CN101928780A - 一种a型口蹄疫病毒双色荧光pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用双色荧光定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测出样品中A型口蹄疫病毒(FMDV-A)以及各型口蹄疫病毒(FMDV-U)mRNA的方法。该方法包括：(1)采集样品；(2)样本预处理和提取RNA；(3)一步RT-PCR双色荧光探针扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中A型口蹄疫病毒和(或)各型口蹄疫病毒的存在，并能对其进行准确定量(图2)，实现了对A型口蹄疫病毒的实时快确检测。

Description

一种A型口蹄疫病毒双色荧光PCR检测方法及其试剂盒

一、技术领域

本试发明涉及检测A型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)以及各型口蹄疫病毒mRNA的方法，特别是涉及使用双色荧光探针定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测发病动物水泡液、淋巴结、血清等标本以及细胞培养液中A型口蹄疫病毒以及各型口蹄疫病毒mRNA的方法。本发明进一步涉及用于该病毒检测的试剂盒。

二、背景技术

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患的急性接触性传染病，被国际兽疫部门列为A类动物传染病之首。该病的易感动物包括牛、绵羊和猪等70多种家养和野生哺乳动物。最易感染的动物是牛、猪、骆驼、羊、鹿等。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。

早在17-19世纪，德国、法国、瑞士、意大利、奥地利已有口蹄疫的流行记载。

十九世纪五十年代在英法等国家曾爆发过的口蹄疫，造成的高达1.43亿英镑的经济损失，严重影响了畜牧业的发展；1967年英国口蹄疫大爆发导致40万头牛被屠宰，造成了1.5亿英镑的经济损失。此后世界上其他国家和地区也陆续有爆发口蹄疫的报道。

在我国，2009年四月十五日江苏省常州市武进区郑路镇牟家村一奶牛养殖小区发生口蹄疫疑似疫情，后经中国农业部国家口蹄疫参考实验室确诊为A型口蹄疫疫情，相关部门随即对发病及同群牛已全部扑杀并做无害化处理。

口蹄疫一旦爆发，将严重影响到了肉制品的售价。而大量宰杀牲畜后，给畜牧业造成了巨大的损失。畜牧业的危害甚甚至波及到饲料行业的发展，因此其危害是巨大的。

口蹄疫具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50％-100％，犊牛死亡率较高。该病春秋两季较多，尤其是春季。风和鸟类也是远距离传播的因素之一。病畜齿龈、舌面、唇内面可见到蚕豆到核桃大的水疱，涎液增多井呈白色泡沫状挂于嘴边。趾间及蹄冠的柔软皮肤上也发生水疱。有时在乳头皮肤上也可见到水疱。有些病例在水疱愈合过程中，病情突然恶化，往往因心脏麻痹而突然死亡，死亡率高达25％～50％。犊牛发病主要表现为出血性胃肠炎和心肌炎，死亡率较高。

口蹄疫的病原体为口蹄疫病毒(FMDV)，属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，通过交叉保护试验和血清学试验确定FMDV有7个血清型，即A、O、C、Asia1和SAT1、SAT2、SAT3等，及65个以上的血清亚型。根据7个血清型的同源性将其分为两群，即A、O、C和Asia1型为一群，SAT1、SAT2、SAT3为一群，两群之间的血清型同源性较低，群内同源性可达60％～70％，血清型之间无交叉和交叉免疫现象。A、O、C、型FMDV的毒力和抗原性均易发生变异，几乎遍布亚、非、拉、欧各洲。

目前对于A型和各型口蹄疫病毒的实验室检查主要包括：间接夹心酶联免疫吸附试验、反向间接血凝试验(RIHA)、中和试验、液相阻断酶联免疫吸附试验、非结构蛋白ELISA检测、正向间接血凝试验(IHA)、RT-PCR试验和病毒分离鉴定等。前几种方法目的是检测相应的抗体，属于血清学检测方法，鉴于口蹄疫病毒的高度变异性以及交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。后两种方法属于确诊实验，其中从标本中分病毒并鉴定需要几天的时间。RT-PCR试验可以设计针对口蹄疫病的特异性引物，进行扩增，通过扩增产物电泳来判断结果。与上述其它几种方法相比，该方法具有较高的灵敏度，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作较为繁琐。

双色或多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增两个或者多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。利用该原理发明的试剂盒在同一个标本的检测中，不但可以检测A型口蹄疫病毒还可以检测各型口蹄疫病毒，实现了一个标本中同时检测A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病毒的目的，使用方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题。

三、发明内容

基于双色荧光定量PCR的原理，本发明提供了检测A型口蹄疫病毒以及各型口蹄疫病毒mRNA方法，特别是提供了一种使用双色荧光定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测出发病动物水泡液、淋巴结、血清等标本以及细胞培养液中A型口蹄疫病毒以及各型口蹄疫病毒mRNA的方法。本发明进一步提供了用于该类病毒快速准确检测的试剂盒。

本发明具体步骤包括：(1)采集和运送样本(发病动物水泡液、淋巴结、血清等标本以及细胞培养液等)；(2)样本预处理和提取RNA；(3)一步RT-PCR双色荧光探针体外扩增法对样本进行检测：合成特定引物和荧光探针，用双色荧光定量PCR反应技术并用A型口蹄疫病毒PCR反应液(PCR MIX)对样本进行扩增检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中A型口蹄疫病毒的存在并根据阳性标准品对其标本中的病毒进行定量检测。

检索Genbank上的口蹄疫病毒基因序列，用生物信息学的方法，经过比对分析，试用专门的引物探针设计软件，设计检测A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病毒的引物探针如下：

(1)A型口蹄疫病毒(FMDV-A)：

上游引物：5’CTTCAACTTTGGTGCAGTTC-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物：5’-AGAGCTCAGCACGCTTCATG-3’(SEQ ID NO.1)

荧光探针：FAM-5’GCCACGACCATCCACGAGCTTCTC 3’-TAMRA(SEQID NO.3)

(2)各型口蹄疫病毒(FMDV-U)：

上游引物：5’-CAGGCTAAGGATGCCCTTCA-3’(SEQ ID NO.4)

下游引物：5’-GTCCCAGTCCCCTTCTCAGAT-3’(SEQ ID NO.5)

荧光探针：VIC-5’ACCCCGAGGTAACACGCGACACTC 3’-TAMRA(SEQID NO.6)

根据本发明的一个优选实施方案，其中所检测的口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒，即为2009年四月十五日江苏省常州市武进区郑路镇牟家村某奶牛养殖场爆发的口蹄疫疫情。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测A型口蹄疫病毒的方法，同时也对各型口蹄疫病毒(FMDV-U)进行检测，作为一个平行试验。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的双色荧光标记是指检测FMDV-A基因的探针的荧光标记为FAM，检测FMDV-U基因探针的荧光标记为VIC，淬灭基团为TAMRA。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的分型检测方法首先采集标本，该分型检测方法适用标本类型有发病动物水泡液、淋巴结、血清、病毒细胞培养液等。对发病动物需无菌条件下取1g左右相应组织；或病毒细胞培养液，需取500μl左右，置入1.5ml洁净EP管；血清需用一次性注射器常规取抽血2-3ml，注入5ml干燥管中，立即送检。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法对上述各种标本提取RNA，然后进行扩增检测。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的分型检测方法，扩增体系按照如下方式配制，

上游引物(10uM)：    1ul

下游引物(10uM)：    1ul

荧光探针(10uM)：    0.5ul

PCR反应液(PCR MIX)：17.5ul

Total               20.0μl

根据本发明的一个优选实施方案，上述用于检测A型口蹄疫病毒的PCR反应液(PCR MIX)包含FQ buffer(由5×FQ buffer经双蒸水稀释为1×作为工作浓度)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分。

根据本发明的一个优选实施方案，上述1×FQ buffer工作液各主要成分和浓度如下：50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、50mM KCl、0.01％的明胶等。

本发明的另一个目的是提供一种用于快速检测A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)病毒核酸提取试剂；(2)逆转录酶系和Taq酶系；(3)双色荧光PCR反应体系(PCR MIX)；(4)阳性和阴性质控品。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的双色荧光定量PCR反应体系(PCR MIX)是由相应特异性上游和下游引物、荧光探针(Fam或者VIC荧光标记)、荧光定量PCR反应缓冲液(FQ-Buffer，内含镁离子、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体(dNTPs)、PCR扩增增强剂和去离子水等成分构成的反应体系。

根据本发明的一个优选实施方案，的反应体系设置为25ul，具体配制方法是：上述PCR-MIX20ul、AMV逆转录酶1ul、Taq耐热DNA聚合酶1ul以及提取的RNA或者阳性质控品或者阴性质控品分别为3ul。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性质控品是指A型口蹄疫病毒的特异性扩增片段，经过克隆连接到T载体上，构成的重组质粒，经过严格定量，其浓度为10⁷copies/ml。FMDV-A和FMDV-U普通定性PCR的扩增结果见图1。对阳性质控品进行梯度稀释，其扩增的标准曲线和动力学曲线如图2和3。

根据本发明的一个优选实施方案，稀释阳性质控品(10⁷copies/ml)，浓度梯度为每ml 1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹copies，进行灵敏度实验，结果证实本试剂盒检测灵敏度为：1.0×10²copies/ml，该双色荧光定量PCR的方法敏感性和精确性优于RT-PCR方法。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的试剂盒由于采用的是双色荧光探针PCR技术，不但可以检测A型口蹄疫病毒，还可以检测各型口蹄疫病毒即所谓的口蹄疫病毒通用型(FMDV-U)的检测。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的快速实时定量检测是通过一步RT-PCR双色荧光探针体外扩增法同时对口蹄疫病毒(FMDV-A)和各型口蹄疫病毒(FMDV-U)进行定量检测，无需专门的逆转录反应过程，简化了检测流程。

为了完成本发明的方法，首先采集标本放在离心管中，密闭送检。然后取500μl样品液加入500μl病毒浓缩液充分震荡，4℃冷冻离心机13,000rpm离心10min，去上清，保留50μl左右的样品液体，加入500μl Trizol reagents(RNA提取液)充分震荡，室温放置5min。对于血清或血浆等，取500μl血清加入500μl病毒浓缩液充分震荡，4℃冷冻离心机13,000rpm离心10min，去上清，保留50μl左右的样品液体，加入500ul Trizol reagents(RNA提取液)充分震荡，室温放置5min。对于肺脏等组织等，取50mg左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入500μl Trizol reagents(RNA提取液)，研磨或振荡，转移到1.5mL的EP管中，室温放置5min。然后加入100ul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min，4℃13,000rpm离心10min。小心将上层水相转移到干净离心管中，加等体积异丙醇，充分混匀，13,000rpm离心10min。弃上清，加入500μl 75％的DEPC乙醇，充分混匀，13,000rpm离心10min，小心吸去大部分乙醇。将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20μl DEPC H2O溶解沉淀。

根据本发明的再一个优选实施方案，取出新型甲型流感病毒H1N1亚型-PCR反应液(PCR MIX，内含有扩增用的引物探针和离子等)、Taq酶系、逆转录酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。每个测试反应体系配制如下表：

试剂	PCR MIX	Taq酶系	逆转录酶系
				用量	20μl	1μl	1μl

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定每个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(提取的RNA)、阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心10秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阳性质控品、阴性质控品以及未知标本，并设置样品名称和标记荧光基团种类(报告基团设置为FAM和VIC、淬灭基团TAMRA)。

根据本发明的再一个优选实施方案，用于扩增的条件为：ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000(需要剪掉反应盖)，ABI PRISM 7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件：42℃→20分钟，然后93℃→2分钟，然后93℃30秒→55℃45秒，检测荧光信号，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器：循环条件：42℃→20分钟，93℃→2分钟，然后93℃5秒→58℃45秒，检测荧光信号，共40个循环。反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时要注意以下问题：阴性质控品应为全部阴性；新型甲型流感病毒H1N1亚型-阳性质控品，阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

根据本发明的一个优选实施方案，用其它病毒感染的阳性标本(猪蓝耳病标本、猪细小病毒标本、猪疱疹病毒、水泡病毒、猪瘟病毒等)进行特异性实验，结果证实，本试剂盒特异性较好，吻合度为100％。

本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性好和稳定好的性能。在-20℃条件下试剂盒可有效期可以达12个月。

四、附图说明

图1显示常规PCR扩增特异性片段，2％的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从左到右依次是分子量Marker、FMDV-A、FMDV-U和阴性对照RT-PCR的扩增结果。图2显示阳性质控品扩增动力曲线，梯度稀释；图3为阳性质控品标准曲线。

五、具体实施方式

实施例1：标本采集

本发明的方法和试剂盒适用标本类型包括发病动物水泡液、淋巴结等组织；病毒细胞培养液、血清等。发病动物水泡液、淋巴结等需无菌条件下取1g左右组织块，置入1.5ml洁净EP管，立即送检。病毒细胞培养液：取500μl左右，置入1.5ml洁净EP管，立即送检。血清，用一次性注射器常规取抽血2-3ml，注入5ml干燥管中，密闭送检。以上标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

实施例2：口蹄疫病毒RNA的提取

取500μl样品液加入500μl病毒浓缩液充分震荡，4℃冷冻离心机13,000rpm离心10min，去上清，保留50μl左右的样品液体，加入150ul RNA提取液充分震荡，室温放置5min。加入100ul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min，4℃13,000rpm离心10min。小心将上层水相转移到干净离心管中，加等体积异丙醇，充分混匀，13,000rpm离心10min。弃上清，加入500μl 75％的DEPC乙醇，充分混匀，13,000rpm离心10min，小心吸去大部分乙醇。将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20μl DEPC H2O溶解沉淀。取50μl阴性质控品加入150μl RNA提取液充分震荡，室温放置10min。后按上述操作，阳性质控品可直接取3μl进行扩增。

实施例3：口蹄疫病毒FMDV-A和FMDV-U的检测

取出双色荧光PCRMIX、Taq酶系，逆转录酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。每个测试反应体系配制如下，PCR MIX 20μl，Taq酶系和逆转录酶各1ul，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(提取RNA)或阳性质控品或阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心10秒。

将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品以及未知标本并设置样品名称，设置荧光基团种类(报告基团选择FAM和VIC猝灭基团选择TAMRA)和循环条件：ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等使用薄壁管的仪器循环条件42℃→20分钟，后93℃→2分钟，后93℃30秒→55℃45秒，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件42℃→20分钟，93℃→2分钟，后93℃5秒→58℃45秒，共40个循环。

实施例4：结果分析和判定

反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。需要满足：阴性质控品应为全部阴性；阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则此次试验视为无效，全部试验应重新进行。本发明的试剂盒结果的判断有如下几种情况，见表1：

表1.A型口蹄疫病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒结果判断

阳性质控	阴性质控	FAM荧光	VIC荧光	结果判断
					+	-	+	+	FMDV-A阳性；FMDV-U阳性
+	-	+	-	FMDV-A阳性；FMDV-U 阴性
					+	-	-	+	FMDV-A阴性；FMDV-U阳性
+	-	-	-	FMDV-A阴性；FMDV-U阴性

六、序列表

SEQUENCE LISTING

<110>北京索奥生物医药科技有限公司

<120>一种A型口蹄疫病毒双色荧光PCR检测方法及其试剂盒

<130>

<160>6

<170>PatentIn version    3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

cttcaacttt ggtgcagttc    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

agagctcagc acgcttcatg    20

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gccacgacca tccacgagct tctc    24

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

caggctaagg atgcccttca         20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gtcccagtcc ccttctcaga t      21

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

accccgaggt aacacgcgac actc    24

Claims (4)

1.本发明为一种A型口蹄疫病毒的(FMDV-A)的双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，从样品中提取口蹄疫病毒RNA，通过一步RT-PCR双色荧光探针扩增法对A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病毒RNA进行扩增，达到实时快速定量检测之目的。

2.根据权利要求1所述的一种检测A型口蹄疫病毒的双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，特征在于试剂盒中同时引入了针对各型口蹄疫病毒(FMDV-U)的平行检测。

3.根据权利要求1所述的双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，所设计的引物和荧光探针序列为：

(1)A型口蹄疫病毒(FMDV-A)：

上游引物：5’-CTTCAACTTTGGTGCAGTTC-3’；

下游引物：5’-AGAGCTCAGCACGCTTCATG-3’；

荧光探针：FAM-5’GCCACGACCATCCACGAGCTTCTC 3’-TAMRA

(2)各型口蹄疫病毒(FMDV-U)：

上游引物：5’-CAGGCTAAGGATGCCCTTCA-3’；

下游引物：5’-GTCCCAGTCCCCTTCTCAGAT-3’；

荧光探针：VIC-5’ACCCCGAGGTAACACGCGACACTC 3’-TAMRA

其中检测FMDV-A基因的探针荧光标记为FAM，检测FMDV-U基因的探针荧光标记为VIC，淬灭基团均TAMRA。

4.根据权利要求1所述一步法扩增程序如下：ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等扩增仪，42℃→20分钟，然后93℃→2分钟，然后93℃30秒→55℃45秒(检测荧光)，40个循环；LightCycler等扩增仪，42℃→20分钟，然后93℃→2分钟，然后93℃5秒→58℃45秒(检测荧光)，共40个循环。

Images