CN103898240A - 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法 - Google Patents

检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法，属于生物检测、生物化学领域，采用的技术方案是，提供一种检测登革Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病毒及其分型的方法并提供该方法所用的引导登革病毒基因反转录的引物SEQIDNo：1-4、扩增登革病毒目的片段的引物SEQIDNo：5-12及检测登革病毒的探针SEQIDNo：13-16。本发明的有益效果是：（1）针对不同血清型登革病毒分别设计特异性引物、探针序列，扩增效率及灵敏度、及准确性高；（2）多重反转录聚合酶链反应结合液相芯片，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，并且操作简单，检测速度快，能够对登革病毒进行快速分型检测。

Description

检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法
技术领域
  本发明属于生物检测、生物化学领域，具体涉及一种快速检测登革病毒及其四种血清分型的方法，提供特异性引物和探针。 
背景技术
 登革热是登革病毒感染引起，由蚊媒传播的急性传染病，是世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病。临床表现为高热、头痛、肌肉、骨关节剧烈酸痛、皮疹、淋巴结肿大、白细胞计数减少等，广泛流行于热带和亚热带地区的，以与中国接壤的东南亚国家最为严重。随着境外旅游、商务的发展，人口流动性增加，缺乏有效疫苗及治疗措施，登革热已经成为世界性的严重公共卫生问题。因此需要快速、灵敏的方法用于在感染过程中的早期对登革热感染进行检测以进行更好的进行病人管理。 
在对登革病毒检测方面，目前主要有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等方法。但这些方法或多或少存在一些缺陷：病毒分离不仅对样本有严格的要求，在技术上要求高，且获得病原学诊断结果至少需要１周，无法实现早期诊断病例的目的。而用血清免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还存在与其他黄病毒之间存在交叉反应。在核酸检测方法方面，RT-PCR方法及荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但大多方法基于单一血清型，在对临床样本进行检测时，无法对样本同时进行四种血清型检测，但仍然存在通量低的缺点。 
对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。 
基于微球的液相芯片技术，提供了一个新的应用面广泛的高通量核酸检测平台。它包含有直径5.6μm的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石（YAG）激光激发结合在微球表面的报告分子的荧光（R-藻红蛋白，Alexa532，或Cy3）。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同的反应。与其它检测方法相比，基于液相芯片技术的检测平台具有需标本量少、高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等优点。 
综上所述，采用多重PCR技术联合液相芯片技术，对登革病毒进行分型检测，不失为一种直观、准确、快速、适合早期诊断的检测手段。然而，现有的登革热病毒体外检测试剂盒或提供的引物、探针，或特异性和灵敏性较低，或存在假阳性结果，或检测步骤繁琐、检测条件设置复杂，因此，设计检测步骤简单、成本低、灵敏度及特异性高的方法及特异性及灵敏度高、且有利于实验条件设置的引物、探针，对提高检测登革病毒及其分型的方法的稳定性、准确性和实用性有重要意义，成为目前一直需要改进的问题之一。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法，    利用聚合酶链反应（PCR）结合核酸杂交技术，进一步利用多重反转录聚合酶链反应（RT-PCR）结合液相芯片技术对登革病毒及其分型进行特异性检测。 
为解决上述问题，本发明首先提供用于引导登革病毒基因反转录的引物，所述引物至少包括如下一条： 
用于引导登革I型病毒基因反转录的引物DV1-RTP，其序列为SEQ ID No：1所示；
用于引导登革Ⅱ型病毒基因反转录的引物DV2-RTP，其序列为SEQ ID No：2所示；
用于引导登革Ⅲ型病毒基因反转录的引物DV3-RTP，其序列为SEQ ID No：3所示；
用于引导登革Ⅳ型病毒基因反转录的引物DV4-RTP，其序列为SEQ ID No：4所示。
第二，本发明还提供用于扩增登革病毒目的片段的引物，所述引物至少包括如下一对： 
用于扩增登革I型病毒目的片段的引物对DV1-F和 DV1-R，其序列分别为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于扩增登革Ⅱ型病毒目的片段的引物对DV2-F和 DV2-R，其序列分别为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于扩增登革Ⅲ型病毒目的片段的引物对DV3-F和 DV3-R，其序列分别为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于扩增登革Ⅳ型病毒目的片段的引物对DV4-F和 DV4-R，其序列分别为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
第三，本发明还提供用于检测登革病毒分型的探针，所述探针包括如下 
Figure 2014101315920100002DEST_PATH_IMAGE001
至
Figure 2014101315920100002DEST_PATH_IMAGE002
 中的至少一种：
Figure 336043DEST_PATH_IMAGE001
 用于检测登革I型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：13 所示；
Figure 2014101315920100002DEST_PATH_IMAGE003
 用于检测登革II型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：14 所示；
Figure 2014101315920100002DEST_PATH_IMAGE004
 用于检测登革III型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：15 所示；
Figure 321929DEST_PATH_IMAGE002
 用于检测登革IV型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：16 所示。
最后，本发明还提供一种检测登革病毒及其分型的方法，所述方法包括如下步骤： 
1）合成上述用于扩增登革病毒目的片段的引物和用于检测登革病毒的探针，并对探针分别标记；
2）提取待测样品RNA，反转录形成cDNA模板；
3）以步骤1）所述引物对cDNA模板进行PCR扩增，得 PCR扩增产物；
4）将 PCR 扩增产物与步骤1）中合成的探针杂交，得杂交产物；
5）检测杂交信号并分析结果。
优选的，所述步骤1）合成引物后，对每对引物中的下游引物在5’端进行生物素标记；所述对探针的标记为对所有探针在5’端进行胺基化修饰，连接C12邻接臂序列，并与相应荧光编码的微球偶联，然后将偶联有不同探针的微球混合，制成探针微球组；所述步骤4）PCR 扩增产物与探针杂交后，对杂交产物进行抗链霉素藻红蛋白（英文全称Streptavidin-R-phycoerythrin，缩写SA-PE）标记，得微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；所述步骤5）对杂交信号的检测采用液相芯片系统。 
更优选的，所述步骤1）探针微球组中偶联有不同探针的微球个数相等。 
所述步骤5）对杂交信号的检测采用Bio-PlexTM 200检测系统。 
另外，步骤2）反转录形成cDNA时优选采用SEQ ID NO：1-4 所示的用于引导登革病毒基因反转录的引物。 
所述步骤3）PCR扩增采用不对称扩增，PCR体系中下游引物浓度为上游引物浓度的3-6倍。 
上述方法中，1）首先根据检测目的合成SEQ ID NO：5-12所示引物中的一对或多对及SEQ ID NO：13-16所示探针中的一个或多个，即如要检测登革I型病毒，则合成用于扩增登革I型病毒目的片段的引物对DV1-F和 DV1-R，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6，同时对应合成用于检测登革I 型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：13 所示；如要检测登革 II 型及登革III型病毒，则合成用于扩增登革II 型及登革III型病毒目的片段的引物对DV2-F和DV2-R、DV3-F和DV3-R，其序列分别为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8、SEQ ID No：9和SEQ ID No：10，同时对应合成用于检测登革II 型及登革III型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15 所示，其他合成方式类似上述，合成完毕后对不同种类探针进行标记以便于区分和检测；2）提取待测样品RNA采用本领域常用技术手段，加入引物使所提取的RNA序列反转录形成cDNA模板。其中，反转录引物优选的采用本发明提供的引物，其序列为SEQ ID NO：1-4所示，可特异性引导登革病毒基因反转录的引物从而进行多重反转录反应；3）对应选取上述用于PCR扩增的引物以cDNA为模板进行扩增，得PCR扩增产物；4）将PCR扩增产物与探针在设定条件下进行杂交反应；5）根据探针标记检测杂交结果并分析。 
基于上述方法，本发明优选多重不对称PCR扩增结合液相芯片技术以检测登革病毒及其分型。以检测登革病毒的四个分型为例，具体步骤如下：1）合成SEQ ID No：1-4所示的用于引导登革病毒基因反转录的引物、SEQ ID No：5-12所示扩增登革病毒目的片段的引物、及SEQ ID No：13-16所示用于检测登革病毒分型的探针，其中，用于PCR扩增反应的所有下游引物序列在5’端进行生物素标记以利于后期信号标记，所有探针在5’端均进行胺基化修饰且连接C12邻接臂序列，然后与相应荧光编码的微球偶联，将偶联有不同探针的微球等个数混合制成探针微球组；2）提取待测样本RNA，以SEQ ID No：1-4所示引物进行多重反转录反应，得cDNA模板；3）以步骤1）中用于PCR扩增的引物对cDNA模板进行多重不对称PCR扩增反应，得PCR扩增产物；优选的，扩增体系中所加入下游引物的浓度为上游引物浓度的3-6倍，以增加目的片段的产量；4）将步骤3）所得PCR扩增产物与探针微球组在设定条件下进行杂交反应，得杂交产物，进一步对杂交产物进行抗链霉素藻红蛋白（英文全称Streptavidin-R-phycoerythrin，缩写SA-PE）标记，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；上述所称的杂交是指PCR产物变性后与偶联有不同探针的微球组充分混合，并在一定的温度条件下进行核酸单链间互补配对杂交的过程；5）取微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物以液相芯片系统优选Bio-PlexTM 200检测其杂交信号，并根据本发明所提供标准进行结果分析及判定。本发明所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
本发明的有益效果是：（1）针对四种血清型登革病毒，对RNA特异基因进行特异性反转录反应，增加了病毒检测的特异性，减少了后期PCR扩增中非特异序列对扩增的影响，提高扩增效率，具有较高的灵敏度；（2）用于PCR扩增的特异基因序列的引物，都有很高的灵敏度，提高了检测的准确性；（3）针对不同血清型别登革病毒的特异性探针序列，碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物的杂交温度条件基本一致，有利于同一温度下杂交的同步性，提高检测的准确性；（4）本发明的方法利用多重反转录聚合酶链反应结合液相芯片，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，并且操作简单，检测速度快，能够对登革病毒进行快速分型检测。 
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂、及所合成的引物和探针序列等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
实施例1：引物、探针序列的设计及合成 
从 Genebank 中搜索登革病毒靶基因nonstructural protein NS5的序列，运用 相关生物信息学软件进行同源性分析和序列比对分析，筛出高度保守区域，针对保守序列采用引物设计软件 Primer Premier 5 进行引物及探针的设计；引物及探针设计完毕后使用 NCBI  BLAST进行特异性的检验，并使用Primer premier 5检测是否有发夹结构或者二聚体形成，结果表明设计探针满足特异性要求，且不会形成发夹结构或者二聚体。所设计的引物、探针序列见表1。
表1  检测登革病毒及其分型的引物、探针 
名称 序列 SEQ ID No：
DV1-RTP GTGCTGTGCCTCGTTTCG 1
DV2-RTP CTGTGCCTCTTGGTGTTGGT 2
DV3-RTP TTGCTGTGGGTATGTTCTGG 3
DV4-RTP CTCCTGACACCCAATACATC 4
DV1-F GAGGTCAAGCCATCAGG 5
DV1-R TGTTGTCCAAAGGGTGT 6
DV2-F AAAAGACACCCAGGATGTGC 7
DV2-R CCTACTATCTTCAACAGCCTCA 8
DV3-F GAGCGGGATGGAGCCTTAG 9
DV3-R TGGCGTTGGATGCTAATC 10
DV4-F AGTATCAAGAGGGTCCAGTAAG 11
DV4-R TGAGTGTCGCCATGTAATAAG 12
DV1-PF AATAGCCATGACTGACACC 13
DV2-PF GGGGCCATATTCACTGATG 14
DV3-PF GGAAAGCCTACGCCCAA 15
DV4-PF CAGATGGATTGTTGAGAGA 16
实施例2. 四种血清型登革病毒特异性探针微球组的制备
一、探针的合成
按照表1中SEQ ID No：13-16合成各种探针序列，所有探针5’端进行胺基化修饰且连接C12邻接臂序列。
二、探针与微球偶联 
随机选取4中不同的荧光微球，本实施例中所选取荧光微球的编号为18、30、36、42的4种微球，按照如下方法进行探针与微球的偶联：
1.  将储存于2-10℃的编号为18、30、36、42的4种微球悬液及储存于-20℃的2瓶未开封EDC粉末（10mg/瓶）置于室温平衡30-60分钟；
2. 将DV1-PF、DV2-PF、DV3-PF、DV4-PF探针分别以ddH2O溶解，浓度为0.1 nmol/μl；
3.   将微球悬液高速漩涡振荡30秒，再超声振荡30秒；
4.  各取100μl（1.25×106个）微球悬液分别加入至1.5ml Eppendorf管中；
5.    14000g离心4分钟沉淀微球；
6.  小心弃上清液，加入8.5μl 0.1M MES（pH4.5）重悬微球，并振荡混匀；
7.   每种探针各取1μl（0.1 nmol/μl）分别对应加入至上述Eppendorf管中，并振荡混匀；
8.   制备浓度为10mg/ml的EDC溶液，向上述Eppendorf管中每管加入0.5μl EDC溶液，并立即振荡混匀；
9.     避光，室温孵育30分钟；
10.   重复步骤8-9一次； 
11.   每管中加入1ml 0.02% Tween 20，并短暂振荡混匀；
12.   14000g离心4分钟沉淀微球；
13.   弃上清液，加入1ml 0.1% SDS重悬微球，并振荡混匀40秒；
14.   16000g离心4分钟沉淀微球；
15.   弃上清液，加入20μ1 TE（pH8.0）重悬微球，并高速振荡混匀30秒，得4中均匀的探针微球悬液；
16.   探针微球计数：
(1)  将偶联好的探针微球悬液分别振荡混匀40秒；
(2)  用ddH2O将探针微球悬液稀释100倍，充分振荡混匀，得探针微球稀释液；
(3)  取10μl稀释液加入到血球计数板上；
(4)  对四个角上的计数室内的探针微球计数；
(5)  计算探针微球悬液的浓度；
4种探针微球悬液的计数结果都约为：4×104个/μl。
17.  将偶联好的探针微球悬液避光储存于2-10℃备用。 
三、准备探针微球组： 
将偶联好的探针微球悬液等体积进行混合，以1.5×TMAC缓冲液稀释到每种探针微球的终浓度为150个/μl，2-10℃避光储存，即为可用于登革病毒及分型检测的特异性探针微球组。
实施例3：对4个登革病毒临床样本的检测 
一、样本的准备
用常规方法抽提1-4号临床样本的总RNA，测浓度，备用，其中临床样本为血清或蚊虫，本实施例选取人血清作为待测样本。
二、反转录反应 
1、按照表1中SEQ ID No：1-4合成各种反转录引物。
2、准备混合反转录引物工作液： 
1)  合成的每种反转录引物用TE（pH8.0）配制成100μmol/L的储存液；
2)  分别取各反转录引物储存液10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，加入460μl TE（pH8.0）补至总体积为500μl，并振荡混匀，即为混合反转录引物工作液。
3、样本总RNA反转录反应 
反应体系：使用TaKaRa公司反转录反应试剂对样本总RNA进行反转录反应，反转录反应体系为10μl，其中含有5×PrimeScriptTM Buffer 2μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5μl、混合反转录引物工作液0.5μl、总RNA 1μg，补RNase Free dH2O至总体积为10μl。
反应程序：42℃ 15分钟→85℃ 5秒。 
三、多重PCR扩增 
1． 合成PCR扩增引物：按照表1中SEQ ID No：5-12合成各种PCR扩增引物，其中下游引物的5’端均进行生物素标记；
2． PCR扩增反应：
1)   PCR反应体系：体系为20μl，其中包括10×PCR Buffer 2μl、dNTP（2.5mmol/L）2μl、goldTaq酶（5U/μl）0.07μl、DV1-F（5μM）0.3μl、DV2-F（5μM）0.3μl、DV3-F（5μM）0.3μl、DV4-F（5μM）0.3μl、DV1-R（5μM） 1.5μl、DV2-R（5μM） 1.5μl、DV3-R（5μM） 1.5μl、DV4-R（5μM） 1.5μl、样本反转录产物cDNA 1μl，补ddH2O 7.73μl至终体积为20μl；同时设置以阴性对照组，以1μl ddH2O为模板代替基因组DNA；
2)  PCR反应程序：94℃ 5分钟→
Figure 2014101315920100002DEST_PATH_IMAGE005
→72℃ 10分钟→10℃保温。
四、杂交 
取上述待测样本1-4号和阴性对照所对应的PCR扩增产物各5μl分别加入至一个洁净的0.25ml PCR反应管中，各加入15μl TE（pH8.0）缓冲液和30μl探针微球组（含4种探针，每种探针的微球数量约为5000个），振荡混匀后96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。
五、信号标记 
每管杂交产物中分别加入100μl SA-PE（20μg/ml）标记试剂，振荡混匀后50℃孵育20分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。
六、检测 
各取80μl信号标记产物加入96孔板中，使用Bio-PlexTM 200对杂交结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
待测样本1-4号及阴性对照检测结果如下： 
Figure 2014101315920100002DEST_PATH_IMAGE006
本方法判定规则如下：以每种病毒特异性核算探针的阴性对照检测读数作为背景值；针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/背景值≥2，则判定此样本的该种病毒检测结果为阳性；针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/背景值＜2，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。
根据上述判定规则，1-4号临床样本的检测结果如下： 
Figure 880902DEST_PATH_IMAGE001
结果说明如下：1号临床样本为登革病毒I型（DV1)感染；2号临床样本为登革病毒Ⅱ型(DV2)感染；3号临床样本为登革病毒Ⅲ型(DV3)感染；4号临床样本为登革病毒Ⅳ型(DV4)感染。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  检验检疫
 
<120>  检测登革病毒及分型的引物、探针及方法
 
<130>  0
 
<160>  16   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gtgctgtgcc tcgtttcg                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ctgtgcctct tggtgttggt                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
ttgctgtggg tatgttctgg                                                 20
 
 
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<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
ctcctgacac ccaatacatc                                                 20
 
 
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<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gaggtcaagc catcagg                                                    17
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
tgttgtccaa agggtgt                                                    17
 
 
<210>  7
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
aaaagacacc caggatgtgc                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
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cctactatct tcaacagcct ca                                              22
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
gagcgggatg gagccttag                                                  19
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  10
tggcgttgga tgctaatc                                                   18
 
 
<210>  11
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  11
agtatcaaga gggtccagta ag                                              22
 
 
<210>  12
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  12
tgagtgtcgc catgtaataa g                                               21
 
 
<210>  13
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  13
aatagccatg actgacacc                                                  19
 
 
<210>  14
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  14
ggggccatat tcactgatg                                                  19
 
 
<210>  15
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  15
ggaaagccta cgcccaa                                                    17
 
 
<210>  16
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  16
cagatggatt gttgagaga                                                  19
 
 

Claims (10)

1.用于引导登革病毒基因反转录的引物，其特征在于所述引物至少包括如下一条：
用于引导登革I型病毒基因反转录的引物DV1-RTP，其序列为SEQ ID No：1所示；
用于引导登革Ⅱ型病毒基因反转录的引物DV2-RTP，其序列为SEQ ID No：2所示；
用于引导登革Ⅲ型病毒基因反转录的引物DV3-RTP，其序列为SEQ ID No：3所示；
用于引导登革Ⅳ型病毒基因反转录的引物DV4-RTP，其序列为SEQ ID No：4所示。
2.用于扩增登革病毒目的片段的引物，其特征在于所述引物至少包括如下一对：
用于扩增登革 I 型病毒目的片段的引物对DV1-F和 DV1-R，其序列分别为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于扩增登革Ⅱ 型病毒目的片段的引物对DV2-F和 DV2-R，其序列分别为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于扩增登革Ⅲ 型病毒目的片段的引物对DV3-F和 DV3-R，其序列分别为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于扩增登革Ⅳ型病毒目的片段的引物对DV4-F和 DV4-R，其序列分别为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12。
3.用于检测登革病毒分型的探针，其特征在于所述探针包括如下                                                
Figure 2014101315920100001DEST_PATH_IMAGE001
至
Figure 386775DEST_PATH_IMAGE002
 中的至少一种：
Figure 395794DEST_PATH_IMAGE001
 用于检测登革I型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：13 所示；
Figure 2014101315920100001DEST_PATH_IMAGE003
 用于检测登革II型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：14 所示；
Figure 940039DEST_PATH_IMAGE004
 用于检测登革III型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：15 所示；
Figure 995720DEST_PATH_IMAGE002
 用于检测登革IV型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：16 所示。
4.一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
1）合成权利要求2所述引物及权利要求3所述探针，并对探针分别标记；
2）提取待测样品RNA，反转录形成cDNA模板；
3）以步骤1）所述引物对cDNA模板进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
4）将 PCR 扩增产物与步骤1）中合成的探针杂交，得杂交产物；
5）检测杂交信号并分析结果。
5.根据权利要求4所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：
所述步骤1）合成引物后，对每对引物中的下游引物在5’端进行生物素标记；所述对探针的标记为对所有探针在5’端进行胺基化修饰，连接C12邻接臂序列，并与相应荧光编码的微球偶联，然后将偶联有不同探针的微球混合，制成探针微球组；
所述步骤4）PCR 扩增产物与探针杂交后，对杂交产物进行SA-PE标记，得微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；
所述步骤5）对杂交信号的检测采用液相芯片系统。
6.根据权利要求5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤1）探针微球组中偶联不同探针的微球个数相等。
7.根据权利要求5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤5）对杂交信号的检测采用Bio-PlexTM 200检测系统。
8.根据权利要求4或5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：步骤2）反转录形成cDNA时采用权利要求1所述的引物。
9.根据权利要求4或5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤3）PCR扩增采用不对称扩增，PCR体系中下游引物浓度为上游引物浓度的3-6倍。
10.根据权利要求4所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤4）杂交反应的条件为96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450971A (zh) * 2014-12-25 2015-03-25 中国医学科学院医学生物学研究所 Ⅱ型、ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法
CN104480221A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法
CN106701812A (zh) * 2016-12-27 2017-05-24 中国医学科学院医学生物学研究所 一种i‑iv型串联登革病毒edⅲ重组蛋白的构建方法及其应用
CN107190105A (zh) * 2017-07-06 2017-09-22 深圳大学 一种登革病毒的pcr检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN202193789U (zh) * 2011-07-20 2012-04-18 深圳市检验检疫科学研究院 一种用于登革病毒分型的芯片
CN102808041A (zh) * 2012-03-14 2012-12-05 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法
CN102286636B (zh) * 2011-07-20 2013-10-23 深圳市检验检疫科学研究院 检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN202193789U (zh) * 2011-07-20 2012-04-18 深圳市检验检疫科学研究院 一种用于登革病毒分型的芯片
CN102286636B (zh) * 2011-07-20 2013-10-23 深圳市检验检疫科学研究院 检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒
CN102808041A (zh) * 2012-03-14 2012-12-05 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480221A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法
CN104450971A (zh) * 2014-12-25 2015-03-25 中国医学科学院医学生物学研究所 Ⅱ型、ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法
CN106701812A (zh) * 2016-12-27 2017-05-24 中国医学科学院医学生物学研究所 一种i‑iv型串联登革病毒edⅲ重组蛋白的构建方法及其应用
CN107190105A (zh) * 2017-07-06 2017-09-22 深圳大学 一种登革病毒的pcr检测方法

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