CN104342500A

CN104342500A - 检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物、检测试剂盒和制备方法

Info

Publication number: CN104342500A
Application number: CN201410464773.5A
Authority: CN
Inventors: 张强; 卢昌; 赵志荀; 吴国华; 颜新敏; 李应国; 岳华; 周晓黎; 李健; 朱海霞; 代雪玲; 田波; 芦晓立; 高顺平; 王曼
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2014-09-15
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2034-09-15
Also published as: CN104342500B

Abstract

本发明公开一种可用于检测口蹄疫Asia1型病毒的引物及检测试剂盒和制备方法。本发明的一种口蹄疫Asia1型病毒的检测试剂盒中包括有四条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物。相关的实验表明，本发明的序列FMDV-Asia1-F和FMDV-Asia1-R可特异性快速扩增口蹄疫Asia1型病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，并具有极高的特异性。本发明GeXP多重基因分析系统能够高通量特异性检测口蹄疫Asia1型病毒，其灵敏度达到10²拷贝。

Description

检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物、检测试剂盒和制备方法

技术领域

本发明涉及一种可用于检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物及检测试剂盒和制备方法。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（OIE）列为A类传染病的首位。FMDV可以分为7个血清型，即A型、O型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型，每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫。

口蹄疫病毒的分型鉴别诊断一直是研究的热点。由于口蹄疫各血清型之间没有交叉保护，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫，这使得口蹄疫的诊断和控制更加困难。补体结合试验曾被用于口蹄疫诊断和病毒分型，直到1970s该方法仍在一些流行病地区使用，但是该方法的灵敏度比较低。Roeder 和Le Blanc Smith通过使用兔和豚鼠抗纯化146S口蹄疫病毒颗粒高滴度抗血清的ELISA方法成功地检测了口蹄疫病毒抗原。该方法的灵敏度比补体结合试验高125倍，并且被用作常规口蹄疫的诊断和病毒分型。但是ELISA方法检测含病毒的上皮悬浮液只有约70-80％阳性结果，因此病毒必须在组织培养中进行增殖后，再通过ELISA中进行检测和血清型分型。基于单抗的ELISA也被开发用于口蹄疫的诊断和病毒分型(Chen, H, et al.,2012；Morioka K, et al.,2009)。最近，有人研发了基础整联蛋白ανβ6和血清特异性单克隆抗体的夹心ELISA方法，并将该方法与普通的多克隆抗体夹心ELISA方法进行了比较。整合蛋白/单克隆抗体的ELISA可以识别FMDV的多种抗原和不同的血清型，虽然该方法在同一灵敏度的条件下比常规的多克隆ELISA具有更高的特异性，但是仍然有一些FMDVs不能被检测出来，(Ferris NP, et al.,2011)。

由于RT-PCR快速，灵敏和可靠性的优点，该方法已被广泛地用于口蹄疫诊断。近年来各种RT-PCR检测方法已用于早期上皮细胞，细胞培养分离和其组织中口蹄疫病毒RNA的检测(Meyer RF, et al.,1991)。Rodriguez等首次可通过RT-PCR对口蹄疫病毒O型、A型和C型进行分型检测(Rodríguez A, et al.,1992)。自此以后不同血清型特异性引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7个血清型份分型检测(Callens, et al.,1997; Vangrysperre, et al.,1996)。这些检测引物位于口蹄疫病毒基因组的不同位置，包括5'非编码区、开放阅读框和3'端非编码区。为了提高RT-PCR诊断灵敏度，多组引物结合的多重检测也被用于口蹄疫的检测(Giridharan P, et al.,2005; Bao H, et al.,2008)，但是这些RT-PCR方法的灵敏度依然有限，若前期再结合ELISA方法一起使用必然会使该过程更加耗时费力。

最近，实时荧光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的检测，该方法不需要PCR后期处理（例如凝胶分析）且通过应信号来直接监视目标cDNA的扩增。TaqMan实验的检测效果同抗原结合ELISA的病毒分离实验一样(Reid SM, et al.,2003)。目前，两种不同的实时荧光定量RT-PCR TaqMan实验已普遍使用，一种针对5'非编码区的内部核糖体进入位点（IRES）(Reid SM, et al.,2002)和第二种针对3D（RNA聚合酶）的编码序列。实时荧光定量RT-PCR方法的速度和准确性可以从样品核酸提取到实验建立的计算机操作的偶联进一步提高。这使得该检测适合于主要指示病例诊断和在持续疫情中的检测。实时/定量RT-PCR试验目前在许多发达国家作为一种口蹄疫病毒诊断和定量的常规测试。但是，这些实验不是专门设计用于的区分口蹄疫病毒血清型。已经证明5'端非编码区检测在A血清型病毒的检测中更敏感，而在3D检测试验对检测SAT病毒具有更高的灵敏度(King DP, et al.,2006)。另外，由于探针靶向区域的核苷酸错配，这些检测方法不能检测少量的FMDVs。因此，任何一种单独的检测方法不能100％的检测FMDV。最近，Tam等报道了用于口蹄疫病毒检测和病毒分型荧光多重rRT-PCR检测方法，该方法具有更高的检测灵敏度，但却不能区分某些血清型之间的交叉反应性(Tam S, et al.,2009)。

rRT-PCR便携式设备使得FMDV野外样品的检测成为可能，然而这种设备比较昂贵、比较脆弱且精密度要求比较高。因此，其他的方法，如环介导扩增的方法被用来进行野外样品的检测。LAMP在一个恒定的温度扩增特异性核苷酸序列，因此不需要热循环仪。该方法基于DNA序列通过一自动循环链置换反应扩增的原理，使用一组两个特别设计的内引物和两个外引物和具有链置换高活性的DNA聚合酶进行该测定法et al.,2000)。引物在初始阶段识别6个独立的靶序列和在LAMP反应的后期阶段识别4个独立的序列，使用标准的水浴或加热块进行该反应少于一个小时，然后对结果用肉眼进行可视化观察。其优点为其简单操作，反应快速且结果直观，这使得该方法已被许多疾病流行国家进行野外样品检测。已有口蹄疫病毒高通量的RT-LAMP的建立，然而该方法由于容易污染造成假阳性，就尚未得广范的认可(Dukes JP, et al.,2006)。

ELISA和RT-PCR结合的口蹄疫检测方法具有很高的可靠性和准确性，但样品从采样点到实验室的运输问题成为口蹄疫病毒早期诊断的最大障碍。因此，在疑似疫情点急需一种可以用于疾病快速诊断和特异性检测的方法。由Reid等人建立一种基于单克隆抗体的口蹄疫层析试纸条技术(Reid SM, et al.,2001)。该试纸条检测上皮悬浮液测试中的口蹄疫病毒抗原灵敏性与常规抗原ELISA灵敏性一样，且对口蹄疫病毒血清型O，A，C和Asia 1在细胞培养上清有着100％等效的敏感性，但是却不能够对这些血清型进行区分。因此，急需一种灵敏度高的能够特异性区分不同FMDV型别的高通量的检测方法。

研究表明，口蹄疫病毒的A、O、Asia 1三种血清型的RNA序列同源性约为70%左右，然而其编码结构蛋白的P1区域的差异比较好，该区域的核苷酸序列也常常被用来进行口蹄疫病毒的分型及进化分析。在病毒的这些基因中，VP1蛋白参与病毒的吸附、入侵、免疫反应，并且与病毒的血清型特异性有关。因此VP1的基因序列通常被用来进行FMDV不同毒株之间的亲缘关系分析，从而研究口蹄疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于口蹄疫的流行病学分析, 具有重要意义。根据口蹄疫病毒VP1基因组序列构建进化树分析发现，A型有10个亚型（Ⅰ-Ⅹ）；O型也有10个亚型，即欧洲-南美洲型（Euro-SA）、中东-南非型（ME-SA）、东南亚型（SEA）、中国型（CHY）、西非型（WA）、东非1型（EA-1）、东非2型（EA-2）、东非3型（EA-3）、印尼1型（ISA-1）和印尼2型（ISA-2）；Asia 1有6个亚型（Ⅰ-Ⅵ）。此外，VP1基因也常被用来进行A、O、Asia 1的分型检测。因此，本发明选择口蹄疫病毒的Asia 1型VP1序列作为靶基因的区域，根据GeXP多重PCR检测体系引物的要求设计口蹄疫病毒Asia 1型的特异性引物。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不能分型、灵敏度低及耗时长等不足的，可用于检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物，包括有这些引物的检测试剂盒，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。

本发明的用于检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。

本发明的口蹄疫Asia 1型病毒的检测试剂盒中包括有前述四条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.3的5’端添加有Cy5荧光标签。

本发明的口蹄疫Asia 1型病毒的检测试试剂盒非疾病诊断目的的使用方法是：以被检样品的RNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的阴阳性。

GeXP多重基因分析系统（GeXP Genetic Analysis System）是美国Beckman Coulter公司研发的用于多基因表达定量分析的平台。该系统将毛细管电泳分离技术和高灵敏的激光诱导荧光技术相结合，使基因表达定量分析实现了更高的灵敏度和更快的速度。该系统以mRNA为模版，在同一PCR反应体系中由荧光标记的通用引物和特异性嵌合引物引发的多种PCR反应，随后经毛细管电泳分离技术进行分析。该方法具有高通量、高准确性、高灵敏度等优点，目前已被逐步应用于各种疾病病原的检测中。在我国已经先后建立了水泡带状疱疹病毒、流感病毒、呼吸道病毒、手足口病以及乳头瘤病毒的GeXP多重PCR检测体系，但是目前国内外尚无基于GeXP鉴别诊断口蹄疫病毒试剂盒和检测方法的报道，同样单独或者联合使用可以鉴别检测口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP方法也尚无报道。

相关的实验表明，本发明的序列FMDV-Asia 1-F和FMDV-Asia 1-R可特异性快速扩增口蹄疫Asia 1型病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，但同等条件下不能扩增口蹄疫O型病毒、口蹄疫病毒A病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的核酸。

本发明GeXP多重基因分析系统能够高通量特异性检测口蹄疫Asia 1型病毒，其灵敏度达到10²拷贝。所涉及的引物具有很高的特异性和唯一性，其构成的试剂盒反应体系已经过优化和验证。本发明能够对口蹄疫病毒进行高灵敏度、快速高效、高通量的定性、定型和定量检测。相比于其他已存在的方法和试剂盒，本发明在用于港口检疫、动物流通环节检疫以及实验室诊断均很大的优势。

附图说明

图1为用本发明的口蹄疫Asia 1型病毒引物特异性验证的核酸电泳检测结果。其中：M为DL2000 Marker，第一泳道为口蹄疫Asia 1型病毒，第二泳道为口蹄疫O型病毒，第三泳道为水疱性口炎病毒，第四泳道为猪水泡病病毒。

由图1可见，口蹄疫Asia 1型病毒引物可以特异性地扩增出FMDV-Asia 1型的基因组片段，而口蹄疫A型病毒、口蹄疫O型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒均无特异性条带产生，说明口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物的特异性非常高。

图2为本发明的口蹄疫Asia 1型病毒引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中M为DL2000 Marker；第一泳道为10³个拷贝；第二泳道为10⁴个拷贝；第三泳道为10⁵个拷贝；第四泳道为10⁶个拷贝；第五泳道为10⁷个拷贝；第六泳道为10⁸个拷贝。由图可见10⁸~10⁵个拷贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可以看出本发明所设计的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物在58℃条件下PCR反应最少可以检出10⁵个拷贝的模板。

图3为本发明的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以看出在280bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用口蹄疫Asia 1型病毒的引物对口蹄疫O型病毒、口蹄疫A型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明本发明的口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物具有非常好的特异性。

图4至图7分别为本发明的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物的GeXP-PCR灵敏性检测结果，其中：图4为10⁴ copies/μL，图5为10³ copies/μL，图6为10² copies/μL，图7为10copies/μL。结果显示随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，图6显示当模板量为10² copies/μL时仍可以明显地检测到特异性的峰值，但当模板量为10 copies/μL时则没有任何特异性的信号峰，见图7。从图中可以看出本发明中所设计的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物在本发明检测体系中可以检测出10²copies/μL的模板。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细解说.

1. 序列的制备

根据GeXP引物设计要求和NCBI公布的FMDV-Asia 1型的基因组，选择保守区域设计特异性引物，并通过添加通用引物形成特异性嵌合引物，而通用引物序列属于非生物源性的核苷酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5’端添加Cy5荧光标签。本发明的可特异性扩增口蹄疫Asia 1型病毒核酸的引物序列为： AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC，在本发明中被命名为FMDV-Asia 1-F；GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC，在本发明中被命名为FMDV-Asia 1-R。用于本发明的通用引物：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA，在本发明中被命名为UWD-F；GTACGACTCACTATAGGGA，本发明中被命名为UEV-R。

2．病毒基因组提取

单层BHK细胞长至80%以上融合后，分别接种口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫A型病毒、口蹄疫O型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒病毒，37℃孵育30min后弃去毒液。加入细胞维持液，37℃ 5% CO₂培养，定期观察细胞病变（CPE），待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒反复冻融3次，置-20℃冰箱保存备用。使用TaKaRa 公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中的RNA。

3. FMDV-Asia 1引物特异性验证

以提取纯化的病毒RNA为模板进行扩增，实验体系如下：

反应条件如下：

各取前述5μL 的PCR产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照，参见图1。检测结果表明，口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物在58℃的条件下能特异性地扩增出FMDV-O基因组片段，而口蹄疫A型病毒、口蹄疫O型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒均无特异性条带产生，说明口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物的特异性非常高。

4. 口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物单重PCR灵敏性验证

利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定FMDV-Asia 1型基因组的浓度，根据FMDV-Asia 1型基因组的分子量和浓度计算其相应的拷贝数。对FMDV-Asia 1型基因组进行梯度稀释，取稀释度的基因组各1μL作为模板，检测单重PCR的敏感性，PCR反应体系为：

反应条件如下：

取上述不同浓度基因组作为模板的PCR产物样品各5μL进行核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果表明，10⁹~10⁴个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗，参见附图2。从图可看出本发明所设计的口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物在58℃下，可检出反应体系中10⁴个拷贝的模板。

5. 口蹄疫Asia 1型病毒GeXP-PCR的特异性检测

根据Beckman Coulter公司的GenomeLab片段分析策略，建立25μL的PCR反应体系，反应体系为：

RT-PCR反应：

PCR产物的毛细管电泳分析：

用甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS）对PCR产物进行10倍的稀释；配置上样反应体系（40μl），包含38.5μl的甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS），0.5μl的DSS 400（分子量内标-400），1μl的PCR产物稀释液；在漩涡器上震荡30s混匀，或用枪头混匀，并做简易离心以除去气泡，每孔加一滴石蜡油防止样品挥发；在缓冲液板与上样板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；进入GeXP的Set Up程序，输入样品名称，对每个样品指定Frag-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本。

毛细管电泳结束，导出实验数据并对实验结果进行分析，结果见附图3，从图可以看出在280bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用口蹄疫Asia 1型病毒的引物对口蹄疫O型病毒、口蹄疫A型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明口蹄疫Asia 1型病毒的GeXP引物具有非常好的特异性。

6. 口蹄疫Asia 1型病毒GeXP-PCR灵敏性检测

利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定口蹄疫Asia 1型病毒RNA的浓度，根据病毒RNA的分子量和浓度计算其相应的拷贝数。对病毒RNA进行梯度稀释，稀释至10⁶copies/μL~10 copies/μL，各取1μL作为模板，检测口蹄疫Asia 1型病毒GeXP-PCR的灵敏性。检测结果参见附图4至附图7。

结果显示，口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物在58℃下对不同浓度基因组进行GeXP-PCR后的检测结果。结果显示10⁴copies/μL~10² copies/μL的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/μL时检测不到任何特异性信号峰值。从图中可以看出本发明中所设计的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物在本发明检测体系中可以检测出10²copies/μL的模板。

综上可见，这里设计合成的4个基因序列以及其形成的GeXP方法可以快速检测Asia 1型口蹄疫病毒。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物、检测试剂盒和制备方法

<160> 4

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（FMDV-Asia 1-F）

<400>

aggtgacact atagaataac tgcctaccag aagcaacc 38

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（FMDV-Asia 1-R）

<400>

gtacgactca ctatagggaa gtatgtctcc gcacgcttc 39

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（FMDV-Asia 1-R）

<400>

aggtgacact atagaata 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（FMDV-Asia 1-R）

<400>

gtacgactca ctataggga 19

Claims

1.用于检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物，其特征在于引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。

2. 一种口蹄疫Asia 1型病毒的检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有四条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.3的5’端添加有Cy5荧光标签。

3. 权利要求2所述试剂盒非疾病诊断目的的使用方法，其特征在于以被检样品的RNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的阴阳性。