CN101724714B

CN101724714B - 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒

Info

Publication number: CN101724714B
Application number: CN 200910254350
Authority: CN
Inventors: 华荣虹; 步志高; 宋永�; 杜鹃
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS; Heilongjiang University
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS; Heilongjiang University
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2029-12-30
Also published as: CN101724714A

Abstract

本发明公开了一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒。本发明试剂盒含有RNA提取试剂，等温扩增反应管，1000倍荧光染料。每支等温扩增反应管中包含以下组分：KCl、Tris-Cl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄、Triton X-100、引物F3与B3各20pmol、引物FIP与BIP各50pmol、引物FLP与BLP各40pmol、Betaine 1.1mM、AMV反转录酶5U、Bst DNA聚合酶8U、dNTP 0.8mM、RNA酶抑制剂40U。本发明检测乙型脑炎病毒的试剂盒特异性强，灵敏度高，操作简便，检测时间短，结果易于判断，不需PCR仪等贵重仪器，适合于实验室以及基层单位应用。

Description

一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测乙型脑炎病毒的试剂盒，尤其涉及检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增的专用引物以及含有该引物的环介导等温扩增试剂盒，本发明还涉及该试剂盒在快速检测乙型脑炎病毒中的应用，属于乙型脑炎病毒的检测或诊断领域，

背景技术

流行性乙型脑炎乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JapaneseEncephalitis virus，JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。该病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒，所致疾病在日本称日本乙型脑炎。在我国最早于1940年分离此病毒，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑。在世界范围内每年有30,000-50,000例乙脑病例，约25％-30％死亡，50％导致永久性中枢神经系统后遗症。我国近年每年的乙脑病例大于5000例，死亡200例以上。对于流行性乙型脑炎病毒多种动物易感，但除人、马和猪外通常不呈现临床症状。对人主要引起中枢神经系统的急性感染，人感染临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。母猪感染可引起流产、产死胎或木乃伊胎，公猪感染导致睾丸肿大影响繁殖性能为特征，少数猪只感染可能呈现发热和神经症状，而其他猪则大多数不呈显症状。给养猪业造成巨大的经济损失。马属动物易感染，少数引起脑炎与神经症状，马是终末宿主。蚊是JEV的主要传播媒介，猪是该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主。乙型脑炎病毒主要在亚洲流行，而最近发现在南半球也有报道，这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康。

乙型脑炎病毒属黄病毒科，黄病毒属，为单链正链RNA病毒。基因组约11kb。病毒粒子呈球形，直径约30nm，有囊膜。JEV只有一个血清型，但不同地区及不同时期分离的毒株按基因序列比较分析可以分为4个基因型。乙型脑炎病毒的各个毒株虽然常在毒力和血凝特性等方面有比较明显的差异，但抗原性差异不大，没有不同的血清型。乙型脑炎病毒在抗原上与墨罗山谷脑炎病毒(Murray Vally Encephalitis Virus，MVEV)，西尼罗病毒(WestNile Virus，WNV)，圣路易脑炎病毒(S t.Louis EncephalitisVirus)有血清学交叉反应，在黄病毒科中属同一血清群。此外，JEV还与登革病毒(Dengue Virus，DV)存在血清交叉反应。这些病毒都是蚊媒性人兽共患传染病，各种病毒也慢慢突破了早期的流行地域范围，不断在世界范围内扩散对人类健康及公共卫生造成威胁。及时准确地检测与诊断对预防控制该类病毒病意义重大。

灵敏、快速、特异的病原检测方法对乙型脑炎的预防控制有重要意义。目前对乙型脑炎的实验室诊断包括病毒分离和抗体检测以及用分子生物学方法检测病毒基因核酸。动物拌种或培养细胞接种分离病原方法复杂且耗时长，同时常因样品中病原含量低而分离失败而造成假阴性结果。IgM检测也能作出JEV感染的诊断，该方法需配合病毒中和实验进行确证，因为乙型脑炎病毒与其它黄病毒存在血清学交叉反应也影响抗体检测方法的特异性。RT-PCR和Real-time RT-PCR扩增乙型脑炎病毒基因组核酸是快速检测乙型脑炎病毒的分子技术。这两种方法要求实验室有PCR仪或Real-time PCR仪，对操作人员素质要求高。且PCR扩增后需通过电泳步骤获得结果也是一个烦杂的问题。

环介导等温基因扩增技术(loop mediated isothermalamplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。扩增反应在恒温条件下进行，是一种特异、高效、快速的扩增DNA的技术。由于LAMP的扩增效率非常高，扩增反应结果可以通过荧光染料染色在紫外灯下肉眼观察；扩增反应可产生大量的焦磷酸镁而使反应液呈现混浊，在LAMP扩增结束后无须电泳就可直接肉眼观察反应是否有混浊现象来判断是否有扩增，且不需要昂贵的PCR仪，可广泛应用于病毒的临床和基层检测。

采用环介导等温基因扩增技术检测乙型脑炎病毒的前提是需要获得或设计乙型脑炎病毒特异性引物组，该引物组应具有良好的特异性和灵敏度。

发明内容

本发明首先根据乙型脑炎病毒不同基因型基因组序列对比结果，设计选择了保守性高的引物组，再根据乙型脑炎病毒与同一血清群其它黄病毒基因序列进行比较，选择乙型脑炎病毒特异性引物组。同时对引物进行Blast比较分析，所优化的引物具有很好的特异性，对猪乙型脑炎病毒感染症状相似的猪细小病毒，猪圆环病毒，猪伪狂犬病毒，猪温病毒等不能扩增(图1)。

具体的，本发明所述的乙型脑炎病毒特异性引物组包括以下引物序列：由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组成的引物对1；由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6组成的引物对2；由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所组成的引物对3；

本发明的乙型脑炎病毒特异性引物组由以上3对引物序列(引物对1、引物对2和引物对3)所组成；其中引物FI P(SEQ IDNO：3)是由F1c(SEQ ID NO：1)与F2(SEQ ID NO：2)按以下方式组成：FIP＝F1c+TTTT+F2。引物BIP(SEQ ID NO：6)是由引物B1c(SEQ ID NO：4)与引物B2(SEQ ID NO：5)按以下方式组成：BIP＝B1C+TTTT+B2。

编号	名称	来源	序列
				SEQ ID NO：1	F1c	JEV	CCACCGTCGAGATGTCAGTGAC
SEQ ID NO：2	F2	JEV	CGAAGCTAGCCAACTTGCT
				SEQ ID	FIP	人	CCACCGTCGAGATGTCAGTGACTTTTCGAAGCTAGCCAACTTGCT

[0011]

NO：3		工
				SEQ ID NO：4	B1c	JEV	CACGACTGGAGAAGCCCACAA
SEQ ID NO：5	B2	JEV	CCCACGGTCAGTGAAGCCTT
				SEQ ID NO：6	BIP	人工	CACGACTGGAGAAGCCCACAATTTTCCCACGGTCAGTGAAGCCTT
SEQ ID NO：7	F3	JEV	TCATGGCAAACGACAAACC
				SEQ ID NO：8	B3	JEV	TTCCCGAAAAGTCCACATC
SEQ ID NO：9	FLP	JEV	TGAAGCATGATAGCA
				SEQ ID NO：10	BLP	JEV	AGTAGCTATGTGTGCAA

本发明在设计筛选扩增引物时，分析比较了JEV不同基因型毒株的基因序列，所设计筛选的引物对JEV基因I、I I、I I I型JEV基因都具有较好的同源性，可对不同基因型JEV进行检测。

在获得了乙型脑炎病毒特异性引物组的基础上，本发明按照优选的引物组，优化组合等温扩增反应液，通过对引物组合以及引物浓度优化，酶浓度优化，镁离子浓度优化，dNTP浓度优化等反应成分的配比优化，进一步得到了一种乙型脑炎病毒环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒，包括以下成分：

(1)RNA提取试剂；

(2)等温扩增反应管；每支等温扩增反应管包含以下成分：10mM KCl、20mM Tris-Cl、10mM(NH4)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％TritonX-100、引物SEQ ID NO：7(F 3)与SEQID NO：8(B3)各20pmol、引物SEQ ID NO：3(FIP)与SEQ ID NO：6(BIP)各50pmol、引物SEQ ID NO：9(FLP)与SEQ ID NO：10(BLP)各40pmol、Betaine 1.1mM、AMV反转录酶5U、Bs t DNA聚合酶8U、dNTP 0.8mM、RNA酶抑制剂40U；

(3)1000倍荧光染料SYBR Green I。

其中，所述的RNA提取试剂可以是各种提取RNA的常用试剂，例如。可以是Trizol试剂、CTAB法提取RNA的试剂；

所述的荧光染料可以是SYBR Green I等荧光染料；

本发明的试剂盒中各组成成分都进行了配比优化。可以用于组织样品，血液样品以及细胞培养样品进行快速检测。

本发明试剂盒的等温扩增反应体系为25μl，反应条件为65℃，1小时。结果判定方法为：等温扩增反应结束后向每支等温扩增反应管中加入荧光染料SYBR Green I1μl，直接肉眼观察颜色变化，变为黄绿色或绿色为阳性结果，变为橙黄色或黄色为阴性结果(图3)。与常规RT-PCR扩增方法比较，采用本发明等温扩增试剂盒检测的灵敏度更高(图2)。

本发明建立了乙型脑炎病毒环介导等温扩增(LAMP)方法，引物序列经过优化筛选。与常RT-PCR相比较，具有特异性强，灵敏度高等优点。该方法在提取了样品RNA后一步法等温扩增，不需要PCR仪等贵重设备，只需普通水浴或金属浴即可。判断结果不需要凝胶电泳，加入荧光染料后直接肉眼观察即可判定。该发明试剂盒检测时间短，特异性强，灵敏度高，操作方法简单，适用于实验室或现场快速检测。

附图说明

图1本发明等温扩增试剂盒特异性检测结果。M、DL2000分子量标准；1、乙型脑炎病毒；2、猪细小病毒；3、猪伪狂犬病毒；4、猪瘟病毒；5、猪圆环病毒；6、阴性对照。

图2本发明等温扩增试剂盒与常规RT-PCR方法灵敏度对比。M、DL2000分子量标准；1、10⁴PFU JEV；2、10³PFU JEV；3、10²PFU JEV；4、10PFU JEV；5、1PFU JEV；6、10^-1PFU JEV；7、10^-2 PFU J EV；1、阴性对照。

图3本发明等温扩增试剂盒对阳性样品与阴性样品扩增结果可视化检测。1、JEV阴性样品；2、JEV阳性样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

一、待检组织样品RNA的提取：

1、取细胞培养物或组织研磨液或血清样品250μl，加入750μlTRIZOL，摇匀，吹打，至液体澄清；

2、上述步骤后放置15min后，加入0.2ml 氯仿，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min；

3、4℃12000rpm离心10min；

4、吸取上层水相于新管中；

5、加入0.5ml异丙醇，室温10min或4℃30min；

6、4℃12000r pm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗二遍；

7、沉淀自然干燥，勿抽干；

8、用8-10μl无RNase纯水重悬干燥后的RNA，置冰水浴立即用于等温扩增反应。

二、等温扩增反应液配制，每管20μl，反应液组成为：

10mM KCl、20mM Tris-Cl、10mM(NH4)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％TritonX-100、引物F3与B3各20pmol、引物FIP与BIP各50pmol、引物FLP与BLP各40pmol、Betaine1.1mM、AMV反转录酶5U、BstDNA聚合酶8U、dNTP 0.8mM、RNA酶抑制剂40U。

三、等温扩增反应：

向上述等温扩增反应管中加入提取的样品待检RNA 5μl，吹打混匀。将反应管置于60至65℃水浴中，作用1小时。

四、结果判定：

向上述反应管中加入1μl荧光染料SYBR Green I，混匀后直接观察颜色变化。液体变为黄绿色或绿色为阳性结果，表明待检样品中乙型脑炎病毒为阳性；变为橙黄色或黄色为阴性结果，表明等检样品中不含乙型脑炎病毒。

按以上方法对兽医生物技术国家重点实验室保存的猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒，猪细小病毒，猪伪狂犬病毒；猪圆环病毒阳性样品进行扩增检测，结果本试剂盒可对猪乙型脑炎阳性样品检测出阳性结果，对其它样品的检测结果为阴性，以上结果为电泳检查结果(图1)。

以乙型脑炎病毒细胞培养物样品进行RNA提取后作梯度稀释，同时以本试剂盒与常规RT-PCR方法比较检测方法的敏感度，电泳检查结果表明本试剂盒灵敏度比常规RT-PCR方法高(图2)

以本试剂盒对乙型脑炎病毒阳性与阴性样品扩增后，加入荧光染料后在可见光下可以很好的区别，阴性样品检测结果为反应液呈橙色或橙黄色，阳性样品检测结果为反应液呈绿色或黄绿色(图3)。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒

<130>KLPI091121

<160>10

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>JEV

<400>1

ccaccgtcga gatgtcagtg ac 22

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>JEV

<400>2

cgaagctagc caacttgct 19

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>artifical sequences

<400>3

ccaccgtcga gatgtcagtg acttttcgaa gctagccaac ttgct 45

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>JEV

<400>4

cacgactgga gaagcccaca a 21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>JEV

<400>5

cccacggtca gtgaagcctt 20

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<400>6

cacgactgga gaagcccaca attttcccac ggtcagtgaa gcctt 45

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>JEV

<400>7

tcatggcaaa cgacaaacc 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>JEV

<400>8

ttcccgaaaa gtccacatc 19

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>JEV

<400>9

tgaagcatga tagca 15

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>JEV

<400>10

agtagctatg tgtgcaa 17

Claims

1.用于环介导等温基因扩增方法检测乙型脑炎病毒的特异性引物组，其特征在于，包括以下引物序列：由SEQ ID NO∶7和SEQ ID NO∶8组成的引物对1；由SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶6组成的引物对2；由SEQ ID NO∶9和SEQ ID NO∶10所组成的引物对3。

2.权利要求1所述的特异性引物组在制备诊断或检测乙型脑炎病毒试剂中的用途。

3.一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的特异性引物组。

4.一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

(1)RNA提取试剂；

(2)等温扩增反应管；其中每支等温扩增反应管包含以下成分：10mM KCl、20mM Tris-HC1、10mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％Triton X-100、引物SEQ ID NO∶7与SEQ ID NO∶8各20pmol、引物SEQ ID NO∶3与SEQ ID NO∶6各50pmo1、引物SEQ ID NO∶9与SEQ ID NO∶10各40pmol、甜菜碱1.1mM、AMV反转录酶5U、Bst DNA聚合酶8U、dNTP 0.8mM、RNA酶抑制剂40U；

(3)荧光染料。

5.按照权利要求4所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的RNA提取试剂是Trizol试剂或采用CTAB法提取RNA的试剂。

6.按照权利要求4所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的荧光染料是1000倍的荧光染料SYBR Green I。