CN102220436A - 一种实时荧光定量rt-pcr检测fmdv的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型方法，经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示可以较好的将FMDV同偶蹄目其他易感病毒以及O型和AsiaⅠ型区分开，且灵敏度可以达到10个拷贝数的模板用量。本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。从获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。

Description

一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测口蹄疫病毒群特异性、O型特异性、AsiaⅠ特异性的方法。 

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由FMDV（Foot and mouth disease virus）感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性和接触性传染病。由于该病发病迅速，传染性较强可能带来严重的影响，因此世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类疫病。该病一经检出，相应的家畜及畜产品就禁止运输和出口，造成巨大的经济和政治影响。我国于2005年对外公布了AsiaⅠ型FMD 疫情，加上以前报道FMD，已经有2个血清型的口蹄疫疫情在国内出现过。FMD 的爆发和流行除了对畜牧业生产造成巨大的损失外，对人民生活所需要的奶品、肉品供应也造成很大的影响，故各国对 FMD的检验检疫非常严格。 

目前对于口蹄疫病毒的检测方法主要有：病毒分离、补体结合实验（CFT）、病毒中和试验（VNT）、动物接种试验及ELISA方法。这些方法操作起来过程繁琐且需时较长，特异性和灵敏度也无法满足目前检测需要。在病毒分离试验中培养细胞过程尤为细心谨慎以控制污染，而且病毒材料的致病力以及对于细胞适应性有区别，细菌和霉形体也会对细胞造成污染，因此获得的实验结果往往出现差异。 

因此，现有技术还有待于改进和发展。 

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，旨在解决现有技术中所存在的问题。 

本发明的技术方案如下： 

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性引物，其中，FMDV群特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示；FMDV O型特异性引物序列如SEQ NO.4-5所示；FMDV AsiaⅠ型特异性引物序列如SEQ NO.7-8所示。

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其中，FMDV群特异性探针序列如SEQ NO.3所示；FMDV O型特异性探针序列如SEQ NO.6所示；FMDV AsiaⅠ型特异性探针序列如SEQ NO.9所示。 

所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其中，所述FMDV群特异性探针、FMDV O型特异性探针和FMDV AsiaⅠ型特异性探针的5'端都标记发光基团FAM，3'端都标记泯灭基团TAMRA。 

一种使用上述的特异性引物和特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其中，包括以下步骤： 

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜；

S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；

S300、FMDV实时荧光定量RT-PCR扩增：以上述步骤所提取的RNA为模板，分别使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特异性引物、特异性探针进行PCR扩增；

S400、根据实时荧光定量RT-PCR反应结果鉴定诊断是否含有FMDV，并判断是否为O型或AsiaⅠ型FMDV。

所述的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其中，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和特异性探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL，RNase Free H₂O 6.0μL； 

反应条件为42℃ 30 min，92℃  2min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环。

有益效果：本发明利用实时荧光定量RT-PCR技术可以对FMDV进行种属性、O型和AsiaⅠ型的检测。经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示可以较好的将FMDV同偶蹄目其他易感病毒以及O型和AsiaⅠ型区分开，且灵敏度可以达到10个拷贝数的模板用量。同传统病毒分离实验相比较，如果针对分离的FMDV不适应细胞培养时，本发明方法更加显示出其优越性，而且需要极少的样品即可检测。另外，本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。从获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。 

附图说明

图1是实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群外的特异性扩增荧光曲线。 

图2 是实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群的特异性扩增荧光曲线。 

图3是实时荧光定量RT-PCR检测FMDV O型特异性扩增荧光曲线。 

图4是实时荧光定量RT-PCR检测FMDV AsiaⅠ型特异性扩增荧光曲线。 

图5是FMDV种属特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10。 

图6是FMDV O型特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度曲线图，从左到右的稀释倍数依次是：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10。 

图7是FMDV AsiaⅠ型特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10。 

图8是本发明实施例1中FMDV AsiaⅠ型特异性RT-PCR反应结果图。 

具体实施方式

本发明提供一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。 

本发明的目的是提供一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群特异性、O型特异性、AsiaⅠ特异性的方法。本发明方法的灵敏度经验证后可达到10个拷贝数的模板且可以同偶蹄目其他易感病毒分开，证明特异性良好。在使用荧光PCR仪Lightcycler实施本发明方法操作简单，污染性小，灵敏快速，从获得模板至检测出结果只需70min，在保证对口蹄疫病毒检测准确性的前提下大大缩短了检测时间。 

本发明的用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群特异性、O型特异性、AsiaⅠ特异性的方法的确立过程如下： 

1、特异性引物、探针设计：在GenBank中下载部分O型FMDV全基因序列（AF511039、DQ248888、AF506822、AF026168、AY317098、AY333431、AY686687、AY333431）、AsiaⅠ型FMDV全基因组序列（AY390432）和部分其他型FMDV的代表株。CLUSTAL X 比对后找出高度保守区域利用Oligo 6.0 进行特异性引物、探针设计。

2、特异性探针合成：由上海英骏生物技术有限公司合成。 

3、特异性探针处理：在特异性探针的5'端标记发光基团FAM，3'端标记泯灭基团TAMRA。     

4、FMDV及对照病毒RNA的提取：使用Mrcgene公司的TRIzol试剂对FMDV、传染性牛鼻气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、赤羽病毒、猪呼吸系统冠状病毒分别提取核酸，方法按照说明书进行，用20μL DEPC H2O溶解提取的RNA。

5、RT-PCR扩增：以步骤4中提取的FMDV RNA为模板，使用TaKaRa公司的一步法 RT-PCR试剂盒进行扩增，每条特异性引物的终浓度为0.2 μmol/L，反应条件为：50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 7min，设定为40个循环。电泳结束后取5μL在2%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果。 

6、目的基因的克隆、构建重组质粒：将步骤5中经RT-PCR扩增后检测到的目的条带胶回收，连接到pMD18-T载体中，转化，筛选。使用QIAGEN公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提重组质粒，操作步骤按照说明书进行，重组质粒送广州英骏公司测序，测序鉴定后作为标准阳性品。 

7、实时荧光定量RT-PCR方法的建立：                       

（1）FMDV群外特异性试验：分别利用设计的3套特异性引物、探针，以FMDV、传染性牛鼻气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、赤羽病毒、猪呼吸系统冠状病毒的核酸为模板做群外特异性荧光RT-PCR反应；同时用健康猪内脏组织提取的核酸作为阴性对照。反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和特异性探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL（total RNA＜1.0μg），RNase Free H₂O 6.0 μL反应条件为42℃ 30 min，92℃ 2 min，92℃ 10 s，55℃ 30s，40个循环；FMDV群外特异性试验结果图见图1。

（2）FMDV群特异性试验：分别以O型（O1和O2）和AsiaⅠ（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2）型FMDV基因组RNA为模板，使用FMDV群特异性引物、探针做实时荧光定量RT-PCR反应，同时用健康猪内脏组织提取的核酸作为阴性对照。FMDV群特异性试验结果图见图2。 

（3）FMDV O型特异性试验：分别以O型（O1和O2）和AsiaⅠ（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2）型FMDV基因组RNA为模板，同时用健康猪内脏组织提取的核酸作为阴性对照，使用O型特异性引物、探针进行实时荧光定量RT-PCR扩增，检验O型特异性引物、探针的特异性；反应体系和反应条件同FMDV群特异性试验。FMDV O型特异性试验结果见图3。 

（4）FMDV AsiaⅠ型特异性试验：分别以O型（O1和O2）和AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2）FMDV基因组RNA为模板，同时设置空白阴性对照，使用AsiaⅠ型特异性引物、探针进行实时荧光定量RT-PCR扩增，检验AsiaⅠ型引物探针的特异性；反应体系和反应条件同FMDV群特异性试验。FMDV AsiaⅠ型特异性试验结果见图4。 

（5）灵敏度试验：在紫外分光光度计上测定重组T载体的OD260，根据分子量大小和阿佛加德罗常数换算成拷贝数，然后10倍比稀释，在荧光PCR 仪上检测到的重组载体的最少拷贝数即是实时荧光定量RT-PCR的灵敏度。FMDV种属特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度结果见图5，O型特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度结果见图6，AsiaⅠ型特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度结果见图7。 

8、用于鉴别诊断FMDV群特异性、O型特异性、AsiaⅠ型特异性的实时荧光定量RT-PCR方法确立。 

本发明的用于鉴别诊断FMDV群特异性、O型特异性、AsiaⅠ型的实时荧光定量RT-PCR方法具体步骤如下： 

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜。

S200、RNA提取：使用Invitrogen 公司的TRIzol试剂对采集的样品提取RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。 

S300、FMDV 荧光定量RT-PCR扩增：以上述步骤所提取的RNA为模板，分别使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特异性引物、探针进行PCR扩增。 

其中，FMDV群特异性引物为F：5'-TGGGACCATACAGGAGAAG TT-3'，R：5'-CCAACGCAGGTAAAGTGATCTG-3'，FMDV群特异性探针P：FAM-GTCCACTCCGGACCTGAGAG-TAMRA；O 型特异性引物F：5'-AA CCCMCGGACGAACATGAC-3'，R：5'-CGATGTTGGCATACACCTTGAT-3'，O 型特异性探针P：FAM-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-TAMRA；AsiaⅠ型特异性引物为F：5'-TGGAGGAGCCGTTCTTGCTA-3'，R：5'-GCC ACCTGCGGAGTGAGT-3'，AsiaⅠ型特异性探针P：FAM-ACGGAGCCGA GACTTTCATCGTCG-TAMRA。 

反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和特异性探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL（total RNA＜1.0 μg），RNase Free H₂O 6.0μL反应条件为42℃ 30 min，92℃  2min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环。 

S400、根据荧光RT-PCR反应结果鉴定诊断是否含有FMDV，并判断是否为O型或AsiaⅠ型FMDV。 

实施例1 

针对2005年我国部分地区曾有FMDV流行史，我技术中心动检实验室在山东、江苏曾经FMDV疫区相关单位部门收集病料，使用本发明方法鉴别验证。

1、样品的预处理：对采集的样品分别编号1-10。分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜。 

2、RNA提取：使用Invitrogen 公司的TRIzol试剂对采集的样品提取RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。 

3、FMDV 实时荧光定量RT-PCR扩增：分别使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特异性引物、探针，以样品所提RNA为模板扩增，扩增所涉及的特异性引物、探针见上述材料。反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL（total RNA＜1.0 μg），RNase Free H₂O 6.0μL反应条件为42℃ 30 min，92℃  2min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环。 

4、结果：在FMDV群特异性RT-PCR反应中共出现3个阳性（3/10），O型特异性RT-PCR反应中共出现0个阳性（0/10），AsiaⅠ型特异性RT-PCR反应中共出现3个阳性（3/10），如图6所示。 

结果评估：本发明方法检测结果同提供样品单位分离鉴定结果一致，证明此方法的可行性。同时本发明方法操作简便快捷，仅涉及到核酸提取、配制反应体系等常规操作，在临床实践中便于开展大批量普查筛选FMDV。而且此方法中整个荧光RT-PCR反应是闭管操作，在最大程度上减少了污染性。 

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

[0046] 

<110>  珠海出入境检验检疫局

 

<120>  一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法

 

<130>  20080502

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV 群特异性引物

 

<400>  1

tgggaccata caggagaagt t                                                 21

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV 群特异性引物

 

<400>  2

ccaacgcagg taaagtgatc tg                                                22

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV 群特异性探针序列

 

<400>  3

gtccactccg gacctgagag                                                   20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV O 型特异性引物

 

<400>  4

aacccmcgga cgaacatgac                                                   20

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV O 型特异性引物

 

<400>  5

cgatgttggc atacaccttg at                                                22

 

 

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV O型特异性探针序列

 

<400>  6

tacgaccagt acaaggtwca caa                                               23

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV AsiaⅠ型特异性引物

 

<400>  7

tggaggagcc gttcttgcta                                                   20

 

 

<210>  8

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV AsiaⅠ型特异性引物

 

<400>  8

gccacctgcg gagtgagt                                                     18

 

 

<210>  9

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FMDV AsiaⅠ型特异性探针序列

 

<400>  9

acggagccga gactttcatc gtcg                                              24

 

 

Claims (5)

1.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性引物，其特征在于，FMDV群特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示；FMDV O型特异性引物序列如SEQ NO.4-5所示；FMDV AsiaⅠ型特异性引物序列如SEQ NO.7-8所示。

2.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其特征在于，FMDV群特异性探针序列如SEQ NO.3所示；FMDV O型特异性探针序列如SEQ NO.6所示；FMDV AsiaⅠ型特异性探针序列如SEQ NO.9所示。

3.根据权利要求2所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其特征在于，所述FMDV群特异性探针、FMDV O型特异性探针和FMDV AsiaⅠ型特异性探针的5'端都标记发光基团FAM，3'端都标记泯灭基团TAMRA。

4.一种使用如权利要求1所述的特异性引物和如权利要求2所述的特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜；

S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；

S300、FMDV 实时荧光定量RT-PCR扩增：以上述步骤所提取的RNA为模板，分别使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特异性引物、特异性探针进行PCR扩增；

S400、根据实时荧光定量RT-PCR反应结果鉴定诊断是否含有FMDV，并判断是否为O型或AsiaⅠ型FMDV。

5.根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其特征在于，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和特异性探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL，RNase Free H₂O 6.0μL；

反应条件为42℃ 30 min，92℃  2min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环。

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