CN104388597B

CN104388597B - Fmdv通用型和o型二重荧光定量pcr检测方法

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Publication number: CN104388597B
Application number: CN201410755420.0A
Authority: CN
Inventors: 闫若潜; 吴志明; 王淑娟; 赵雪丽; 刘梅芬; 方先珍; 马震原; 刘琨; 李少阳; 张林海; 董海岚; 郭小玲; 曹伟伟; 肖锦红; 郭瑞英
Original assignee: HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN104388597A

Abstract

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种FMDV（口蹄疫病毒）通用型和O型二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法。该方法包括引物设计、总RNA的制备、反转录、FMDV通用型和O型标准品的制备、二重FQ‑PCR反应、结果判定等步骤。本发明所提供的FMDV‑T/FMDV‑O二重TaqMan MGB FQ‑PCR检测方法可实现一个反应同时对通用型和O型FMDV进行快速鉴别检测，可在1 h～2 h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测FMDV的要求。

Description

FMDV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种FMDV（口蹄疫病毒）通用型和O型二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法。

背景技术

口蹄疫( Foot and Mouth Disease，FMD) 是由口蹄疫病毒( Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的以偶蹄动物为主的口腔粘膜、四肢下端和乳房等处皮肤发生水泡和溃烂为典型临床特征的一种热性、急性、烈性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A 类动物传染病之首，我国也将其列为一类动物传染病首位。其发病特征是传播途径多，传播速度快，传染性强，病原变异大，危害严重，因此曾多次在世界上引起流行。该病的暴发和流行常常给畜牧业生产和经济发展造成巨大的损失，主要是由于患病动物死淘率增加、生产性能下降、种用价值丧失，更重要的是任何国家和地区都不与有口蹄疫国家进行贸易往来，严重影响了经济贸易与畜牧业的发展，并造成相关的政治、经济和社会问题，因而倍受世界各国的关注。随着我国规模养殖业的不断发展，口蹄疫传播的风险越来越大，加之流行毒株血清型的不断改变，使得口蹄疫控制难度不断加大，所以目前有效控制口蹄疫发生的主要措施仍然是免疫接种和综合预防。

口蹄疫最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等；黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。本病以牛最易感，羊的感染率低。从流行特点来看，羊是FMDV的储存器，猪是感染的放大器，牛是发病的指示器，牛、猪、羊感染后，症状最明显的是牛、最不明显的是羊，而感染后排毒最强的是猪，其呼出的气体中FMDV是牛的20倍。该病传染快、流行广、发病率高，往往牛、羊、猪在同一时间内发病。近年来，猪发生有扩大的趋势，特别是O型口蹄疫。

口蹄疫病毒在环境中有很强的抵抗力，一有机会就会侵入动物机体复壮，并迅速扩增，因此环境的污染也可造成该病的传播，如污染的水源、棚圈、工具和接触过病畜人员的衣物、鞋帽等。口蹄疫是变异性很强的病毒，病毒突变株的广泛存在以及感染宿主的广泛性和环境因素的复杂性，使疫情的暴发往往不可预测并且难以控制。

FMDV分O型、A型、C型、南非1型（SAT1）、南非2型（SAT2）、南非3 型（SAT3）、亚洲Ⅰ型 (AsiaⅠ型)7 个血清型，各主型又分若干亚型，各主型之间无交叉免疫性，且可在不同种动物间传播，同一主型内的不同亚型之间也只有部分有交互免疫性。在欧洲流行的FMDV主要是O型，南美州以O型、A型和C型为主，亚洲则以O型、A型、C型和Asia I为主型，然而FMDV的7种血清型中有6种流行于非洲，即O、A、C、SAT1型、SAT2型及SAT3型，并且SAT1型和SAT2型偶尔会从非洲侵入到中东国家。目前，我国流行的FMDV以O型和AsiaⅠ型为主，A型在我国新疆、上海等地区也曾有流行。O型FMDV目前共存在9个拓扑型，古典中国型(Cathay)，中东南亚型(ME-SA)，东南亚型(SEA)，欧洲南美型(Euro-SA)，印度尼西亚1型(ISA-1)，印度尼西亚2型(ISA-2)，东非1型(EA-1)，东非2型(EA-2)和西非型(WA)。当前我国主要流行三种遗传拓扑型（Topotype）的O型口蹄疫病毒，分别属于CATHAY型（中国型）、ME-SA型（中东-南亚型）和SEA型（东南亚型）。

目前已有的Asia I型FMD用液相阻断ELISA、O型FMD用正向间接血凝试验或液相阻断ELISA、非结构蛋白（NSPs）间接ELISA等血清学方法只能评价口蹄疫单一血清型抗体水平。国内也有研究者建立了针对口蹄疫病毒O型、A型与AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法，但RT-PCR方法作为动物疫病病原学检测方法虽然具有较快速、特异的特点，但需要制胶、电泳等后续鉴定工作，操作复杂，而且增加了该方法对实验室的污染，因而尚待继续改进。

发明内容

本发明针对通用型（T型）和O型FMDV序列设计了新的引物和探针，提供了一种FMDV通用型和O型的二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法，经过一个PCR反应即可同时对通用型和O型FMDV核酸进行快速、特异、敏感的检测，在确定是否为FMDV感染的同时，又能确定是否是O型FMDV感染，该方法不需要电泳鉴定，能够简化操作，而且具有快速、特异、敏感性高的优点。

为实现本发明的目的，本发明分别根据不同亚型FMDV 共有基因片段和O型 FMDV VP1基因设计了特异性引物对和TaqMan MGB探针；通过优化反应体系组分、反应条件，进行特异性、灵敏性、重复性验证，而且利用建立成功的二重FQ-PCR方法进行了初步的应用检测实验。下面对本发明的具体技术方案介绍如下。

一种FDMV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（ 1 ）引物设计

引物序列包括一条特异性反转录引物FMDVR P0，两对特异性引物对FMDVT-F P1、FMDVT-R P2 、FMDVO-F P3、FMDVO-R P4，两条TaqMan MGB探针FMDVT-MGB-FAM-Probe Probe-P5、FMDVO-MGB-VIC-Probe Probe-P6，具体序列如下：

P0：cgggaaacgcatgagcagta，

P1：cggcctctcatccaacaga，

P2：attttccttcaggcgcttga，

P3：gcgcgctcctccgtact，

P4：cgtgtttcactgccacttctaga，

Probe-P5：5'-FAM- tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，

Probe- P6：5'- VIC- ccacctactacttcgca -MGB -3'；

（ 2 ）总 RNA 的制备

以口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与待检样品同时采用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：

分别取阳性对照、阴性对照及待检样品200 μL于1.5 mL离心管中，加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，4℃，12000 rpm离心10 min，取上清转入另1.5 mL离心管中，加200 μL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存；

（ 3 ）反转录

将步骤（2）中所提取的总RNA分别进行反转录，反转录体系如下：

步骤（2）中提取的总RNA，10μL；

5×M-MLV缓冲液，4 µL；

dNTPs，2.5 mmol/L、4 µL；

M-MLV反转录酶，200U/µL、0.5 µL；

RNA酶抑制剂，40U/µL、0.5 µL；

步骤（1）中P0引物，20μM、1 µL；

总体积10 µL；

37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃，15 min 灭活反转录酶，－20℃冻存备用；

同样方法对照组进行反转录；

（ 4 ） FMDV 通用型和 O 型标准品的制备

将含有FMDV-T基因片段（通用型）和FMDV-O基因片段（O型）的阳性扩增产物分别连接入pGEM-T Easy载体，转化至DH5α感受态细胞中，利用蓝白斑筛选挑选出重组菌，将挑选出来的菌进行培养、鉴定，将菌液鉴定和酶切鉴定阳性的重组菌株送宝生物工程（大连）有限公司进行测序；

将测序正确的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组阳性质粒，应用分光光度计测定并计算其OD₂₆₀、OD₂₈₀值及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，共重复5次取平均值，确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用；

（ 5 ）口蹄疫病毒通用型和 O 型二重 FQ-PCR 反应条件

将步骤（4）所得的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁶ 拷贝/μL作为检测模板，对照组和待检测样品分别进行荧光定量PCR反应，反应体系如下：

P1引物，20μM、0.5µL；

P2引物，20μM、0.5µL；

P3引物，20μM、0.5µL；

P4引物，20μM、0.5µL；

Probe-P5，10μM、0.6µL；

Probe-P6，10μM、0.8µL；

dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL；

10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL；

Ex Taq酶，5U/μL 、0.25 μL；

1.0×10⁶拷贝/μL的质粒模板，2 μL；

反应体系，25μL；

反应程序：94℃，5 min，94℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环；

（ 6 ）结果判定

阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整；

在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞40.0或无；阳性对照的Ct值应≤35.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；

检测结果成立的前提下，若样品在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式Ct值≤35.0，而且出现两条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒并且为O型；若样品在“FAM/NONE”或“VIC/NONE”标记模式下出现Ct值≤35.0，而且出现一条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒，但不是O型；Ct值＞38.0或无，并且无特定的扩增曲线，并且阳性对照的Ct值≤35.0，则判定为阴性；

38.0≥Ct值＞35.0且有特定的扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

本发明通过特异性的设计相关引物及探针序列，提供了一种FMDV-T / FMDV-O二重TaqMan MGB FQ-PCR检测方法，该方法可实现一个反应同时对通用型和O型FMDV进行快速鉴别检测的效果，可在1 h～2 h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测FMDV的要求。

附图说明

图1：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR扩增曲线；图注说明：1为FAM探针FMDV-T扩增曲线，2为VIC探针FMDV-O扩增曲线，3、4为阴性对照；

图2：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR检测FMDV-T敏感性扩增曲线；图注说明：自左到右1～8为分别对应的质粒浓度1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰ 、 1.0×10^-1拷贝/µL；9为阴性对照；

图3：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR检测FMDV-T标准曲线；

图4：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR检测FMDV-O敏感性扩增曲线；图注说明：自左到右1～8为分别对应的质粒浓度1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰ 、 1.0×10^-1拷贝/µL；9为阴性对照；

图5：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR检测FMDV-O标准曲线；

图6：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR体系单一检测FMDV-T特异性扩增曲线；图注说明：1：FMDV-T FAM扩增曲线；2：FMDV-O FAM扩增曲线, 3、4：阴性对照；

图7：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR体系单一检测FMDV-O特异性扩增曲线；图注说明：1：FMDV-O VIC扩增曲线；2：FMDV-T VIC扩增曲线；3、4：阴性对照；

图8：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR检测其他病毒特异性扩增曲线；图注说明：1：FMDV-T扩增曲线；2：FMDV-O扩增曲线；3、4：PEDV cDNA；5、6：TGEV cDNA；7、8：阴性对照；

图9：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR方法重复性和稳定性试验结果图；图注说明：T1-3、T4-6、T7-9、T10-12分别对应的质粒浓度为1.0×10⁵、1.0×10⁴、 1.0×10³、1.0×10² 拷贝/µL的FMDV-T扩增曲线，O1-3、O4-6、O7-9、O10-12分别对应的质粒浓度为1.0×10⁵、1.0×10⁴、 1.0×10³、1.0×10² 拷贝/µL的FMDV-O扩增曲线；

图10：FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR方法对15份疑似样品检测结果图；图注说明：P1、P2为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型细胞灭活病毒标准株等量混合物阳性对照；扩增曲线中Ct值≤35.0的实线为FMDV-T阳性，Ct值≤35.0的虚线为FMDV-O阳性，Ct值＞38.0或无为阴性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

介绍具体实施例前，对本实施例中所用主要实验材料简介如下。

（1）毒株

经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物，来自广州纳特生物科技有限公司阳性对照，其他对照病毒株由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存，需要说明的是，对照病毒株也可由公开渠道从其他途径或这本单位获得。

（2）主要仪器和试剂

荧光PCR仪，美国ABI公司产品，型号ABI7000；

PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；

凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；

恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；

台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；

Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司；

pGEM-T Easy载体、JM109感受态细胞购自Promega公司。

实施例

本发明所提供的口蹄疫病毒通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（ 1 ）引物设计和合成

经大量比对GenBank中FMDV基因序列，选取不同亚型FMDV共有基因和O型 FMDV VP1基因高度保守且具有型特异性基因序列为模板，设计了一条特异性反转录引物FMDVR P0，两对特异性引物对FMDVT-F P1、FMDVT-R P2 、FMDVO-F P3、FMDVO-R P4，两条TaqMan MGB探针FMDVT-MGB-FAM-Probe Probe-P5、FMDVO-MGB-VIC-Probe Probe-P6，具体序列如下：

P0：cgggaaacgcatgagcagta，

P1：cggcctctcatccaacaga，

P2：attttccttcaggcgcttga，

P3：gcgcgctcctccgtact，

P4：cgtgtttcactgccacttctaga，

Probe-P5：5'-FAM- tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，

Probe- P6：5'- VIC- ccacctactacttcgca -MGB -3'；

序列由宝生物工程（大连）有限公司合成。

（ 2 ）总 RNA 的制备

以口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞（购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心）培养物为阴性对照，与待检样品同时采用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：

分别取阳性对照、阴性对照及待检样品200 μL于1.5 mL离心管中，加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，4℃，12000 rpm离心10 min，取上清转入另1.5 mL离心管中，加200 μL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存。

（ 3 ）反转录

步骤（2）中提取的总RNA，10μL；

5×M-MLV缓冲液，4 µL；

dNTPs，2.5 mmol/L、4 µL；

M-MLV反转录酶，200U/µL、0.5 µL；

RNA酶抑制剂，40U/µL、0.5 µL；

P0引物，1 µL；

总体积10 µL；

37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃、15 min 灭活反转录酶，－20℃冻存备用。

（ 4 ） FMDV 通用型和 O 型标准品的制备

将含有FMDV-T基因片段（通用型）和FMDV-O基因片段（O型）的阳性扩增产物分别连接入pGEM-T Easy载体，转化至DH5α感受态细胞中，利用蓝白斑筛选挑选出重组菌，将挑选出来的菌进行培养、鉴定，将菌液鉴定和酶切鉴定阳性的重组菌株送宝生物工程（大连）有限公司采用T7和SP6引物进行测序；将测序正确的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组阳性质粒，应用分光光度计测定并计算其OD₂₆₀、OD₂₈₀值及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，共重复5次，确定质粒DNA的拷贝数和纯度，经测定，pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O质粒OD₂₆₀平均值分别为2.360和2.457，OD₂₈₀平均值分别为1.197和1.311，OD₂₆₀/ OD₂₈₀平均值分别为1.971和1.873；参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算出pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O质粒拷贝数分别为1.81×10¹⁰拷贝/μL和1.88×10¹⁰ 拷贝/μL，将二者按照10倍倍比稀释的方法分别稀释至10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰、10^-1拷贝/μL，－20℃保存备用。

将步骤（4）所得的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁶ 拷贝/μL作为检测模板，P1/P2、P3/P4引物对分别稀释为终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 µmol/L，Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 µmol/L，应用荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同浓度的FMDV-T / FMDV-O引物和探针组合，筛选出了针对FMDV-T / FMDV-O的二重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件：

P1引物，20μM、0.5µL；

P2引物，20μM、0.5µL；

P3引物，20μM、0.5µL；

P4引物，20μM、0.5µL；

Probe-P5，10μM、0.6µL；

Probe-P6，10μM、0.8µL；

dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL；

10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL；

Ex Taq酶，5U/μL、0.25 μL；

1.0×10⁶拷贝/μL的质粒模板，2 μL；

反应体系，25μL；

反应程序：94℃，5 min，94℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

最佳反应条件下的FQ-PCR结果参见图1。

（ 6 ）结果判定

在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞40.0或无；阳性对照的Ct值应≤35.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。

检测结果成立的前提下，若样品在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式Ct值≤35.0，而且出现两条特定的扩增曲线，表明样品中存在FMDV并且为O型；若在“FAM/NONE”或“VIC/NONE”标记模式下出现Ct值≤35.0，而且出现一条特定的扩增曲线，表明样品中存在FMDV，但不是O型；Ct值＞38.0或无，并且无特定的扩增曲线，并且阳性对照的Ct值≤35.0，则判定为阴性；

本发明所提供的的FMDV-T / FMDV-O二重TaqMan MGB FQ-PCR检测方法可实现一个反应同时对通用型和O型FMDV进行快速鉴别检测，可在1 h～2 h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测FMDV的要求。

实验检验

敏感性试验和标准曲线的建立

将步骤（4）所制备的10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰、10^-1拷贝/μL pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O重组质粒分别作等量混合，每种质粒终浓度调整为10⁶～1.0×10^-1 拷贝/μL，共8个稀释度，按步骤（5）优化的FQ-PCR反应条件进行FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR敏感性试验。

FMDV-T/FMDV-O的敏感型试验结果分别见图2、图4。

分别以pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重组质粒起始模板数的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立二重FQ-PCR方法的标准曲线。

pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O的标准曲线分别见图3、图5。

检测结果表明，二重FQ-PCR检测FMDV-T和FMDV-O最低检出限均为1.0×10¹ 拷贝/μL。

由敏感性检测结果建立FMDV-T标准曲线，相关系数为0.999，斜率为－3.11，截距为36.10，从而可以得出拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=－3.11×log拷贝数+36.1；

由敏感性检测结果建立FMDV-O标准曲线，相关系数0.995，斜率为－3.28，截距为35.29，从而可以得出拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=－3.28×log拷贝数+35.29。

根据仪器读取的Ct值代入表达式就可算出FMDV-T和FMDV-O的初始拷贝数。以FMDV-T标准曲线为例，若Ct值为20，带入公式Ct=－3.11×log拷贝数+36.1，即可算出其拷贝数约为10⁵拷贝/μL。

特异性检验

按步骤（2）、步骤（3）方法对猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）提取RNA并进行反转录，同时以经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，按步骤（5）优化的FQ-PCR反应条件分别进行单一的和二重的FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。

测定结果如图6、图7图8所示。测定结果显示，Ct值分别为16.8和18.4，且出现特定的扩增曲线；但BHK-21细胞培养物、PEDV、TGEV等均未出现特定的扩增曲线。

稳定性和重复性试验

分别将4个浓度（1.0×10⁵～1.0×10²拷贝/μL）的10倍系列稀释的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重组等量质粒混合物按照步骤（5）优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。

测定结果如图9所示。重复性试验结果表明，浓度为1.0×10⁵拷贝/µL、1.0×10⁴拷贝/µL、1.0×10³拷贝/µL、1.0×10²拷贝/µL的4个浓度的FMDV-T/FMDV-O重组质粒等量混合物3次试验结果均为阳性，说明建立的FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性。

应用试验

依据建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR和口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型三重RT-PCR普通检测方法，配制检测试剂，以口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，对15份临床疑似FMDV感染样品（样品编号为：1～15，由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存）进行了应用检测，对这两种方法的检测结果进行比较分析，并与FMDV病毒分离鉴定和测序结果比较。

测定结果如图10所示。结果表明，采用FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR检测，9份为FMDV-T阳性，7份为FMDV-O阳性；采用PCR检测5份为FMDV-T阳性，4份为FMDV-O阳性。表明本发明建立的FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR方法比PCR方法的灵敏性高，该FQ-PCR方法检测结果与FMDV-T/FMDV-O病毒分离鉴定和FMDV 共有基因、O型 FMDV VP1基因测序结果符合率为100%。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省动物疫病预防控制中心

<120> FMDV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法

<130> none

<140> 2014107554200

<141> 2014-12-11

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 反转录引物

<400> 1

cgggaaacgc atgagcagta 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 特异性引物对P1

<400> 2

cggcctctca tccaacaga 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 特异性引物对P2

<400> 3

attttccttc aggcgcttga 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 特异性引物对P3

<400> 4

gcgcgctcct ccgtact 17

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 特异性引物对P4

<400> 5

cgtgtttcac tgccacttct aga 23

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> TaqMan MGB探针P5

<400> 6

tcatttgtga aacgcg 16

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> TaqMan MGB探针P6

<400> 7

ccacctacta cttcgca 17

Claims

1.一种PCR检测用引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括一条特异性反转录引物FMDVR P0，两对特异性引物对FMDVT-F P1、FMDVT-R P2 、FMDVO-F P3、FMDVO-R P4，两条TaqMan MGB探针Probe-P5、Probe-P6，具体核酸序列如SEQ ID NO.1~7所示，具体为：

P0：5'-cgggaaacgcatgagcagta-3'，

P1：5'-cggcctctcatccaacaga-3'，

P2：5'-attttccttcaggcgcttga-3'，

P3：5'-gcgcgctcctccgtact-3'，

P4：5'-cgtgtttcactgccacttctaga-3'，

Probe-P5：5'-FAM- tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，

Probe- P6：5'- VIC- ccacctactacttcgca -MGB -3'。

2.权利要求1所述PCR检测用引物组合物在制备检测FDMV通用型和O型的二重荧光定量PCR检测试剂中的应用，其特征在于，检测过程具体包括如下步骤：

（1）总RNA的制备：以口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；

（2）反转录：将步骤（1）中所提取的总RNA分别进行反转录；

（3）FMDV通用型和O型标准品的制备：

将含有FMDV-T基因片段和FMDV-O基因片段的阳性扩增产物分别连接入pGEM-T Easy载体，培养、鉴定，将测序正确的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组质粒，测定并确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用；

（4）口蹄疫病毒通用型和O型二重FQ-PCR反应条件：

将步骤（3）所得的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组质粒分别稀释作为检测模板，对照组和待检测样品分别进行荧光定量PCR反应；

（5）结果判定：

阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准；

3.如权利要求2所述PCR检测用引物组合物在制备检测FDMV通用型和O型的二重荧光定量PCR检测试剂中的应用，其特征在于，步骤（4）中的PCR反应体系为：

P1引物，20μM、0.5µL；

P2引物，20μM、0.5µL；

P3引物，20μM、0.5µL；

P4引物，20μM、0.5µL；

Probe-P5，10μM、0.6µL；

Probe-P6，10μM、0.8µL；

dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL；

10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL；

Ex Taq酶，5U/μL 、0.25 μL；

1.0×106拷贝/μL的质粒模板，2 μL；

反应体系，25μL；

反应程序：94℃，5 min，94℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。