CN101144108B - 一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列 - Google Patents

Abstract

一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列。引物对包括：由序列为CCCAAGCTGATGACACCTTT的上游引物PVpf和序列为AATCCAGAGGCTCATCCTGGT的下游引物PVpr组成的引物对。探针PVpb序列为CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA。

Description

一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列

技术领域

本发明涉及一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪病毒性疾病。其特征为各种年龄的猪均可感染此病，主要临床症状是发病猪厌食，嗜睡，体温升高。繁殖母猪受精率低下，妊娠母猪发生早产，晚期流产，死胎，弱胎及木乃伊胎，哺乳母猪泌乳不足，严重影响新生猪生长发育和甚至死亡，种公猪表现性功能下降，影响精液质量和精子活力。仔猪和育肥猪表现呼吸系统症状，呼吸困难急促，呈间质性肺炎，耳部及趾部皮肤发绀。

高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性传染病。仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。国外的研究表明，同一基因型的PRRSV分离毒株之间存在明显的序列差异，特别是在基因组ORF1a的nsp1b和nsp2，ORF3和ORF5的变异性很大。我国已发现nsp2的变异主要表现在氨基酸的缺失。

PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，依据血清学试验及结构基因序列分析结果可将PRRSV划分为两种基本的基因型，即欧洲型和美洲型，前者主要流行于欧洲地区，而后者主要流行于美洲和亚太地区。欧洲型的代表株为LV株，美洲型的代表株为VR2332株，两者的核苷酸序列相似性约为60％。

目前常见的病毒分离和血清学诊断方法，操作繁琐、耗时、敏感性低、特异性差，不适宜作为病毒的早期诊断。而由于缺乏有效的疫苗，因而及时诊断疾病、及时处理疫情就变得十分重要，这就需要有一种既准确又快速的实验室检测方法来确定病原。随着分子生物学技术的发展，普通PCR方法已经广泛应用于临床诊断，但该技术需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，同时有一定的非特异性扩增。而荧光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：

(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何病毒的核酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

1.一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物对，其特征在于所述的引物对为：由序列为CCCAAGCTGATGACACCTTT的上游引物PVpf和序列为AATCCAGAGGCTCATCCTGGT的下游引物PVpr组成的引物对。

2.一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的探针，其特征在于所述的探针PVpb序列为CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA。

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。

附图说明

附图：利用引物对PVpf/PVpr和探针PVpb检测高致病性猪蓝耳病病毒阳性样品的荧光PCR扩增图。

具体实施方式

1.引物和探针设计：通过对高致病性猪蓝耳病病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

上游引物PVpf：CCCAAGCTGATGACACCTTT

下游引物PRVpr：AATCCAGAGGCTCATCCTGGT

探针PRVpb：CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA

2.反应体系的建立和优化：利用灭活的高致病性猪蓝耳病病毒作为待检样品，用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。

2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将高致病性猪蓝耳病病毒的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。

2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，经过多次重复实验选定5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

2.3反转录酶(AMV RnaseXL)用量的优化经过使用不同浓度反转录酶的试验结果比较，选定5U作为试剂盒反应体系中反转录酶的用量。

2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定5U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选1mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。

2.6探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将高致病性猪蓝耳病病毒的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的高致病性猪蓝耳病病毒实时荧光RT-PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1高致病性猪蓝耳病病毒实时荧光RT-PCR反应中的各组分情况

组分	用量/终浓度
		10×Buffer	1×
25mmol/L MgCl<sub>2</sub>	5mmol/L
		dNTP Mixture	1mmol/L
RNase Inhibitor	40Unit
		引物	0.4μmol/L each
探针	0.2μmol/L
		模板	10μl
AMV RNaseXL	5Unit
		Taq酶	5Unit

注：a.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

b.根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.PCR条件选择如下：

50℃30分钟，95℃2分钟，1个循环；

95℃5秒，60℃40秒，40个循环。

5.检测步骤：

5.1选取引物和探针；

5.2制备待测模板，可采用TRIZOL核酸提取法提取各种来源样品中高致病性猪蓝耳病病毒的核酸；

5.3反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、确定dNTPs浓度；e、确定探针浓度；

5.4选择仪器的检测通道；

5.5上机检测。

6.实施例

6.1待测模板的制备：用Trizol核酸抽提试剂的提取方法

6.1.1剪取50-100mg新鲜组织样本，加入装有500ul Hanks液的研钵中缓慢研成匀浆，取匀浆液作为样本进行下一步处理。如果样本为血液，取血清作为样本进行下一步处理。

6.1.2往1.5ml灭菌无RNA酶污染的离心管中加入加入600ul RNA提取液，然后加入经步骤1处理的待测样本200ul，吸打混匀；再加入200ul氯仿，颠倒5-10次混匀。12,000转/分钟离心10分钟。

6.1.3吸取上层液相(切勿吸入下层液体)转移新的1.5ml灭菌离心管中，加入200ul异丙醇(-20℃预冷)，颠倒混匀。12,000转/分钟离心10分钟。

6.1.4轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600ul 75％乙醇，颠倒洗涤。12,000转/分钟离心5分钟。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

6.1.54,000转/分钟离心10秒将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥1-5分钟。

6.1.6加入15ul DEPC水，轻弹混匀，溶解管壁上RNA，保存-20℃备用。

6.2高致病性猪蓝耳病病毒实时荧光RT-PCR反应的扩增条件

根据表1加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：

6.2.150℃30分钟进行RNA的反转录，95℃3分钟灭活反转录酶；

6.2.295℃15秒变性，55℃30秒退火，72℃1分钟延伸，如此重复5个循环进行预扩增；

6.2.395℃10秒变性，60℃40秒退火、延伸，如此重复40个循环进行目的片段的扩增检测，试验结果可以实时监测。

6.3高致病性猪蓝耳病病毒实时荧光RT-PCR的检测结果

经检测，若待检培养液中含有高致病性猪蓝耳病病毒则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到1000个拷贝/ml；若待检培养液中不含有高致病性猪蓝耳病病毒则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性。

本发明的优点：

(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

(2)本发明提供的引物和探针对于不含有高致病性猪蓝耳病病毒的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

(3)由于本发明对已知的高致病性猪蓝耳病病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。

(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

SEQUENCE LISTING

<110>深圳太太基因工程有限公司

<120>一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列

<130>3

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cccaagctga tgacaccttt            20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aatccagagg ctcatcctgg t          21

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgcgtagaac tgtgacaaca acgctga    27

Claims (1)

1.一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物对和探针序列组合物，其特征在于所述的引物对为：由序列为CCCAAGCTGATGACACCTTT的上游引物PVpf和序列为AATCCAGAGGCTCATCCTGGT的下游引物PVpr组成的引物对；所述的探针PVpb序列为CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA。

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