CN110714096A - 一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT‑PCR反应液，RT‑PCR酶，阳性质控品，阴性质控品；其中，所述RT‑PCR反应液包含一步反应RT‑qPCR缓冲液及登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针。该试剂盒具有特异性强、检测时间短的优点。

Description

一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒。
背景技术
登革热由受染于四种登革热病毒中任何一种病毒的伊蚊叮咬所传播。该病发生在世界上的热带和亚热带地区。被具传染性的蚊虫叮咬之后3-14天出现症状。症状的范围包括从轻度发热到使人丧失能力的高热，并伴有严重头痛、眼球后疼痛、肌肉和关节痛以及出疹。没有针对登革热的特效抗病毒药物。登革热病毒(Dengue virus)属黄病毒科黄病毒属，为单正链RNA病毒，根据包膜蛋白E抗原性不同分为4个血清型。目前，国内外对登革病毒的诊断方法，主要是血清学试验、病毒培养和PCR，其中，血清学试验、组织培养。具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；常规PCR存在特异性不足的问题。
多重荧光PCR技术采用多色荧光对多条种特异性探针进行标记，配合多重PCR技术和快速热启动Taq酶，可以在同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行快速扩增，大大提高了检测效率；另外各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。
目前，针对登革病毒I型、II型、III型和IV型的体外诊断试剂盒大多采用单重RT-PCR反应，需要进行四次检测才能完成登革病毒的分型；少量采用双重RT-PCR反应，需要进行两次检测才能完成登革病毒的分型。无论登革病毒I型、II型、III型和IV型单重检测试剂，还是双重检测试剂，在面对大规模样本检测时，无疑会耗费大量的人力物力，延长诊断时间，因此，目前需要建立一种能够同时检测登革病毒I型、II型、III型和IV型的四重RT-PCR方法，来提高登革病毒分型检测效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，旨在解决现有技术中对登革病毒分型检测特异性低、时间长的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品；
其中，所述RT-PCR反应液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，以及登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针。
本发明所述试剂盒加入了4种分型的登革热病毒的基因，同时包括了4种分型的登革热病毒的基因的上游、下游特异性引物以及封堵引物和探针。其中，封堵引物是一段人工合成的寡核苷酸链，一方面，特定分型的封堵引物能够与特定分型的Taqman探针互补配对，增强了探针与特定分型的登革热病毒的基因的结合效果，提高PCR反应的特异性；另一方面，封堵引物用于在RT-qPCR扩增过程中生成磷酸盐，生成的磷酸盐能够封闭扩增产物的3’端，使扩增产物在PCR反应中的退火步骤中无法与其他碱基结合进行互补配对，进而无法进行延伸反应，当封堵引物阻断扩增产物的延伸反应时，扩增产物不再进行延伸，缩短反应时间，提高反应效率。该试剂盒是一种能够在同一反应管中分别检测登革病毒I型、II型、III型和IV型的新的四重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，将所述RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品混合进行多重实时荧光PCR技术，同时，应用了封堵引物技术，具有特异性强、灵敏度高的优点。采用本发明提供的试剂盒对4种登革热病毒分型的进行检测，提高了登革病毒分型的快速检测的效率，节约时间、减少取材数量、提高检测鉴别效率。
附图说明
图1是本发明实施例提供的阳性质控品扩增曲线图。
图2是本发明实施例提供的阴性质控品扩增曲线图。
图3是本发明实施例提供的登革病毒I型样本扩增曲线图。
图4是本发明实施例提供的登革病毒II型样本扩增曲线图。
图5是本发明实施例提供的登革病毒III型样本扩增曲线图。
图6是本发明实施例提供的登革病毒IV型样本扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实例提供一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品。
具体的，所述RT-PCR反应液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，以及登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针。
优选的，所述登革病毒病毒I型、II型、III型和IV型为NCBI上已知的最新的登革病毒I型、II型、III型和IV型全基因组序列。优选的，设计的引物包括上游特异性引物、下游特异性引物、封堵引物和TaqMan荧光探针。其中，设计上游引物和下游引物，主要用于在PCR反应第一步时，将DNA双链变性逐步打开，第二步退火时两个引物各自与其互补链的5’端通过碱基互补结合，并在第三步延伸反应时在引物的3’端不断加上新的碱基从而不断向前延长。设计封堵引物，封堵引物是一段人工合成的寡核苷酸链，将以磷酸盐封闭其3’端，使其退火时无法进行延伸反应。设计TaqMan荧光探针，TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，提高了反应效率，节约时间。
优选的，根据登革病毒病毒I型的全基因组序列，各引物序列如下：
所述登革病毒I型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.1，为CGAAAGCCACGGHTTGAGC；所述登革病毒I型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.2，为CCCATGCGTACAGCTTCCAT；所述登革病毒I型封堵引物的序列为Seq.ID No.3，为AGCATGATYCACTGCAGCACGG-P；所述登革病毒I型探针的序列为Seq.ID No.4，为HEX-CCGTGCTGCCTGTRGCTCCATC-BHQ1。其中，所述登革病毒I型上游特异性引物的序列和下游特异性引物的序列包括登革病毒I型基因序列的特异性保守区，具有靶点特异性，能够快速将登革病毒I型基因序列进行扩增反应，提高反应时间，增强反应效率；所述登革病毒I型封堵引物3’端的10-15bp碱基和登革病毒I型探针5’端碱基互补配对，进而增强了登革病毒I型探针与登革病毒I型的基因的结合效果，提高PCR反应的特异性，提高检测鉴别效率。采用封堵引物，另一方面用于在RT-qPCR扩增过程中生成磷酸盐，生成的磷酸盐能够封闭扩增产物的3’端，使扩增产物在PCR反应中的退火步骤中无法与其他碱基结合进行互补配对，进而无法进行延伸反应，当封堵引物阻断扩增产物的延伸反应时，扩增产物不再进行延伸，缩短反应时间，提高反应效率。依据登革热II型基因分析，确定登革病毒I型探针的荧光基团为HEX，当同时检测4种登革热病毒分型时，若结果中出现了HEX的荧光曲线，即可立即分析得出其为登革病毒I型基因，提高了检测分析时间。
优选的，所述登革病毒I型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒I型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒I型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒I型探针的初始浓度为25.00μM。
优选的，所述登革病毒I型上游特异性引物的使用浓度为0.80μM、所述登革病毒I型下游特异性引物的使用浓度为0.80μM、所述登革病毒I型封堵引物的使用浓度为0.70μM、所述登革病毒I型探针的使用浓度为0.70μM。
优选的，所述登革病毒I型上游特异性引物的添加量为0.4μL、所述登革病毒I型下游特异性引物的添加量为0.40μL、所述登革病毒I型封堵引物的添加量为0.70μL、所述登革病毒I型探针的添加量为0.70μL。
优选的，根据登革病毒病毒II型的全基因组序列，各引物序列如下：
所述登革病毒II型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.5，为TGGTGACACAGATGGCWATGA；所述登革病毒II型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.6，为GRGTTCTCGTGTCYACTTTYTC；所述登革病毒II型封堵引物的序列为Seq.ID No.7，为TAYCACCACTTCCCGTGRGTCGTGTCT-P；所述登革病毒II型探针的序列为Seq.ID No.8，为FAM-AGACACGACYCCATTTGGACAACARCG-BHQ1。其中，所述登革病毒II型上游特异性引物的序列和下游特异性引物的序列包括登革病毒II型基因序列的特异性保守区，具有靶点特异性，能够快速将登革病毒II型基因序列进行扩增反应，提高反应时间，增强反应效率；所述登革病毒II型封堵引物3’端的10-15bp碱基和登革病毒II型探针5’端碱基互补配对，进而增强了登革病毒II型探针与登革病毒II型的基因的结合效果，提高PCR反应的特异性，提高检测鉴别效率。采用封堵引物，另一方面用于在RT-qPCR扩增过程中生成磷酸盐，生成的磷酸盐能够封闭扩增产物的3’端，使扩增产物在PCR反应中的退火步骤中无法与其他碱基结合进行互补配对，进而无法进行延伸反应，当封堵引物阻断扩增产物的延伸反应时，扩增产物不再进行延伸，缩短反应时间，提高反应效率。依据登革热II型基因分析，确定登革病毒II型探针的荧光基团为FAM，当同时检测4种登革热病毒分型时，若结果中出现了FAM的荧光曲线，即可立即分析得出其为登革病毒II型基因，提高了检测分析时间。
优选的，所述登革病毒II型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒II型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒II型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒II型探针的初始浓度为25.00μM。
优选的，所述登革病毒II型上游特异性引物的使用浓度为0.40μM、所述登革病毒II型下游特异性引物的使用浓度为0.50μM、所述登革病毒II型封堵引物的使用浓度为0.35μM、所述登革病毒II型探针的使用浓度为0.35μM。
优选的，所述登革病毒II型上游特异性引物的添加量为0.20μL、所述登革病毒II型下游特异性引物的添加量为0.25μL、所述登革病毒II型封堵引物的添加量为0.35μL、所述登革病毒II型探针的添加量为0.35μL。
优选的，根据登革病毒病毒III型的全基因组序列，各引物序列如下：
所述登革病毒III型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.9，为CMAAAGCCACGGTTTGAGC；所述登革病毒III型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.10，为CGTGCGTACAGCTTCCACR；所述登革病毒III型封堵引物的序列为Seq.ID No.11，为YTCATTCTAGCACGGCAGCACGG-P；所述登革病毒III型探针的序列为Seq.ID No.12，为ROX-CCGTGCTGCCTGTAGCTCCGTCR-BHQ2。其中，所述登革病毒III型上游特异性引物的序列和下游特异性引物的序列包括登革病毒III型基因序列的特异性保守区，具有靶点特异性，能够快速将登革病毒III型基因序列进行扩增反应，提高反应时间，增强反应效率；所述登革病毒III型封堵引物3’端的10-15bp碱基和登革病毒III型探针5’端碱基互补配对，进而增强了登革病毒III型探针与登革病毒III型的基因的结合效果，提高PCR反应的特异性，提高检测鉴别效率。采用封堵引物，另一方面用于在RT-qPCR扩增过程中生成磷酸盐，生成的磷酸盐能够封闭扩增产物的3’端，使扩增产物在PCR反应中的退火步骤中无法与其他碱基结合进行互补配对，进而无法进行延伸反应，当封堵引物阻断扩增产物的延伸反应时，扩增产物不再进行延伸，缩短反应时间，提高反应效率。依据登革热III型基因分析，确定登革病毒III型探针的荧光基团为ROX，当同时检测4种登革热病毒分型时，若结果中出现了ROX的荧光曲线，即可立即分析得出其为登革病毒III型基因，提高了检测分析时间。
优选的，所述登革病毒III型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒III型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒III型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒III型探针的初始浓度为25.00μM。
优选的，所述登革病毒III型上游特异性引物的使用浓度为0.30μM、所述登革病毒III型下游特异性引物的使用浓度为0.30μM、所述登革病毒III型封堵引物的使用浓度为0.20μM、所述登革病毒III型探针的使用浓度为0.20μM。
优选的，所述登革病毒III型上游特异性引物的添加量为0.15μL、所述登革病毒III型下游特异性引物的添加量为0.15μL、所述登革病毒III型封堵引物的添加量为0.20μL、所述登革病毒III型探针的添加量为0.20μL。
优选的，根据登革病毒病毒IV型的全基因组序列，各引物序列如下：
所述登革病毒IV型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.13，为ACTTGTGCCACGGYTTGAGC；所述登革病毒IV型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.14，为AACCGCTAGTCCAATATGCCAC；所述登革病毒IV型封堵引物的序列为Seq.ID No.15，为TTATTCTAGCCACTGCAGCACGG-P；所述登革病毒IV型探针的序列为Seq.ID No.16，为CY5-CCGTGCTGCCTGTAGCTCCGCC-BHQ2。其中，所述登革病毒IV型上游特异性引物的序列和下游特异性引物的序列包括登革病毒IV型基因序列的特异性保守区，具有靶点特异性，能够快速将登革病毒IV型基因序列进行扩增反应，提高反应时间，增强反应效率；所述登革病毒IV型封堵引物3’端的10-15bp碱基和登革病毒IV型探针5’端碱基互补配对，进而增强了登革病毒IV型探针与登革病毒IV型的基因的结合效果，提高PCR反应的特异性，提高检测鉴别效率。采用封堵引物，另一方面用于在RT-qPCR扩增过程中生成磷酸盐，生成的磷酸盐能够封闭扩增产物的3’端，使扩增产物在PCR反应中的退火步骤中无法与其他碱基结合进行互补配对，进而无法进行延伸反应，当封堵引物阻断扩增产物的延伸反应时，扩增产物不再进行延伸，缩短反应时间，提高反应效率。依据登革热IV型基因分析，确定登革病毒IV型探针的荧光基团为CY5，当同时检测4种登革热病毒分型时，若结果中出现了CY5的荧光曲线，即可立即分析得出其为登革病毒IV型基因，提高了检测分析时间。
优选的，所述登革病毒IV型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒IV型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒IV型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒IV型探针的初始浓度为25.00μM。
优选的，所述登革病毒IV型上游特异性引物的使用浓度为0.50μM、所述登革病毒IV型下游特异性引物的使用浓度为0.50μM、所述登革病毒IV型封堵引物的使用浓度为0.40μM、所述登革病毒IV型探针的使用浓度为0.40μM。
所述登革病毒IV型上游特异性引物的添加量为0.25μL、所述登革病毒IV型下游特异性引物的使用浓度为0.25μL、所述登革病毒IV型封堵引物的添加量为0.40μL、所述登革病毒IV型探针的添加量为0.40μL。
优选的，所述RT-PCR反应液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，在本发明中，所述一步反应RT-qPCR缓冲液在使用过程中的使用浓度为较低浓度的缓冲液，优选的，所述一步反应RT-qPCR缓冲液的使用浓度为1倍浓度，即采用单倍浓度进行反应。在本发明中，所述一步反应RT-qPCR缓冲液的初始浓度为较高浓度的缓冲液，高浓度的缓冲液为配置在试剂盒中的未进行使用的，所述一步反应RT-qPCR缓冲液的初始浓度为所述一步反应RT-qPCR缓冲液的使用浓度的2倍。优选的，所述一步反应RT-qPCR缓冲液的初始浓度为2倍浓度。优选的，所述所述一步反应RT-qPCR缓冲液的添加量为12.5μL。
优选的，所述RT-PCR酶包括RNA酶抑制剂、热启动Taq DNA聚合酶和逆转录酶。在本发明中，所述RT-PCR酶在使用过程中的使用浓度为较低浓度的酶，优选的，所述RT-PCR酶的使用浓度为1倍浓度，即采用单倍浓度进行反应。在本发明中，所述RT-PCR酶的初始浓度为较高浓度的酶，高浓度的酶为配置在试剂盒中的未进行使用的，所述RT-PCR酶的初始浓度为所述RT-PCR酶的使用浓度的25倍。优选的，所述RT-PCR酶的初始浓度为25倍浓度。优选的，所述RT-PCR酶的添加量为1μL。
优选的，所述阳性质控品为含有登革病毒I型、II型、III型和IV型目的基因片段的合成质粒混合物。进一步优选的，所述阳性质控品的添加量为5μL。
优选的，所述阴性质控品为DEPC水。进一步优选的，所述阴性质控品的添加量为1.15μL。
本发明实施例提供的所述试剂盒加入了4种分型的登革热病毒的基因，同时包括了4种分型的登革热病毒的基因的上游、下游特异性引物以及封堵引物和探针。其中，封堵引物是一段人工合成的寡核苷酸链，一方面，特定分型的封堵引物能够与特定分型的Taqman探针互补配对，增强了探针与特定分型的登革热病毒的基因的结合效果，提高PCR反应的特异性；另一方面，封堵引物用于在RT-qPCR扩增过程中生成磷酸盐，生成的磷酸盐能够封闭扩增产物的3’端，使扩增产物在PCR反应中的退火步骤中无法与其他碱基结合进行互补配对，进而无法进行延伸反应，当封堵引物阻断扩增产物的延伸反应时，扩增产物不再进行延伸，缩短反应时间，提高反应效率。该试剂盒是一种能够在同一反应管中分别检测登革病毒I型、II型、III型和IV型的新的四重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，将所述RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品混合进行多重实时荧光PCR技术，同时，应用了封堵引物技术，具有特异性强、灵敏度高的优点。采用本发明提供的试剂盒对4种登革热病毒分型的进行检测，提高了登革病毒分型的快速检测的效率，节约时间、减少取材数量、提高检测鉴别效率。
相应的，本发明实施例还提供了一种利用上述用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒进行检测的方法，该方法包括如下步骤：
S01.选取16株病毒株样本，提取所述病毒株样本的病毒RNA；
S02.依据已知的的登革病毒I型、II型、III型和IV型全基因组序列，分别设计并合成登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针；
S03.依据上述用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒提供的RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品，配制25μL反应体系；
S04.设置反应程序，其中，荧光信号设置为：荧光报告基团为：FAM、VIC、ROX、CY5通道，Passive Reference：NONE；荧光PCR扩增，设置反应总体积为25μL，荧光PCR扩增程序的设置如下表1，
表1
Figure BDA0002237531980000111
S05.PCR扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染相应病毒。仅当阳性质控品在四个荧光通道中信号均成阳性，阴性质控品在四个荧光通道中均成阴性时，待检标本的检测结果才有效。
当检测结果中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(Ct)≤38，且有明显指数增长期，检测结果为阳性样本；
当检测结果中，Ct的取值为38＜Ct＜40，且有明显指数增长期，检测结果为可疑样本；对于检测结果为可疑的样本，建议复核一次，如果复核结果Ct<40且有指数扩增，则判定检测结果为阳性样本，否则判定检测结果为阴性样本；
当检测结果中，Ct的取值为Ct＝40或无Ct值，且无指数扩增期，检测结果为阴性样本。
具体的，在上述步骤S01中，优选的，所述病毒株样本选自黄热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、裂谷热病毒、西尼罗病毒、登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒，上述各病毒样本选用各2株。
优选的，所述提取所述病毒株样本的病毒RNA的步骤中，采用病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit，德国Qiagen公司产品。按照试剂说明书进行样本核酸提取即可。
在上述步骤S02中，所述登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针的具体碱基序列如上文所述，为了节约篇幅，此处不再赘述。
在上述步骤S03中，依据上述用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒提供的RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品，配制25μL反应体系；其中，各组分的添加量如下：所述RT-PCR酶的添加量为1μL；所述阳性质控品的添加量为5μL；所述阴性质控品的添加量为1.15μL；所述一步反应RT-qPCR缓冲液的添加量为12.5μL；所述登革病毒I型上游特异性引物的添加量为0.4μL、所述登革病毒I型下游特异性引物的添加量为0.40μL、所述登革病毒I型封堵引物的添加量为0.70μL、所述登革病毒I型探针的添加量为0.70μL；所述登革病毒II型上游特异性引物的添加量为0.20μL、所述登革病毒II型下游特异性引物的添加量为0.25μL、所述登革病毒II型封堵引物的添加量为0.35μL、所述登革病毒II型探针的添加量为0.35μL；所述登革病毒III型上游特异性引物的添加量为0.15μL、所述登革病毒III型下游特异性引物的添加量为0.15μL、所述登革病毒III型封堵引物的添加量为0.20μL、所述登革病毒III型探针的添加量为0.20μL；所述登革病毒IV型上游特异性引物的添加量为0.25μL、所述登革病毒IV型下游特异性引物的使用浓度为0.25μL、所述登革病毒IV型封堵引物的添加量为0.40μL、所述登革病毒IV型探针的添加量为0.40μL。
在上述步骤S05中，当检测结果中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(Ct)≤38，且有明显指数增长期，检测结果为阳性样本，确定检测结构为阳性样本之后，对各荧光基团进一步进行分析，确定所感染的登革热病毒的分型。具体分析如下表2，当荧光集团为FAM时，则检出的病毒分型为登革病毒II型；当荧光集团为VIC时，则检出的病毒分型为登革病毒I型；当荧光集团为ROX时，则检出的病毒分型为登革病毒III型；当荧光集团为CY5时，则检出的病毒分型为登革病毒IV型。
表2
Figure BDA0002237531980000131
上述方法是利用用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒进行检测的方法，基于四重荧光PCR技术，对样本进行登革病毒I型、II型、III型和IV型检测，检测时间1.5小时，检测结果可用于登革病毒分型、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。本发明与现有技术相比优点为：(1)一份样本一次检测即可鉴别四种血清型的感染情况，检测时间1.5小时，相比于一个样本进行4次检测，提高了检测效率；(2)分别针对四种血清型核酸基因序列设计特异性扩增引物、封堵引物和Taqman探针，保证检测的特异性和准确性。
进一步地，以具体实施例的内容进一步进行说明。
实施例1
S01.选取收集黄热病毒、裂谷热病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒各1株，登革病毒I型样本12株、登革病毒II型3株、登革病毒III型3株、登革病毒IV型样本3株；按照病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit方法对样本进行核酸提取备用；分别取登革病毒I型、II型、III型和IV型样本核酸进行阳性样本验证；分别取黄热病毒样本核酸、裂谷热病毒样本核酸、西尼罗病毒样本核酸、寨卡病毒样本核酸、基孔肯雅病毒样本核酸进行特异性检测；
S02.依据已知的的登革病毒I型、II型、III型和IV型全基因组序列，分别设计并合成登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针；上述各引物的碱基序列如下表3：
表3
Figure BDA0002237531980000141
S03.依据上述用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒提供的RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品，配制25μL反应体系；各反应物的添加量如下表4：
表4
S04.设置反应程序，其中，荧光信号设置为：荧光报告基团为：FAM、VIC、ROX、CY5通道，Passive Reference：NONE；荧光PCR扩增，设置反应总体积为25μL，荧光PCR扩增程序的设置如下表1，
表1
S05.PCR扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染相应病毒。仅当阳性质控品在四个荧光通道中信号均成阳性，阴性质控品在四个荧光通道中均成阴性时，待检标本的检测结果才有效。
当检测结果中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(Ct)≤38，且有明显指数增长期，检测结果为阳性样本；
当检测结果中，38＜Ct<40，且有明显指数增长期，检测结果为可疑样本；对于检测结果为可疑的样本，建议复核一次，如果复核结果Ct<40且有指数扩增，则判定检测结果为阳性样本，否则判定检测结果为阴性样本；
当检测结果中，Ct＝40或无Ct值，且无指数扩增期，检测结果为阴性样本。
对上述样本检测结果进行分析，通过对登革病毒I型、II型、III型和IV型样本核酸进行检测，结果目标病原体检测均为阳性，阳性样本检出率100％。样本验证如附图1～附图6，其中，附图1为阳性质控品的扩增曲线，图2为阴性质控品的扩增曲线，图3为登革病毒I型样本扩增曲线，图4为登革病毒II型样本扩增曲线，图5为登革病毒III型样本扩增曲线，图6为登革病毒IV型阳性样本扩增曲线。可以看出，阳性质控品的扩增曲线均为正值，阴性质控品的扩增曲线均为负值；而不同分型的登革热病毒，由于其所带的荧光基团不同，不同的荧光基团代表检测得到的不同分型的登革热病毒。其中，登革病毒I型的荧光基团为VIC，登革病毒II型的荧光基团为FAM，登革病毒III型的荧光基团为ROX，登革病毒IV型的荧光基团为CY5。
通过对黄热病毒样本核酸、裂谷热病毒样本核酸、西尼罗病毒样本核酸、寨卡病毒样本核酸、基孔肯雅病毒样本核酸进行特异性检测，目标病原体检测均为阳性，其余5种非目标病原体检测均为阴性，结果表明该方法具有良好的特异性，特异性为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市疾病预防控制中心
<120> 一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒
<130> 2019.10.17
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgaaagccac gghttgagc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cccatgcgta cagcttccat 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agcatgatyc actgcagcac gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccgtgctgcc tgtrgctcca tc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tggtgacaca gatggcwatg a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
grgttctcgt gtcyacttty tc 22
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
taycaccact tcccgtgrgt cgtgtct 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
agacacgacy ccatttggac aacarcg 27
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
cmaaagccac ggtttgagc 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cgtgcgtaca gcttccacr 19
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ytcattctag cacggcagca cgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ccgtgctgcc tgtagctccg tcr 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
acttgtgcca cggyttgagc 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
aaccgctagt ccaatatgcc ac 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ttattctagc cactgcagca cgg 23
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
ccgtgctgcc tgtagctccg cc 22

Claims (10)

1.一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：RT-PCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品；
其中，所述RT-PCR反应液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，以及登革病毒I型上游特异性引物、登革病毒I型下游特异性引物、登革病毒I型封堵引物、登革病毒I型探针；登革病毒II型上游特异性引物、登革病毒II型下游特异性引物、登革病毒II型封堵引物、登革病毒II型探针；登革病毒III型上游特异性引物、登革病毒III型下游特异性引物、登革病毒III型封堵引物和登革病毒III型探针；登革病毒IV型上游特异性引物、登革病毒IV型下游特异性引物、登革病毒IV型封堵引物和登革病毒IV型探针。
2.根据权利要求1所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述登革病毒I型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.1，为CGAAAGCCACGGHTTGAGC；
所述登革病毒I型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.2，为CCCATGCGTACAGCTTCCAT；
所述登革病毒I型封堵引物的序列为Seq.ID No.3，为AGCATGATYCACTGCAGCACGG-P；
所述登革病毒I型探针的序列为Seq.ID No.4，为HEX-CCGTGCTGCCTGTRGCTCCATC-BHQ1。
3.根据权利要求1所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述登革病毒II型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.5，为TGGTGACACAGATGGCWATGA；
所述登革病毒II型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.6，为GRGTTCTCGTGTCYACTTTYTC；
所述登革病毒II型封堵引物的序列为Seq.ID No.7，为TAYCACCACTTCCCGTGRGTCGTGTCT-P；
所述登革病毒II型探针的序列为Seq.ID No.8，为FAM-AGACACGACYCCATTTGGACAACARCG-BHQ1。
4.根据权利要求1所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述登革病毒III型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.9，为CMAAAGCCACGGTTTGAGC；
所述登革病毒III型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.10，为CGTGCGTACAGCTTCCACR；
所述登革病毒III型封堵引物的序列为Seq.ID No.11，为YTCATTCTAGCACGGCAGCACGG-P；
所述登革病毒III型探针的序列为Seq.ID No.12，为ROX-CCGTGCTGCCTGTAGCTCCGTCR-BHQ2。
5.根据权利要求1所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述登革病毒IV型上游特异性引物的序列为Seq.ID No.13，为ACTTGTGCCACGGYTTGAGC；
所述登革病毒IV型下游特异性引物的序列为Seq.ID No.14，为AACCGCTAGTCCAATATGCCAC；
所述登革病毒IV型封堵引物的序列为Seq.ID No.15，为TTATTCTAGCCACTGCAGCACGG-P；
所述登革病毒IV型探针的序列为Seq.ID No.16，为CY5-CCGTGCTGCCTGTAGCTCCGCC-BHQ2。
6.根据权利要求1所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR酶包括RNA酶抑制剂、热启动Taq DNA聚合酶和逆转录酶。
7.根据权利要求1所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有登革病毒I型、II型、III型和IV型目的基因片段的合成质粒混合物；和/或，
所述阴性质控品为DEPC水。
8.根据权利要求1～7任一所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述一步反应RT-qPCR缓冲液的初始浓度为2倍浓度；和/或，
所述RT-PCR酶的初始浓度为25倍浓度；和/或，
所述登革病毒I型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒I型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒I型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒I型探针的初始浓度为25.00μM；和/或，
所述登革病毒II型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒II型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒II型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒II型探针的初始浓度为25.00μM；和/或，
所述登革病毒III型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒III型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒III型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒III型探针的初始浓度为25.00μM；和/或，
所述登革病毒IV型上游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒IV型下游特异性引物的初始浓度为50.00μM、所述登革病毒IV型封堵引物的初始浓度为25.00μM、所述登革病毒IV型探针的初始浓度为25.00μM。
9.根据权利要求1～7任一所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述一步反应RT-qPCR缓冲液的使用浓度为1倍浓度；和/或，
所述RT-PCR酶的使用浓度为1倍浓度；和/或，
所述登革病毒I型上游特异性引物的使用浓度为0.80μM、所述登革病毒I型下游特异性引物的使用浓度为0.80μM、所述登革病毒I型封堵引物的使用浓度为0.70μM、所述登革病毒I型探针的使用浓度为0.70μM；和/或，
所述登革病毒II型上游特异性引物的使用浓度为0.40μM、所述登革病毒II型下游特异性引物的使用浓度为0.50μM、所述登革病毒II型封堵引物的使用浓度为0.35μM、所述登革病毒II型探针的使用浓度为0.35μM；和/或，
所述登革病毒III型上游特异性引物的使用浓度为0.30μM、所述登革病毒III型下游特异性引物的使用浓度为0.30μM、所述登革病毒III型封堵引物的使用浓度为0.20μM、所述登革病毒III型探针的使用浓度为0.20μM；和/或，
所述登革病毒IV型上游特异性引物的使用浓度为0.50μM、所述登革病毒IV型下游特异性引物的使用浓度为0.50μM、所述登革病毒IV型封堵引物的使用浓度为0.40μM、所述登革病毒IV型探针的使用浓度为0.40μM。
10.根据权利要求8所述的用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒，其特征在于，
所述RT-PCR酶的添加量为1μL；和/或，
所述阳性质控品的添加量为5μL；和/或，
所述阴性质控品的添加量为1.15μL；和/或，
所述一步反应RT-qPCR缓冲液的添加量为12.5μL；和/或，
所述登革病毒I型上游特异性引物的添加量为0.4μL、所述登革病毒I型下游特异性引物的添加量为0.40μL、所述登革病毒I型封堵引物的添加量为0.70μL、所述登革病毒I型探针的添加量为0.70μL；和/或，
所述登革病毒II型上游特异性引物的添加量为0.20μL、所述登革病毒II型下游特异性引物的添加量为0.25μL、所述登革病毒II型封堵引物的添加量为0.35μL、所述登革病毒II型探针的添加量为0.35μL；和/或，
所述登革病毒III型上游特异性引物的添加量为0.15μL、所述登革病毒III型下游特异性引物的添加量为0.15μL、所述登革病毒III型封堵引物的添加量为0.20μL、所述登革病毒III型探针的添加量为0.20μL；和/或，
所述登革病毒IV型上游特异性引物的添加量为0.25μL、所述登革病毒IV型下游特异性引物的使用浓度为0.25μL、所述登革病毒IV型封堵引物的添加量为0.40μL、所述登革病毒IV型探针的添加量为0.40μL。
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