，其中所述引物的浓度为100-1000 nM。

6.权利要求5的方法，其中所述引物的浓度分别为：SEQ ID NO:1：600nM、SEQ ID NO:2：200nM、SEQ ID NO:3：600nM、SEQ ID NO:4：150nM、SEQ ID NO:5：150nM、SEQ ID NO:6：300nM、SEQ ID NO:7：200nM、SEQ ID NO:8：200nM、SEQ ID NO:9：200nM、SEQ ID NO:10：200nM、SEQ ID NO:11：200nM。

7.一种快速检测HRV分型以及EV的试剂盒，其特征在于包括特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物，其中所述特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物如SEQ ID NOs:1-11所示。

8.用于检测HRV分型以及EV的引物组，其特征在于包含特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物，其中所述特异性针对HRV分型的引物以及特异性针对EV的引物如SEQID NOs:1-11所示。