CN104480221A - 一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法 - Google Patents

一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法。本发明的检测方法整合了聚合酶链式反应PCR和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上；检测方法包括：标本RNA提取，PCR扩增，杂交，清洗，结果判读。本发明能对登革热病毒(血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)进行快速灵敏的检测和分型，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止登革热疫情的发生。

Description

一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法。
背景技术
登革热病毒(DV)与黄热病病毒(YEV)、日本脑炎病毒(JEV)和丙型肝炎病毒(HCV)同为黄病毒科(Flav iv iridae)的成员,都可引起严重的人类疾病,引发重大的公共卫生问题。登革热病毒感染主要发生在热带、亚热带地区,可引起登革热(DF)、登革出血热/登革热休克综合症(DHF/DSS)等症状,每年大约有5000万到1亿人受到感染,25000人死亡。20世纪80年代以来流行越来越严重，全球有100多个国家出现流行，最严重是在东南亚及西太平洋地区，全球每年有百多万病例，近25亿人口受到登革热的威胁。
随着全球气候变暖引起的地理分布区的改变、旅游、城镇化、交通的加速发展及病毒载体蚊虫的迁移,登革热病毒将会波及到更多地区。
尤其是2014年6月份，广州爆发的感染登革热病例的疫情，随后疫情在各地发展。截至2014年10月21日零时，2014年广东全省共有20个地级市累计报告登革热病例38753例，其中重症病例20例，死亡病例6例。登革热流行不仅造成巨大的经济损失和社会损失，而且引起不必要的恐慌，严重影响外来投资环境。
由于登革热病毒的复制、感染及致病机理尚未阐明,以及针对4种血清型的4价疫苗开发的困境,迄今为止还没有有效的疫苗可用于临床。对确定有DHF/DSS症状的病人,及时有效的医疗护理成为减轻症状,避免死亡的唯一有效措施。因此,临床上快速准确地诊断登革热病毒感染至关重要。
到目前为止，登革热病毒的检测最原始、经典的方法是特异性病毒分离培养，但由于操作繁琐、技术难度大且耗时长、实验条件要求高、存在严重的生物安全问题，在实际工作中难以推广应用。其实是通过核酸检测和抗体阳性检测。核酸检测需要两个小时才出结果，而抗体阳性检测一个小时则可以出结果，但是抗体阳性检测发病后五天内的检出率为50％，可能会漏诊登革热病例，也不利于疫情控制。准确率比较高的检测方法是核酸检测，但是常规的PCR操作复杂，设备庞大，技术难度比较高，不利于口岸现场诊断以及疫区现场检测。因此迫切需要研发一种新型的快速、简单的核酸检测方法。本发明专利通过研究一种基因芯片来检测和分型四种血清型的登革热病毒。
基因芯片技术利用待检测样品的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将该探针(寡核苷酸)点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到标记有荧光染料的待检测靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定登革热病毒。
当前用于登革热病毒检测的基因芯片检测已经有些应用于研究，但是这些基因芯片的探针点样多采用手工模式，操作复杂，并且增加了很多假阳性的机会。
本发明整合了聚合酶链式反应(PCR)和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上。同时本发明把四种常见血清型的登革热病毒的检测在一张芯片上完成，实现了登革热检测的高通量。PCR反应结束后可以直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间。
本发明的检测方法可运用于登革热病毒快速灵敏的检测，作为抗体试验可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法，本发明能对四种血清型的登革热病毒基因进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止疫情的发生和国外登革热病毒的传入，同时可用于医疗机构的登革热检测，极大程度上减少了登革热检测的复杂度。
本发明针对通用基因和四种血清型的登革热特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够互相区别其他登革热及亲缘关系较近的物种的特异性探针，通过探针特异性验证、方法特异性实验等证明该方法可以特异检测四种血清型登革热病毒，与常规PCR方法比较，检测灵敏度明显高于常规方法。不仅可以满足日常疫情安全检测的要求，甚至可以满足临床样品的检测要求。
本发明所提供的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，包括如下步骤：
(1)血液样本RNA液提取；
(2)PCR扩增：
a.RT-PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液(含PCR酶及逆转录酶),待测样本基因特异性正、反向引物，PCR Grade H2O,PCR Control,DNA提取液，特异性正、反引物是根据登革热病毒通用基因和四种血清型特有基因设计的引物；
b.将PCR反应液加入已含有待测基因特异性探针的芯片反应室内内，将芯片放入机器进行扩增反应；特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计，能够区别其他物种；特异性探针点入芯片上。
(3)杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内杂交反应；
(4)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
(5)结果判读。
步骤(1)中所述的RNA提取可使用血液样本基因组RNA提取试剂盒提取RNA，取100uL全血样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
步骤中所述的待测基因为登革热病毒特有基因，分别是通用基因polyprotein gene登革I型polyprotein gene，登革II型polyprotein gene，登革Ⅲ 型envelopeglycoprotein gene,登革Ⅳ型polyprotein gene。
根据登革热病毒通用基因和四种血清型特有基因设计的特异性引物和探针均为两对：登革热通用基因polyprotein gene：
D1-F：AGAGAGCAGATCTCTGATG            (SEQ ID NO 1)
D1-R:GAGAATCTCTTCGCCAA               (SEQ ID NO 2)
Probe:CTTTCAATATGCTGAAACG            (SEQ ID NO 3)
和
D2-F：GCATATTGACGCTGGGAGA            (SEQ ID NO 4)
D2-R:GGCGTTCTGTGCCTGGA               (SEQ ID NO 5)
Probe:AGAGATCCTGCTGTCT               (SEQ ID NO 6)
登革I型polyprotein gene：
DI1-F:CATTAATAGCTGGAGGCATG           (SEQ ID NO 7)
DI1-R:GTGAGGCGCCAGAGTGTT             (SEQ ID NO 8)
Probe:CATATCCGGAAGCTCGGCCG           (SEQ ID NO 9)
和
DI2-F:CACACCACACCCTTTGGAC            (SEQ ID NO 10)
DI2-R:CCTGGCTGTCACCTCCAT             (SEQ ID NO 11)
Probe:GAGGGTGTTTAAAGAGAAAGTTGACACGC  (SEQ ID NO 12)
登革II型polyprotein gene:
DII1-F:GGCCATAGACCTTGGTGAA           (SEQ ID NO 13)
DII1-R:TACCCATGTGGACGTAGAGT          (SEQ ID NO 14)
Probe:CACGTACAAGTGTCCCCTCCTCAGG      (SEQ ID NO 15)
和
DII2-F:CATGGCCCTGGTGGC               (SEQ ID NO 16)
DII2-R:CCCATCTTTTCAGTATCCC           (SEQ ID NO 17)
Probe:TCCTTCGTTTCCTAACAAT            (SEQ ID NO 18)
登革Ⅲ型envelope glycoprotein gene:
DⅢ1-F:GCACGGTGGGTGTGTGAC            (SEQ ID NO 19)
DⅢ1-R:CCTCGGTCTTCTGGAGCTCTAT        (SEQ ID NO 20)
Probe：TGGCTAAGAACAAGCCCACGC         (SEQ ID NO 21)
和
DⅢ2-F:GGAAAACCGTCTATCAA             (SEQ ID NO 22)
DⅢ2-R:GCCATAACCAATTTCATTG           (SEQ ID NO 23)
Probe：CAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAGAG     (SEQ ID NO 24)
登革Ⅳ型polyprotein gene:
DⅣ1-F:CCAGCGAACTGTCTTCTTT           (SEQ ID NO 25)
DⅣ1-R:TCCTACGCATCGCATTC             (SEQ ID NO 26)
Probe:AATGATGCTGGTCGCCCCATC          (SEQ ID NO 27)
和
DⅣ2-F:GAAGAGATTCTCAACCGG            (SEQ ID NO 28)
DⅣ2-R:TCCCTGCTGTTGGTGG              (SEQ ID NO 29)
Probe:ATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTC        (SEQ ID NO 30)
步骤(2)中所述的PCR反应体系为：2X Mater mix 12.5ul,MgSO4 14 mM 2.5ul，PrimerR2.5ul,Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.0μl,Freshly Diluted L RT-PCRControl 2.0μl,Sample 5ul。
步骤(2)所述的PCR扩增的反应条件是：50℃逆转录20min，95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火40s，72℃延伸50s，40个循环，72℃延伸1min。
步骤(3)中所述的杂交反应条件是：注入的杂交液为14.5ul，反应时间为30min。
步骤(2)所述的PCR扩增与步骤(3)所述的杂交在芯片仪上完成。
本发明与现有检测方法相比，将DNA杂交检测的扩增过程和杂交检测过程浓缩到一张芯片上检测，大大缩减了检测的时间和复杂性，检测设备简单易于携带，大大提高了当前的检测能力。而从样品采集到检测总时间完全可以在3小时内完成，有益于快速准确的检测四种血清型的登革热病毒。
附图说明
图1实施例1登革热病毒血清Ⅰ型阳性结果；
图2实施例1登革热病毒血清Ⅱ型阳性结果；
图3实施例1登革热病毒血清Ⅲ型阳性结果；
图4实施例1登革热病毒血清Ⅳ型阳性结果；
图5实施例1登革热病毒四种血清型阳性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1登革热病毒四种血清型的检测特异性与灵敏性
一、实验步骤
1.血液样本的采集
取口岸检测病人的全血样本1.0ml，离心处理得到血清。
2.血液样本的初步鉴定
采用胶体金法初步确定该病人是否感染登革热。
3.基因组RNA的提取
使用血液样本基因组RNA提取试剂盒(离心柱型，Qiagen公司)提取登革热RNA。取100uL血清样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
4.RNA浓度的测定
使用ABI的实时荧光检测仪通过实时定量PCR的方法定量RNA浓度。
5.靶基因的扩增
5.1引物和探针的设计
针对登革热通用基因和四种血清型特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他物种的特异性探针。本实施例均针对通用基因和四种血清型登革热特有基因设计了两对引物和探针，分别是登革热通用基因polyprotein gene的两对正反引物和探针(SEQID NO1-6)，登革I型polyprotein gene的两对正反引物和探针(SEQ ID NO7-12)，登革II型polyprotein gene polyprotein gene的两对正反引物和探针(SEQ ID NO13-18)，登革Ⅲ型envelope glycoprotein gene的两对正反引物和探针(SEQ ID NO19-24),登革Ⅳ型polyprotein gene的两对正反引物和探针(SEQ ID NO25-30)。特异性探针点入芯片上。
5.2反应平台
在芯片仪上进行PCR扩增与杂交反应。为防止引物间的互相作用，分两个反应室进行PCR反应，两个反应室都可以联通到杂交室，PCR后的扩增液可以通过注射压力方式使其流入杂交室进行杂交反应。
PCR反应体系为：2X Mater mix 12.5ul,MgSO4 14mM 2.5ul，PrimerR 2.5ul,Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.0μl,Freshly Diluted L RT-PCR Control2.0μl,Sample 5ul。
反应条件相同：50℃逆转录20min，95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火40s，72℃延伸50s，40个循环，72℃延伸1min。
6.杂交反应
分别注入PCR反应室14.5ul杂交夜，使杂交夜和扩增液都进入到杂交舱内，反应30min。杂交后的芯片用washing buffer 3000rpm 2min冲洗，直接用荧光扫描仪检测。
7.检测体系特异性
将检测到四种血清型的登革热RNA混合，一起加入到芯片上进行检测。
8.现场样品特异性检测
在云南疟疾疫区，取经过PCR确认为登革热I型、II型的样本各10份，登革热阴性样本10份，提取RNA，进行芯片测定。
二、结果
1.芯片的检测能力
用口岸检测到的登革热病毒阳性样品进行了芯片实验，结果见图1-4。
图1-4显示，通过芯片实验，在芯片的相应位置会出现明显的阳性信号。同时，阳性对照位置出现明显的杂交信号，阴性对照处不出现杂交信号。这表明芯片的检测性能良好。
2.样品特异性试验：
对四种血清型混合后的RNA样本检测，可以同时检测到四种血清型的登革热病毒，表明互相之间无交叉影响，结果见图5。
3，现场试验
对云南现场样品芯片检测结果，显示30份样本，10份为登革热I型，10份为登革热II型，10份为阴性，与PCR结果一致。

Claims (9)

1.一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)全血标本进行RNA液提取；
(2)RT-PCR扩增：
a.RT-PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液(含PCR酶及逆转录酶),待测样本基因特异性正、反向引物，PCR Grade H2O,PCR Control,DNA提取液；所述的特异性正、反引物是根据登革热病毒通用基因和四种血清型特有基因设计的引物；
b.将PCR反应液加入已含有待测基因特异性探针的芯片反应室内内，将芯片放入机器进行扩增反应；特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计，能够区别其他物种；特异性探针点入芯片上；
(3)杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内杂交反应；
(4)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
(5)结果判读。
2.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：所述的特有基因分别是登革热通用基因polyprotein gene，登革I型polyprotein gene，登革II型polyprotein gene，登革Ⅲ型envelope glycoprotein gene,登革Ⅳ型polyprotein gene。
3.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：根据登革热病毒通用基因和四种血清型特有基因设计的特异性引物和探针均为两对：
登革热通用基因polyprotein gene：
D1-F：AGAGAGCAGATCTCTGATG   (SEQ ID NO 1) 
D1-R:GAGAATCTCTTCGCCAA      (SEQ ID NO 2) 
Probe:CTTTCAATATGCTGAAACG  (SEQ ID NO 3)
和
D2-F：GCATATTGACGCTGGGAGA   (SEQ ID NO 4) 
D2-R:GGCGTTCTGTGCCTGGA      (SEQ ID NO 5) 
Probe:AGAGATCCTGCTGTCT       (SEQ ID NO 6) 
登革I型polyprotein gene：
DI 1-F:CATTAATAGCTGGAGGCATG  (SEQ ID NO 7)
DI 1-R:GTGAGGCGCCAGAGTGTT    (SEQ ID NO 8) 
Probe:CATATCCGGAAGCTCGGCCG    (SEQ ID NO 9) 
和
DI2-F:CACACCACACCCTTTGGAC  (SEQ ID NO 10) 
DI2-R:CCTGGCTGTCACCTCCAT  (SEQ ID NO 11) 
Probe:GAGGGTGTTTAAAGAGAAAGTTGACACGC  (SEQ ID NO 12) 
登革II型polyprotein gene:
DII 1-F:GGCCATAGACCTTGGTGAA      (SEQ ID NO 13) 
DII 1-R:TACCCATGTGGACGTAGAGT     (SEQ ID NO 14) 
Probe:CACGTACAAGTGTCCCCTCCTCAGG  (SEQ ID NO 15) 
和
DII2-F:CATGGCCCTGGTGGC      (SEQ ID NO 16) 
DII2-R:CCCATCTTTTCAGTATCCC  (SEQ ID NO 17) 
Probe:TCCTTCGTTTCCTAACAAT   (SEQ ID NO 18) 
登革Ⅲ型envelope glycoprotein gene: 
DⅢ1-F:GCACGGTGGGTGTGTGAC       (SEQ ID NO 19) 
DⅢ1-R:CCTCGGTCTTCTGGAGCTCTAT  (SEQ ID NO 20) 
Probe：TGGCTAAGAACAAGCCCACGC    (SEQ ID NO 21) 
和
DⅢ2-F:GGAAAACCGTCTATCAA          (SEQ ID NO 22) 
DⅢ2-R:GCCATAACCAATTTCATTG        (SEQ ID NO 23) 
Probe：CAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAGAG  (SEQ ID NO 24) 
登革Ⅳ型polyprotein gene:
DⅣ1-F:CCAGCGAACTGTCTTCTTT    (SEQ ID NO 25) 
DⅣ1-R:TCCTACGCATCGCATTC      (SEQ ID NO 26) 
Probe:AATGATGCTGGTCGCCCCATC   (SEQ ID NO 27) 
和
DⅣ2-F:GAAGAGATTCTCAACCGG      (SEQ ID NO 28) 
DⅣ2-R:TCCCTGCTGTTGGTGG        (SEQ ID NO 29) 
Probe:ATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTC  (SEQ ID NO 30)。
4.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：步骤(1)中所述的RNA提取可使用血液样本基因组RNA提取试剂盒提取登革热；取100ul全血,按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
5.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR反应体系为：2X Mater mix 12.5ul,MgSO414mM 2.5ul，PrimerR 2.5ul,Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.0μl,Freshly Diluted L RT-PCR Control2.0μl,sample 5ul。
6.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：步骤(2)所述的PCR扩增的反应条件是：50℃逆转录20min，95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火40s，72℃延伸50s，40个循环，72℃延伸1min。
7.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：步骤(3)中所述的杂交反应条件是：注入的杂交液为14.5ul，反应时间为30min。
8.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：步骤(2)所述的PCR扩增与步骤(3)所述的杂交在芯片仪上完成。
9.根据权利要求1所述的快速高通量的登革热病毒检测分型方法，其特征在于：步骤(4)中所述的清洗条件是：3000rpm，2min。
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