CN104450970A - 用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，包括分别装有RNA提取液、漂洗液、逆转录反应液、PCR扩增反应液、特异性鉴别引物、阴性对照品、阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或试剂管，其中的特异性鉴别引物的核苷酸序列如下：上游引物：5’-AACRCCCAGGCGACTTCAG-3’；下游引物：5’-TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3’。本发明设计的试剂盒及方法不仅特异、准确、灵敏，且具有简便、快速的特点，一次可鉴别三种不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒类型，并解决了以往方法可能存在的漏检问题。

Description

用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及方法。
技术背景
猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和肥育猪呼吸道症状为主要特征。猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)与多种病毒混合感染，常常伴发细菌继发感染，且该病在全世界范围内大规模的流行，给养猪业造成了极大的经济损失。该病1987年首次在美国发现，当时被称为“猪神秘病”(mystery swine disease，MSD，之后便迅速蔓延至世界大多数养猪国家。1991年Wensvoort等首次分离到该病毒，并命名为(lelystad virus，LV)，在第10次国际病毒大会上将该病毒归属于新设立的动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。1996年郭宝清等首次从国内PRRS血清阳性猪群中分离到PRRSV，从而证实了我国也有此病的流行(童光志，周艳君，郝小芳等)。
2006年夏季，我国中南部爆发了高致病性猪蓝耳病，之后蔓延到全国各个省市。其病原已确定是Nsp2基因发生连续缺失的高致病性猪蓝耳病病毒变异株。高致病性猪蓝耳病能使各种年龄、各种品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率较低。据农业部通报，2006年6月份，全国共有12个省份暴发“高致病性猪蓝耳病(HP-PRRS)”疫情28次，因“高致病性猪蓝耳病”发病生猪379.8万头，死亡99.2万头。2007年，有26个省份的310个县市发生不同程度的猪高致病性蓝耳病疫情，发病猪31.3万头，死亡8.2万头。近年来，疫病形势依然严峻，严重地影响了我国畜牧业发展。因此，为了监测和控制高致病性猪蓝耳病的感染，研究高致病性猪蓝耳病毒变异株的快速检测方法具有重要意义。
PRRSV传统的检测方法主要是病毒的分离培养鉴定，虽然该方法具有一定的特异性和敏感性，但是PRRSV培养的条件苛刻，一般实验室难以实现。同时操作繁琐且耗时长，不利于对大规模样品进行检测。免疫学检测PRRSV的方法主要有酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验等，但都有敏感性低或特异性较差的问题。此外，上述的这些检测方法还存在着无法区分普通PRRSV和现时国内流行的高致病性PRRSV变异株以及PRRSV疫苗毒株的局限性。由于高致病性猪蓝耳病发病率高、病程进展快、病死率高，传统的检测方法有可能延误诊断和治疗。因此，开发早期、快速、特异、敏感的检测技术非常必要。
随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链式反应(PCR)技术已经广泛应用于细菌、微生物基因水平的研究，也给病毒的快速鉴定提供了可能。针对国内流行的高致病性PRRSV变异株基因组的特点，国内学者建立了高致病性PRRSV RT-PCR检测技术(童光志，周艳君，郝晓芳.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析.中国预防兽医学报，2007,29(5):321-326)，该方法可以扩增PRRSV Nsp2基因，测序后通过软件进行比较，看是否在NSP2处发生缺失或缺失的区域是否与报道的缺失区域相同。这种方法虽然能够区分普通猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病，但显然比较费时费力，不适用与临床检测。还有学者通过参考普通PRRSV及高致病性PRRSV变异株的Nsp2基因序列，设计一对位于紧靠缺失区两端的保守区的引物，其扩增范围覆盖整个缺失区域，缺失毒株(高致病性PRRSV变异株)和非缺失毒株(普通PRRSV株)，预期扩增产物长度分别约230bp和320bp，通过凝胶电泳分析可分别检测出普通猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病(郝晓芳，周艳君，田志军。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT—PCR鉴别诊断方法的建立.中国预防兽医学报，2007,29(9):705-709)。但该方法由于需要对PCR产物进行杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断。
常规的病毒血清学检测方法普遍存在灵敏度不高的缺点，而一般的分子检测病毒，RNA提取质量的好坏对实验结果影响很大，而RNA又特别容易降解，提取技术要求高；同时，要检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的三种不同类型必须要设计不同引物对，检测的过程也要分开进行，费时费力。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题，提供一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，包括分别装有RNA提取液、漂洗液、逆转录反应液、PCR扩增反应液、特异性鉴别引物、阴性对照品、阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或试剂管，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或试剂管的包装盒；
所述特异性鉴别引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下：
上游引物：5’-AACRCCCAGGCGACTTCAG-3’；
下游引物：5’-TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3’。
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒包括PRRSV经典毒株、PRRSV高致病性毒株，以及PRRSV疫苗毒株TJM-F92株。
所述RNA提取液的配方包括：
Carrier RNA，4～10ul；蛋白酶K，10～20ul；十二烷基硫酸钠，1％～4％；Tris-Cl150～250mmol/L；EDTA，0.5～1mmol/L；pH7～8；
所述漂洗液包括漂洗液1和漂洗液2；
漂洗液1的配方为：盐酸胍，4～6mol/L；无水乙醇，50％～70％；蛋白酶K，80～100ug/ml；
漂洗液2为：60～80％无水乙醇。
所述逆转录反应液的配方包括：
5×RT Buffer；2.5mmol dNTP；RNA酶抑制剂(Rnase Inhibitor)；逆转录酶(M-MLV)。
所述PCR扩增反应液的配方包括：
10mmol dNTP Mix；10×Taq Buffer；5U/ul Taq DNA Polymerase。
所述阳性对照品包括PRRSV经典毒株阳性对照品、PRRSV高致病性毒株阳性对照品和PRRSV疫苗毒株TJM-F92株阳性对照品；三个阳性对照品分别含有三种特定目的基因序列的质粒；其中PRRSV经典毒株阳性对照品所含质粒的目的基因序列如SEQ ID NO.3所示，PRRSV高致病性毒株阳性对照品所含质粒的目的基因序列如SEQ ID NO.4所示，PRRSV疫苗毒株TJM-F92株阳性对照品所含质粒的目的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
基于上述试剂盒的一种鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括以下步骤：
(1)、提取待测样品病毒总RNA；
(2)、样品病毒总RNA经反转录获得其cDNA；
(3)、以样品cDNA为模板，加入特异性鉴别引物和PCR扩增反应液，进行PCR扩增反应，扩增产物进行凝胶电泳，若电泳结果出现1879bp特异性条带，则表示样品中含有PRRSV经典毒株；若样品中出现1789bp条带，则表示样品中含有PRRSV高致病性毒株；若电泳结果出现1429bp条带，则表示样品中含有PRRSV疫苗毒株TJM-F92株；若阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。
所述样品取自猪的血液、唾液、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结、扁桃体、脑组织、粪便、精液、尿液、猪场内外环境表面拭子、空气、PRRSV疫苗以及与PRRSV相关的样品。
所述PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环次数为38次，72℃再延伸10分钟。
本发明设计的试剂盒及方法不仅特异、准确、灵敏，且具有简便、快速的特点，一次可鉴别三种不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒类型，并解决了以往方法可能存在的漏检问题。人工污染试验检测结果表明，该系统亦适合于组织样品中PRRSV的直接检测，具有快速、特异和简便的特点。本发明还涉及针对NSP2的基因的引物设计、PCR反应条件以及应用此试剂盒进行组织样品的检测方法。
本发明建立的PCR方法可同时扩增出NSP2基因上种猪繁殖与呼吸综合征病毒的三种类型(经典毒株、高致病性毒株、疫苗毒株)，但对其它4种猪常见病毒均未扩增出任何条带，表明该检测系统具有很强的特异性。测序同源性均在98.67％-100％，进一步反应了该系统具有很好的准确性及特异性。
附图说明
图1为质控样品扩增条带。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
1、材料与方法
1.1阳性对照选取猪繁殖与呼吸综合征的三种活疫苗：猪繁殖与呼吸综合征活疫苗CH-1R株购自上海海利生物药品有限公司；高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株购自广东大华农动物保健品股份有限公司；高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗TJM-F92株购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。阴性对照使用猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株购自普莱柯生物工程股份有限公司；猪伪狂犬病活疫苗Bartha-K61株购自云南生物制药有限公司；猪瘟活疫苗(细胞源)购自洛阳普莱柯生物工程股份有限公司；猪乙型脑炎活疫苗SA14-14-2株购自中牧实业股份有限公司成都药械厂。空白对照使用双蒸水。
1.2提取待测样品病毒总RNA
1.2.1取已处理好的样品、阴性对照和阳性对照各200ul，分别加入RNA提取液250ul，充分颠倒混匀，56℃水浴10～15min。
1.2.2将液体吸入已套好收集管的吸附柱中，8000rpm离心1min。
1.2.3弃去收集管中液体，加入600ul漂洗液1，12000rpm离心30s。
1.2.4弃去收集管中液体，加入500ul漂洗液2，12000rpm离心30s。
1.2.5弃去收集管中液体，12000rpm空柱离心2min，以除去残留的洗脱液。
1.2.6将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱中央加入ddH2O 20～50ul，室温静置3～5min，12000rpm离心1min，离心管中液体即为模板RNA。
1.3病毒RNA逆转录
1.3.1在PCR反应管中依次加入1ul下游引物、17ulRNA模板、7ul逆转录反应液，震荡混匀，短暂离心。
1.3.2按以下反应条件在PCR仪上进行逆转录：42℃逆转录45min～60min，即为cDNA。
1.4PCR扩增
1.4.1在PCR反应管中依次加入1μL上游引物、1μL下游引物、2μL待检样品、6μLPCR扩增反应液及10μL ddH2O，震荡混匀，离心数秒。
1.4.2将1.4.1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环次数为38次，72℃再延伸10分钟。
1.4.3将1.4.2反应后的产物使用1.5％琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲液中电泳，用凝胶成像系统分析。
1.4.4PCR产物的测序及分析按1.4所述步骤加样后进行PCR检测，并将PCR产物割胶回收测序。
1.4.5特异性试验使用1.1中的空白对照，用建立的PCR方法进行扩增。
2、结果
2.1通过优化的鉴别引物，猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗CH-1R株出现1879bp条带；高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株出现1789bp条带；高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗TJM-F92株出现1429bp条带。质控样品扩增条带如图1所示，图中所示，A为PRRSV经典毒株阳性对照品；B为PRRSV高致病性毒株阳性对照品；C为PRRSV疫苗毒株TJM-F92株阳性对照品；D为阴性对照品；Mark为对比参照条带，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
2.2PCR产物的测序鉴定：PCR扩增产物通过TA克隆、测序后在NCBI上进行BLAST对比，结果显示，与NSP2已知经典毒株序列(CH-1R、VR2332等)比对同源性为98.67％-100％；与已知高致病性毒株序列(JXA1、HuN等)的同源性为99.62％-100％；与已知高致病性疫苗毒株序列(TJ)的同源性为99.52％。表明该PCR反应系统具有很好的准确性。
2.3特异性试验：利用试剂盒分别对猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株、猪伪狂犬病活疫苗Bartha-K61株、猪瘟活疫苗(细胞源)、猪乙型脑炎活疫苗SA14-14-2株为待检样品检测，结果显示未见任何条带，表明该PCR反应扩增NSP2基因片段具有很好的特异性。
3、讨论：研究表明，针对NSP2基因设计的鉴别引物可以鉴定到猪繁殖与呼吸综合征毒株的三种类型，因此，针对上述基因设计的PCR引物，不仅可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，又可以进行不同病毒类型之间的检测。
本试验建立的PCR方法可同时扩增出NSP2基因上种猪繁殖与呼吸综合征病毒的三种类型(经典型毒株、高致病性毒株、高致病性疫苗毒株)，但对其它4种猪常见病毒均未扩增出任何条带，表明该检测系统具有很强的特异性。测序同源性均在98.67％-100％，进一步反应了该系统具有很好的准确性及特异性。
本发明设计的PCR试剂盒方法不仅特异、准确、灵敏，且具有简便、快速的特点，一次可鉴别三种不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒类型，并解决了以往方法可能存在的漏检问题。人工污染试验检测结果表明，该系统亦适合于组织样品中PRRSV的直接检测，具有快速、特异和简便的特点。本发明还涉及针对NSP2的基因的引物设计、PCR反应条件以及应用此试剂盒进行组织样品的检测方法。
本发明中的试剂盒组成具体如下：
A管，含有2mL溶液，为猪繁殖与呼吸综合征经典毒株阳性对照品，保存于-20℃。
B管，含有2mL溶液，为猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株阳性对照品，保存于-20℃。
C管，含有2mL溶液，为猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株TJM-F92株阳性对照品，保存于-20℃。
D管，含有2ml溶液，为阴性对照品，保存于-20℃。
E管、F管分别为上游引物和下游引物，保存于-20℃。
G管，为RNA提取液，4℃保存。
H管，为漂洗液1，室温保存。
I管，为漂洗液2，室温保存。
J管，为逆转录反应液，保存于-20℃。
K管，含有PCR扩增反应液，保存于-20℃。
L管，含有ddH2O,保存于-20℃。
加样及检测步骤说明：
1提取待测样品病毒总RNA
1.1取已处理好的样品、A、B、C、D各200ul，分别加入G管液体250ul，充分颠倒混匀，56℃水浴10～15min。
1.2将液体吸入已套好收集管的吸附柱中，8000rpm离心1min。
1.3弃去收集管中液体，加入600ul H管液体，12000rpm离心30s。
1.4弃去收集管中液体，加入500ul I管液体，12000rpm离心30s。
1.5弃去收集管中液体，12000rpm空柱离心3min，以除去残留的洗脱液。
1.6将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱中央加入L管液体20～50ul，室温静置3～5min，12000rpm离心1min，离心管中液体即为模板RNA。
2病毒RNA逆转录
2.1在PCR反应管中依次加入1ul F管液体、17ulRNA模板、7ulJ管液体，震荡混匀，短暂离心。
2.2按以下反应条件在PCR仪上进行逆转录：42℃逆转录45min～60min，即为cDNA。
3PCR扩增
3.1在PCR反应管中依次加入1μL E管液体、1μL F管液体、2μL待检样品、6μL K管液体及10μL L管液体，震荡混匀，简短离心。
3.2将3.1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环次数为38次，72℃延伸10分钟。
3.3将3.2反应后的产物使用1.5％琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲液中电泳，用凝胶成像系统分析。
3.4PCR产物的测序及分析按上述步骤进行PCR检测，并将PCR产物割胶回收测序。

Claims (10)

1.一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于：包括分别装有RNA提取液、漂洗液、逆转录反应液、PCR扩增反应液、特异性鉴别引物、阴性对照品、阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或试剂管，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或试剂管的包装盒；
所述特异性鉴别引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下：
上游引物：5’-AACRCCCAGGCGACTTCAG-3’；
下游引物：5’-TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒包括PRRSV经典毒株、PRRSV高致病性毒株，以及PRRSV疫苗毒株TJM-F92株。
3.根据权利要求1所述的用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取液的配方包括：
Carrier RNA，4～10ul；蛋白酶K，10～20ul；十二烷基硫酸钠，1％～4％；Tris-Cl150～250mmol/L；EDTA，0.5～1mmol/L；pH7～8。
4.根据权利要求1所述的用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包括漂洗液1和漂洗液2；
漂洗液1的配方为：盐酸胍，4～6mol/L；无水乙醇，50％～70％；蛋白酶K，80～100ug/ml；
漂洗液2为：60～80％无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液的配方包括：
5×RT Buffer；2.5mmol dNTP；RNA酶抑制剂；逆转录酶。
6.根据权利要求1所述的用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液的配方包括：
10mmol dNTP Mix；10×Taq Buffer；5U/ul Taq DNA Polymerase。
7.根据权利要求1所述的用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括PRRSV经典毒株阳性对照品、PRRSV高致病性毒 株阳性对照品和PRRSV疫苗毒株TJM-F92株阳性对照品；三个阳性对照品分别含有三种特定目的基因序列的质粒；其中PRRSV经典毒株阳性对照品所含质粒的目的基因序列如SEQ ID NO.3所示，PRRSV高致病性毒株阳性对照品所含质粒的目的基因序列如SEQ ID NO.4所示，PRRSV疫苗毒株TJM-F92株阳性对照品所含质粒的目的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
8.基于权利要求1所述试剂盒的一种鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、提取待测样品病毒总RNA；
(2)、样品病毒总RNA经反转录获得其cDNA；
(3)、以样品cDNA为模板，加入特异性鉴别引物和PCR扩增反应液，进行PCR扩增反应，扩增产物进行凝胶电泳，若电泳结果出现1879bp特异性条带，则表示样品中含有PRRSV经典毒株；若样品中出现1789bp条带，则表示样品中含有PRRSV高致病性毒株；若电泳结果出现1429bp条带，则表示样品中含有PRRSV疫苗毒株TJM-F92株；若阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。
9.根据权利要求8所述的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于，所述样品取自猪的血液、唾液、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结、扁桃体、脑组织、粪便、精液、尿液、猪场内外环境表面拭子、空气、PRRSV疫苗以及与PRRSV相关的样品。
10.根据权利要求8所述的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环次数为38次，72℃再延伸10分钟。
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