CN113444831A

CN113444831A - 用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物及其试剂盒、检测方法和应用

Info

Publication number: CN113444831A
Application number: CN202010232072.4A
Authority: CN
Inventors: 崔占峰; 黄巍; 王允; 王珲
Original assignee: Oxford University Suzhou Technology Co ltd
Current assignee: Oxford University Suzhou Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-09-28
Also published as: CN115461476A; WO2021190633A1

Abstract

本申请涉及用于SARS‑CoV‑2基因扩增的引物及试剂盒，其结合包括LAMP或RT‑LAMP等在内的基因扩增体系，能够快速、简单、高特异性地确定COVID‑19患者、无症状的携带者以及判断环境样本中是否存在SARS‑CoV‑2病毒等，无需复杂的仪器，并且可选地可以用肉眼读取测试结果，从而适用于大规模SARS‑CoV‑2病毒筛查。本申请还提供所述引物及试剂盒的使用方法及应用。

Description

用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物及其试剂盒、检测方法和应用

技术领域

本申请涉及用于核酸检测的引物及其应用，特别是涉及用于SARS-CoV-2检测的引物、引物组、试剂盒、检测方法及应用等。

背景技术

目前全球流行的新型冠状病毒SARS-CoV-2(亦被称为2019-nCoV、HCoV-19，下文称为″新冠病毒″)已导致大量人群感染新型冠状病毒肺炎COVID-19(下文称为″新冠肺炎″)。基于流行病学调查，COVID-19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。为了遏制病毒的传播，WHO迫切要求扩展对潜在患者筛查和检测。

病毒核酸检测，即检测病毒RNA，是一种行之有效的病毒检测方法。当前最常见的核酸诊断方法是基于实时RT-PCR检测新冠病毒核酸阳性。例如，中国的华大基因(BGI，https://www.bgi.com/kit)和美国疾控中心(CDC，https：//www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/about/testing.html)均提供试剂、引物和探针以支持对SARS-CoV-2进行RT-PCR诊断。目前，检测SARS-CoV-2的方法要么基于使用逆转录实时聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测病毒RNA本身，要么基于感染几天后出现于患者血液中的特异性免疫球蛋白IgM和IgG，这些现有方法要求实验室配备专门的检测仪器设备，由熟练的科学家和技术人员操作，并花费较长时间(约2个小时或以上)，因此，限制了核酸检测在当前对全球COVID-19大流行的巨大检测需求中的广泛应用。此外，现有的核酸检测试剂还存在假阴性比率较高(阳性检出率可低至30％～50％)的问题。

发明内容

基于此，需要一种快速、简单、特异性高的检测方式，以迅速准确地确定新冠肺炎患者(包括甚至尚未发生免疫反应的新冠肺炎患者)、无症状的携带者以及判断其他情形(如来自生活场所的环境样本)是否存在SARS-CoV-2病毒。

本申请的第一个方面，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为N15引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其核衣壳蛋白基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.1；反向引物：SEQ ID No.2；正向内引物：SEQ ID No.3；反向内引物：SEQ ID No.4；正向环引物：SEQ ID No.5；和反向环引物：SEQ ID No.6。

本申请的第二方面中，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为O117引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其Orf1ab基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.7；反向引物：SEQ ID No.8；正向内引物：SEQ ID No.9；反向内引物：SEQ ID No.10；正向环引物：SEQ ID No.11；和反向环引物：SEQ ID No.12。

本申请的第三方面中，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为N1引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其核衣壳蛋白基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.13；反向引物：SEQ ID No.14；正向内引物：SEQ ID No.15；反向内引物：SEQ ID No.16；正向环引物：SEQ ID No.17；和反向环引物：SEQ ID No.18。

本申请的第四方面中，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为S17引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其突刺蛋白基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.19；反向引物：SEQ ID No.20；正向内引物：SEQ ID No.21；反向内引物：SEQ ID No.22；正向环引物：SEQ ID No.23；和反向环引物：SEQ ID No.24。

在其中一些实施例中，上述任一种寡核苷酸引物组的正向内引物序列的5’端带有荧光标记。在其中一些实施例中，所述荧光标记为FAM。

本申请的第五方面中，还提供用于扩增SARS-CoV-2基因的引物组集合，其包括上述寡核苷酸引物组中的任意两种或两种以上的组合。

在其中一些实施例中，使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合进行扩增的方式可以是本领域技术人员所知晓的任何基因扩增技术，例如包括但不限于，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、多重聚合酶链式反应(Multiplex PCR，mPCR)、实时或定量聚合酶链式反应(Real-Time/Quantitative PCR，qPCR)、核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA)和环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，以及反转录聚合酶链式反应(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、反转录多重聚合酶链式反应(RT-mPCR)、反转录实时或定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、反转录核酸序列依赖性扩增(RT-NASBA)和反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)。

在其中一些实施例中，使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合进行扩增的方式是环介导等温扩增(LAMP)或反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)。

本申请的第六方面中，还用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，该试剂盒包括上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括的引物组为本申请第一方面和第二方面的引物组。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶，并可选地包括pH指示剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和反转录酶，并可选地包括pH指示剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括具有RNA反转录酶和DNA聚合酶双重功能的单个酶。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括基因扩增反应液或预混液、阴性对照、质控品和/或使用说明书。

在其中一些实施例中，所述基因扩增反应液包含水、dNTPs、DNA聚合酶(如Taq酶)、缓冲、MgCl₂；在一些实施例中，所述基因扩增反应液或预混液还可以包括反转录酶；可选地，所述基因扩增反应液或预混液还可以包括酶稳定剂、荧光染料(如电泳荧光染料)、pH指示剂等。

在其中一些实施例中，所述阴性对照为人肌动蛋白引物；在其中一些实施例中，所述阴性对照为人β-肌动蛋白引物；在其中一些实施例中，所述人β-肌动蛋白引物包括：正向引物：SEQ ID No.29；反向引物：SEQ ID No.30；正向内引物：SEQ ID No.31；反向内引物：SEQ ID No.32。

本申请的第七方面中，还提供上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合用于检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：获取待测样本；提取待测样本的RNA作为模板；对所述RNA进行反转录并使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合对反转录所得DNA进行扩增，或者，使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合对所述RNA进行反转录扩增；和基于所述扩增结果或反转录扩增结果，确定所述待测样本是否含有SARS-CoV-2。

本申请的第八方面中，还提供上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合在制备用于检测SARS-CoV-2的试剂中的用途。

在其中一些实施例中，所述检测SARS-CoV-2包括：获取待测样本；提取待测样本的RNA作为模板；对所述RNA进行反转录并使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合对反转录所得DNA进行扩增，或者，使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合对所述RNA进行反转录扩增；和基于所述扩增结果或反转录扩增结果，确定所述待测样本是否含有SARS-CoV-2。

本申请的第九方面中，本申请还提供用于一步检测核酸的方法，所述方法包括：获取待测样本，并从所述待测样本采集细胞；使用适于检测所述核酸的引物，在同一个反应体系中对所述细胞一步实现：细胞裂解；核酸提取；基因扩增或反转录扩增；和基于所述扩增结果，确定所述待测样本是否含有所述核酸。

在其中一些实施例中，所述核酸是DNA；在其中一些实施例中，所述核酸是RNA。在其中一些实施例中，所述扩增是LAMP扩增。在其中一些实施例中，所述反转录扩增是RT-LAMP扩增。

在其中一些实施例中，所述核酸是病毒RNA，且所述方法包括：获取待测样本，并从所述待测样本采集细胞；在同一个反应体系中一步实现细胞裂解、RNA提取、RNA反转录和DNA扩增；和，基于所述扩增结果，确定所述待测样本是否含有待测病毒；在其中一些实施例中，所述待测样本是临床病毒标本，例如咽拭子或鼻拭子。

在其中一些实施例中，上述第七、第八、第九方面中所述扩增为LAMP，所述反转录扩增为RT-LAMP。

在其中一些实施例中，上述第七、第八、第九方面中所述基于所述扩增结果或反转录扩增结果，确定所述待测样本是否含有SARS-CoV-2的方式可以是通过凝胶电泳、荧光染料或pH指示剂，也可以是其他对扩增结果定性、定量或半定量的方式。优选地，通过pH指示剂来确认扩增结果。

本申请的发明人通过针对SAV-CoV-2病毒的多个特异性基因区域进行创造性的引物设计，开发了可以快速、简单且灵敏地检测SAV-CoV-2的高特异性引物组。该引物具有极高的检测准确性和灵敏性。同时，发明人还克服了LAMP引物设计复杂且困难的技术难题(Law,J.W.F.,Ab Mutalib,N.S.,Chan,K.G.,and Lee,L.H.(2015)Rapid methods for thedetection of foodborne bacterial pathogens:principles,applications,advantagesand limitations,Frontiers in Microbiology 5.)，并增设了用于LAMP反应加速的环引物，由此使得该高特异性引物组可以运用于LAMP及RT-LAMP反应，通过进行病毒RNA的高速扩增，极大地缩短了SAV-CoV-2检测时间，并显著降低了检出限，因此显著提高了SAV-CoV-2检测的效率和敏感性。此外，使用本申请的引物组进行SAV-CoV-2检测的一些实施例中，还可以通过显色(例如pH指示剂)用肉眼判定结果，从而无需实验室专门仪器或实验人员即可简单快捷地现场判定检测结果。

本申请的发明人还提供了采用本申请所述引物组的COVID-19检测试剂盒，其可以快速、简单且灵敏地检测SAV-CoV-2，无需复杂的仪器，并且可选地可以用肉眼读取测试结果，由此可以应用于机场、火车站和医院等场景，特别是农村地区的区域医院和医疗中心，迅速确定新冠肺炎患者(包括甚至尚未发生免疫反应的新冠肺炎患者)和无症状的携带者，或确定居家或公共场所等是否存在SAV-CoV-2病毒等，对患者的及时治疗、公共卫生决策和遏制病毒传播提供至关重要的信息，为在公共场所和医院(尤其是农村地区的地区医院和医疗中心)进行大规模SARS-CoV-2病毒筛查铺平了道路。

附图说明

图1展示了SARS-CoV-2病毒的RNA图谱以及根据本申请第一至第四方面所述的N15、O117、N1、S17引物组设计的相关基因区域；

图2展示了根据本申请所述的一个实施例中，N15、O117、N1、S17引物组对SARS-CoV-2合成DNA片段的体外LAMP反应的凝胶电泳及荧光结果，其中：

图2A为N1引物组(靶标为N基因体外转录DNA)的凝胶电泳及荧光结果：(1)N1引物组+N基因DNA(200k拷贝)；(2)N1引物组+N基因DNA(200拷贝)；(3)N1引物组+N基因DNA(200k拷贝)+人基因组；(4)N1引物组+N基因DNA(200拷贝)+人基因组；(5)N1引物组+人基因组；(6)人β-肌动蛋白引物+人基因组；(7)人β-肌动蛋白引物+N基因DNA(200k拷贝)；和(L)预染蛋白Ladder；

图2B为N15引物组(靶标为N基因体外转录DNA)的凝胶电泳及荧光结果：(1)N15引物组+N基因DNA(200k拷贝)；(2)N15引物组+N基因DNA(200拷贝)；(3)N15引物组+N基因DNA(200k拷贝)+人基因组；(4)N15引物组+N基因DNA(200拷贝)+人基因组；(5)N15引物组+人基因组；(6)人β-肌动蛋白引物+人基因组；(7)人β-肌动蛋白引物+N基因DNA(200k拷贝)；和(L)预染蛋白Ladder；

图2C为O117引物组(靶标为Orf1ab基因体外转录DNA)的凝胶电泳结果：(1)O117引物组+Orf1ab基因DNA(200k拷贝)；(2)O117引物组+Orf1ab基因DNA(200拷贝)；(3)O117引物组+Orf1ab基因DNA(20拷贝)；(4)O117引物组+Orf1ab基因DNA(2拷贝)；(5)O117引物组+Orf1ab基因DNA(200拷贝)+人基因组；(6)O117引物组+人基因组；(7)O117引物组+水(8)人β-肌动蛋白引物+人基因组DNA；和(L)预染蛋白Ladder；

图2D为S17引物组(靶标为S基因体外转录DNA)的凝胶电泳结果：(1)S17引物组+S基因DNA(200k拷贝)；(2)S17引物组+S基因DNA(200拷贝)；(3)S17引物组+S基因DNA(20个拷贝)；(4)S17引物组+S基因DNA(2个拷贝)；(5)S17引物组+S基因DNA(200拷贝)+人基因组；(6)S17引物组+人基因组；(7)S17引物组+水(8)人β-肌动蛋白引物+人基因组DNA；和(L)预染蛋白Ladder；

图3展示了根据本申请所述的一个实施例中，N1和N15引物组，以SARS-CoV-2病毒N基因RNA为靶标的体外RT-LAMP反应中，分别在(图3A)15分钟，(图3B)20分钟和(图3C)30分钟取样的反应混合物的凝胶电泳结果：(1)N1引物组+N基因RNA(200拷贝)；(2)N1引物组+N基因RNA(20拷贝)；(3)N1引物组+N基因RNA(2拷贝)；(4)N15引物组+N基因RNA(200拷贝)；(5)N15引物组+N基因RNA(20拷贝)；(6)N15引物组+N基因RNA(2拷贝)；(L)预染蛋白Ladder；

图4展示了根据本申请所述的一个实施例中，O117引物组以SARS-CoV-2病毒Orf1ab基因RNA为靶标(图4A，4B，4C)、S17引物组以SARS-CoV-2病毒S基因RNA为靶标(图4D，4E，4F)的体外RT-LAMP反应中，分别在(图4A，4D)15分钟，(图4B，4E)20分钟和(图4C，4F)30分钟取样的反应混合物的凝胶电泳结果：(1)O117或S17引物组+RNA靶标(200k拷贝)；(2)O117或S17引物组+RNA靶标(200拷贝)；(3)O117或S17引物组+RNA靶标(20拷贝)；(4)O117或S17引物组+RNA靶标(2拷贝)；(5)O117或S17引物组+RNA靶标(200拷贝)+人类基因组；(6)O117或S17引物组+人基因组；(7)O117或S17引物组+水；(8)人引物+人基因组；

图5展示了根据本申请所述的一个实施例中，使用N15引物组进行比色RT-LAMP反应的显色观察及凝胶电泳结果，其中图5A为RT-LAMP之前反应混合物的颜色，图5B为RT-LAMP后反应混合物的颜色，图5C为反应混合物的凝胶电泳，且其中(1)N15引物组+N基因RNA(200k拷贝)；(2)N15引物组+N基因RNA(200拷贝)；(3)N15引物组+N基因RNA(20拷贝)；(4)N15引物组+N基因RNA(2拷贝)；(5)N15引物组+人基因组；(6)人引物+人基因组；(7)人引物+全人RNA；和(8)仅比色染料MasterMix；

图6展示了根据本申请所述的一个实施例中，使用本申请所述的荧光标记引物组对SARS-CoV-2的RT-LAMP比色/荧光检测体外实验的结果，其中，图6A为扩增产物的比色结果显示，图6B为产物在UV光照下的荧光图像，且试管#1、#2和#3中分别含有带FAM荧光标记的N15引物组、O117引物组和人β肌动蛋白引物组(SEQ ID No.29-32)。

图7展示了根据本申请所述的一个实施例中，使用人细胞系和人引物测试本申请所述的一个实施例中的一步检测待测病毒方法的RT-LAMP反应检测结果，(A)细胞分散于Hanks平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)中，且分别含有(1)0个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(2)10个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(3)50个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(4)100个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(5)hRNA+人类β-肌动蛋白引物；(6)水+人类β-肌动蛋白引物；(7)水(无引物)；及(B)细胞分散于0.85％NaCl溶液中，且分别含有(1)0个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(2)10个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(3)50个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(4)100个细胞+人类β-肌动蛋白引物；(5)hRNA+人类β-肌动蛋白引物；和(6)水+人类β-肌动蛋白引物。

具体实施方式

为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本申请。本申请所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1.用于检测的特异引物序列设计

本申请的发明人针对发表于NCBI的SARS-CoV-2病毒基因组序列(GenBank，NC_045512.2)设计了高特异性引物序列。特别地，本申请设计了4个引物组，即O117、S17、N1和N15引物组，其特异性针对病毒基因序列中的不同区域。每个引物组含6个引物，即正向引物F3、反向引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB。引物设计使用了引物设计软件PrimerExplorer(http://primerexplorer.jp/e/)作为辅助工具。

本申请的引物设计考虑了与SARS-CoV-2病毒RNA本身高度相关的关键特性，以保证各个引物组的高特异性、准确性和敏感性。SARS-CoV-2是大约30kb的单链RNA病毒。本申请的引物组分别特异性针对SARS-CoV-2病毒RNA中编码开放读码框1ab(Open ReadingFrame 1ab,Orf1ab)，刺突糖蛋白(Spike Glycoprotein，S蛋白)基因以及核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，N蛋白)基因中两个区域(图1)。SARS-CoV-2的Orf1ab约为21kb，编码复制酶多蛋白，发明人针对Orf1ab设计了O117引物组，以覆盖病毒RNA 5'端的反向区域(图1)。S17引物组则靶向S基因，该基因编码的刺突糖蛋白是SARS-CoV-2病毒结合人血管紧张素转化酶2(Angiotensin I Converting Enzyme 2,ACE2蛋白)并侵入人体细胞的关键因素。此外，核衣壳蛋白的N基因位于病毒RNA的3'端，是SARS样冠状病毒的保守序列；在采样和RNA提取过程中，病毒RNA会被RNase攻击，从5'端向3’端降解，发明人还针对该区域设计了N-1和N-15引物组，所述引物组能够检测到SARS-CoV-2的部分降解RNA。

本申请的各个引物组所针对的SARS-CoV-2病毒RNA区域为240-260bp，可通过基因扩增反应进行检测。

此外，本申请的引物设计还适应于LAMP和RT-LAMP反应的运用。LAMP和RT-LAMP反应在恒定温度(通常为65℃)下进行反应，在短短的30分钟内完成DNA扩增，所需设备也非常简单。由于SARS-CoV-2是约为30kb的RNA病毒，因此RT和LAMP的共同单一反应可以显著缩短反应时间，并省略RNA纯化步骤，从而可以快速检测SARS-CoV-2。对此，发明人在各个引物组中包括了正向环引物LF和反向环引物LB，用于加速LAMP反应，由此本申请的各个引物组可以有利地应用于LAMP或RT-LAMP反应体系进行高效扩增，从而在保证高特异性的前提下达到迅速检测的目的。

本申请所设计的引物组序列如下表1中所示。

在一些实施例中，各个引物组的正向内引物FIP的5’端可以进行荧光标记(如FAM标记)，以快速便捷地观察检测结果。

表1.SARS-CoV-2病毒检测引物

*在一些实施例中，正向内引物FIP的5’端以FAM荧光标记。

实施例2：SARS-CoV-2病毒合成DNA片段靶标的体外检测模拟实验

本实施例是用于测试本申请的引物用于SARS-CoV-2合成DNA片段的体外(invitro)检测模拟实验。

一、DNA靶标的合成与纯化

为了进行模拟实验，设计了针对N、S和Orf1ab靶基因中共四个相关区域的DNA片段，每个片段分别包含用于体外转录的T7启动子，即N1-T7、N15-T7、S17-T7、O117-T7，其序列(SEQ ID NO.25-28)如表2所示。采用了人β-肌动蛋白引物(Poon LLM,et al.Detectionof human influenza A viruses by loop-mediated isothermalamplification.Journal of Clinical Microbiology 43,427-430(2005))作为阴性对照，其序列(SEQ ID NO.29-32)如表3所示。所有设计的引物和DNA片段，以及阳性对照质粒(2019-nCoV_N_Positive Control)均由集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies，IDT，UK)制备。

表2.含T7启动子(粗体)的N、S和Orf1ab靶基因合成DNA片段

表3.人β-肌动蛋白质粒引物序列

N、S和Orf1ab靶基因的DNA序列由IDT合成制备，并按照厂商说明重制为50ng/μl。基于每个靶基因的分子量确定其拷贝数，并稀释到200,000拷贝/μl、200拷贝/μl、0拷贝/μl和2拷贝/μl用于后续实验。

T7_N，T7_S和T7_O的DNA序列由IDT合成制备，并按照厂商说明重制为50ng/μl。

二、LAMP实验

1.实验处理组设计

O117、S17、N1和N15引物组的实验处理组分别设置如下，其中200k(200,000)、200、20和2等代表反应混合物中DNA序列的总拷贝数：

A.N1引物组(靶标为N基因合成DNA片段)：(1)N1引物组+N基因DNA(200k拷贝)；(2)N1引物组+N基因DNA(200拷贝)；(3)N1引物组+N基因DNA(200k拷贝)+人基因组；(4)N1引物组+N基因DNA(200拷贝)+人基因组；(5)N1引物组+人基因组；(6)人β-肌动蛋白引物+人基因组；(7)人β-肌动蛋白引物+N基因DNA(200k拷贝)；和(L)预染蛋白Ladder。

B.N15引物组(靶标为N基因合成DNA片段)：(1)N15引物组+N基因DNA(200k拷贝)；(2)N15引物组+N基因DNA(200拷贝)；(3)N15引物组+N基因DNA(200k拷贝)+人基因组；(4)N15引物组+N基因DNA(200拷贝)+人基因组；(5)N15引物组+人基因组；(6)人β-肌动蛋白引物+人基因组；(7)人β-肌动蛋白引物+N基因DNA(200k拷贝)；和(L)预染蛋白Ladder。

C.O117引物组(靶标为Orf1ab基因合成DNA片段)：(1)O117引物组+Orf1ab基因DNA(200k拷贝)；(2)O117引物组+Orf1ab基因DNA(200拷贝)；(3)O117引物组+Orf1ab基因DNA(20拷贝)；(4)O117引物组+Orf1ab基因DNA(2拷贝)；(5)O117引物组+Orf1ab基因DNA(200拷贝)+人基因组；(6)O117引物组+人基因组；(7)O117引物组+水(8)人β-肌动蛋白引物+人基因组DNA；和(L)预染蛋白Ladder。

D.S17引物组(靶标为S基因合成DNA片段)：(1)S17引物组+S基因DNA(200k拷贝)；(2)S17引物组+S基因DNA(200拷贝)；(3)S17引物组+S基因DNA(20个拷贝)；(4)S17引物组+S基因DNA(2个拷贝)；(5)S17引物组+S基因DNA(200拷贝)+人基因组；(6)S17引物组+人基因组；(7)S17引物组+水(8)人β-肌动蛋白引物+人基因组DNA；和(L)预染蛋白Ladder。

2.实验步骤

实验前，将所有设备、层流柜和工作台喷涂RNaseZap^TM。使用滤芯移液器吸头以防止交叉污染。

反应前，以本申请的O117、S17、N1和N15引物组分别制备10X引物混合物(FIP，16μM；BIP，16μM；F3，2μM；B3，2μM；LF，4μM；LB，4μM)。

使用WarmStart^TMLAMP 2XMaster Mix(DNA&RNA)预混液(New England Biolabs,UK)进行LAMP反应。具体地，将25μl反应混合物(2X MasterMix，12.5μl；10X引物混合物，2.5μl；DNA靶标，1μl；不含DNase和RNase的分子级水，9μl)均匀混合并离心1秒钟。在热循环仪65℃下进行LAMP反应30分钟。通过凝胶电泳对扩增结果进行确认。

作为示例，对N1和N15部分处理组还添加了荧光染料(New England Biolabs，UK)，在紫外线照射下从PCR管中通过肉眼直接观察颜色变化，与凝胶电泳结果相比较。

三、实验结果：

实验结果如图2A-2D所示。

如图2A和图2B所示的凝胶电泳结果所示，N1和N15引物组扩增了N基因的DNA(图2A和图2B中的泳道1-2)，但没有扩增人基因组DNA(图2A和图2B中的泳道5)。同样，如图2C和图2D所示，O117和S17引物组也分别特异性扩增了Orf1ab基因和S基因的DNA(图2C和图2D中的泳道1-4)，但是没有扩增人基因组DNA(图2C和2D中的泳道5)。由此可知，O117、S17、N1和N15引物组相对于人基因组均对SARS-CoV-2合成DNA片段标靶具有优越的扩增特异性。

此外，即使将人基因组添加到病毒DNA中，各个引物组对反应混合物中对应基因的扩增性能(图2A和2B中的泳道4，图2C和2D中的泳道5)也没有被干扰影响，显示了本申请的引物组优异的抗干扰性，这对于使用LAMP检测来自人体样本中的病毒RNA是必不可少的性质。

对于添加了荧光染料的部分处理组在紫外线照射下对PCR管进行观察，可以看出，尽管扩增阴性管中存在荧光背景(图2A和2B)，但仍可看到扩增阳性管中的荧光强度要比扩增阴性管中的荧光强度强。荧光报告结果与电泳凝胶的结果一致。

本实施例中，DNA扩增的所有LAMP反应均为30分钟。可以看出，各个引物组均能够在30分钟内充分扩增至少200个拷贝的对应基因序列并观察到明显的阳性结果。O117和S17引物组甚至可以分别在30分钟内充分扩增仅含低至20个和2个拷贝的病毒DNA(图2C中的泳道3、图2D中泳道4)，并呈现阳性结果，这表明本申请的引物组具有很高的检测效率和检测敏感性。

实施例3：SARS-CoV-2病毒RNA靶标的体外模拟实验

本实施例是用于测试本申请的引物用于检测SARS-CoV-2病毒RNA的体外(invitro)模拟实验。

一、RNA靶标的获取与纯化

使用HiScribe^TMT7高产RNA合成试剂盒(HiScribe^TM T7 High Yield RNASynthesis Kit，New England Biolabs,UK)，对实施例1中所述的由IDT合成T7_N，T7_S和T7_O的DNA序列进行体外转录。

使用RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen,UK)纯化转录产物，并使用NanoDrop核酸检测仪测量RNA的浓度和质量。

基于每个靶RNA的分子量确定其拷贝数，并稀释到200,000拷贝/μl、200拷贝/μl、20拷贝/μl和2拷贝/μl用于后续实验。

使用Fast DNA^TMSPIN试剂盒(MP Biomedicals)从人iPSC细胞系(Human episomaliPSC line，产品号A18945,ThermoFisher Scientific Ltd)中纯化人全基因组，然后再用DNA清洗试剂盒(DNA Cleanup Kit，New England Biolabs,UK)纯化。

使用RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen,UK)从人iPSC细胞中纯化人全RNA。

二、RT-LAMP实验

1.实验处理组设计

A.N1和N15引物组(靶标为N基因的体外转录RNA)：(1)N1引物组+N基因RNA(200拷贝)；(2)N1引物组+N基因RNA(20拷贝)；(3)N1引物组+N基因RNA(2拷贝)；(4)N15引物组+N基因RNA(200拷贝)；(5)N15引物组+N基因RNA(20拷贝)；(6)N15引物组+N基因RNA(2拷贝)；(L)预染蛋白Ladder。

B.O117和S17引物组(靶标为N基因的体外转录RNA)：(1)O117或S17引物组+RNA靶标(200k拷贝)；(2)O117或S17引物组+RNA靶标(200拷贝)；(3)O117或S17引物组+RNA靶标(20拷贝)；(4)O117或S17引物组+RNA靶标(2拷贝)；(5)O117或S17引物组+RNA靶标(200拷贝)+人类基因组；(6)O117或S17引物组+人基因组；(7)O117或S17引物组+水；(8)人引物+人基因组。

2.实验步骤

本实施例的实验步骤与实施例2基本相同，但在15分钟、20分钟和30分钟时分别对反应混合物进行取样，并进行凝胶电泳以确认扩增结果。

四、实验结果：

实验结果如图3、图4所示。

本实施例通过进一步将每个反应中RNA靶标的拷贝数从200个稀释到2个(反应溶液总体积为25μl)来评估RT-LAMP的敏感性，并通过在反应开始后的15分钟、20分钟和30分钟对反应混合物进行采样来检查反应效率和检出限。实验结果表明，在将RT和LAMP整合到一个反应中后，O117、S17、N1和N15引物组仍然可以高特异性、高敏感性地高效扩增病毒RNA片段。

如图3所示，显示N1、N15引物组均能够在20分钟内、30分钟内检测到2个拷贝的靶RNA(图3A，3B和3C)。如图4所示，S17引物组在30分钟的RT-LAMP反应中可检测到2个S基因RNA拷贝，O117引物组能够在30分钟内检测出20拷贝Ord1ab基因RNA。结果表明，本申请的O117、S17、N1和N15引物组均非常灵敏，可以在30分钟的RT-LAMP反应中检测到病毒RNA。其中，使用引物N1和S17可以达到每毫升80拷贝病毒RNA的灵敏度。

此外，还可以看出，样本中的RNA拷贝数越高，获得产物所需的时间越短(图3和4)。当每个反应中RNA的拷贝数为200时，在短至15分钟内即可看到明显的扩增结果(图3和4)。

实施例4：SARS-CoV-2的RT-LAMP比色检测体外实验

本实施例是用于测试使用本申请的引物组(以N15为例)进行SARS-CoV-2病毒RNA的RT-LAMP比色检测体外实验。

1.实验处理组：

本实施例中采用的实验处理组如下，其中200k(200,000)、200、20和2等代表反应混合物中DNA序列的总拷贝数：(1)N15引物组+N基因RNA(200k拷贝)；(2)N15引物组+N基因RNA(200拷贝)；(3)N15引物组+N基因RNA(20拷贝)；(4)N15引物组+N基因RNA(2拷贝)；(5)N15引物组+人基因组；(6)人引物+人基因组；(7)人引物+全人RNA；和(8)仅比色染料MasterMix。

2.实验步骤：

本实施例中所使用的RNA靶标的获取与纯化方法、RT-LAMP实验步骤均如实施例3所述，但WarmStart^TM LAMP 2X Master Mix(DNA&RNA)预混液替换为或WarmStart^TMColorimetric LAMP 2X Master Mix(DNA&RNA)预混液。

RT-LAMP反应进行30分钟后，对PCR反应管内反应混合物的颜色变化进行肉眼观察，并通过凝胶电泳对扩增结果进行确认。

3.实验结果：

本实施例的RT-LAMP比色实验结果如图5所示。

由于核酸扩增释放出焦磷酸，从而改变反应的pH，因此可以使用pH指示剂显示RT-LAMP的阳性或阴性结果。所述pH指示剂可以是酚红，其在pH8.2-8.6时呈粉红色，并当pH下降时变为黄色(阳性)。

图5A展示了30分钟RT-LAMP反应前后的反应混合物的颜色，并与凝胶电泳结果(图5B)进行了比对。如图5A所示，如果靶序列已扩增(扩增阳性)，则可以观察到从粉红色到黄色的可见颜色变化。如图5B所示凝胶中RT-LAMP产物强度与图5A中的反应混合物的颜色变化相一致。因此，比色RT-LAMP测定法可以可靠地检测SARS-CoV-2病毒RNA的N基因，并且颜色变化可以半定量指示靶序列的数量。由此，可以将RT-LAMP结果可视化，从而无需特定仪器及荧光染料即可使用肉眼读取结果。

虽然本实施例以N15引物组为例，且以RT-LAMP反应为例，但本领域技术人员可以知晓，还可以将相同的原理类似地应用于其他引物组(O117、N1、S17引物组)，以及类似地应用于LAMP反应中。

实施例5：荧光标记引物的SARS-CoV-2的RT-LAMP比色/荧光检测体外实验

本实施例是用于测试使用本申请的引物组(以N15和O117为例)在正向内引物FIP的5’端进行FAM荧光标记(5'-FAM-FIP)后(表1)对SARS-CoV-2的RT-LAMP比色/荧光检测体外实验。

1.实验处理组：

分别用带5'-FAM-FIP的N15(#1)、O117(#2)引物组对N15合成DNA片段和O117合成DNA片段的体外转录RNA产物进行检测，以人β肌动蛋白引物组(#3，SEQ ID No.29-32)作为阴性对照，以水作为空白对照(Blank)。

2.实验步骤：

本实施例的实验方法与实施例4相同。

RT-LAMP反应进行30分钟后，对PCR反应管内反应混合物的颜色变化进行肉眼观察。此外，将反应产物纯化后，在紫外光下进行观察。

3.实验结果：

本实施例的RT-LAMP比色实验结果如图6所示。

如图6A所示，反应产物可以肉眼观察到各个特异性引物组的相应比色结果，其中阳性结果显示为颜色从粉红色变为黄色，阴性结果显示为颜色保持粉红色不变。如图6B所示，纯化产物在紫外光下的阳性结果的荧光显示与比色结果相一致。

本申请的荧光标记引物组进一步克服了RT-LAMP反应在实际应用中可能遇到的各种不确定性，例如患者样品条件的差异对pH改变的影响，或者各种缓冲液对比色读数的影响等，通过比色和荧光双重显示，确保了诊断结果的可靠性。

虽然本实施例以N15和O117引物组为例，且以RT-LAMP反应为例，但本领域技术人员可以知晓，还可以将相同的原理类似地应用于其他引物组(如N1、S17引物组)，以及类似地应用于LAMP反应中。

实施例6：SARS-CoV-2的RT-LAMP检测临床实验

本实施例是使用本申请的引物组(以N15和O117为例)对SARS-CoV-2的RT-LAMP检测临床实验。

一、临床样本的采集

中国疾病预防控制中心授权深圳市罗湖人民医院检测SARS-CoV-2病毒的临床样本。深圳市罗湖人民医院伦理委员会已批准使用临床样本对COVID-19进行快速诊断的研究。

总共从患者中收集了16个临床样本(8个阳性样本和8个阴性样本)，所有临床样本均通过临床咽喉拭子采样。将所收集的患者呼吸道标本(咽拭子)立即放入装有3ml病毒运输培养基(Virus transport media,VTM)(宁波海尔施基因科技有限公司(Health GeneTechnologies Co.Ltd.,HGT,中国宁波))的无菌试管中,并在VTM中进行存储和运输。

按照临床样本SARS-CoV-2核酸检测标准指导原则进行病毒灭活步骤，在中国深圳罗湖人民医院生物安全等级2(BSL 2)医学实验室中，将拭子样本在56℃加热30分钟以使其失活。

二、提取临床样本RNA

在Smart LabAssist-32平台(台湾圆点纳米技术股份有限公司(Taiwan AdvancedNanotech Inc)，中国桃园)上，使用RNA提取试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司，中国)从拭子样本中提取RNA。为避免TE缓冲液对RT-LAMP反应的干扰，用不含RNase和DNase的水洗脱RNA。

三、SARS-CoV-2临床RNA样本的常规RT-qPCR检测实验

使用商购2019-nCoV RT-PCR试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司(ShanghaiZJ Bio-Tech Co,Ltd))，中国上海)来测定16个临床样本对SARS-CoV-2病毒是否呈阳性。根据厂商说明，使用ABI 7500实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)进行测序。使用的反应混合物(体积为25μl)为：5μl RNA模板；19μl 2019-nCOV RT-PCR缓冲液；1μlRT-PCR酶混合物。热循环条件为：45℃下10分钟逆转录，95℃下3分钟PCR初始激活，以及45个在95℃下15s和58℃下的30s的循环。

四、SARS-CoV-2临床RNA样本的RT-LAMP检测实验

使用预混合的检测试剂盒对16个临床样本进行RT-LAMP分析。

每个试剂盒由三个试管#1、#2和#3组成，试管中分别包含O117，N15和人β-肌动蛋白引物(表1)。首先向三个试管中注入5μl不含RNase的水(Sigma-Aldrich Co)，12.5μLWarmStart Colorimetric Lamp 2X Master Mix预混液(New England Biolabs,UK)和2.5μL10x引物混合物(FIP，16μM；BIP，16μM；F3，2μM；B3，2μM；LF，4μM；LB，4μM)。这些试剂盒在牛津苏州高等研究院(Oxford Suzhou Centre For Advanced Research，OSCAR)预先制备，然后用冰盒运送到深圳罗湖人民医院。

为了检测SARS-CoV-2病毒，将5μl从患者样本中提取的RNA分别添加到#1、#2和#3管中。将检测试剂盒在65℃下孵育30分钟。

五、实验结果

实验结果如表4所示。

RT-LAMP反应后，每个试剂盒的试管#1和#2在所有8个阳性样本中均变黄，表明样本中都存在目标病毒RNA，而在所有8个阴性样本中，试管#1和#2均保持粉红色。所有检测试剂盒的3号试管在阳性和阴性样本中均保持粉红色，这表明人β-肌动蛋白引物无法检测患者样本中的β-肌动蛋白基因转录物。

SARS-CoV-2临床RNA样本的常规RT-PCR检测实验和RT-LAMP检测实验的实验结果如表4所示。在诊断COVID-19样本时，RT-LAMP分析与常规RT-PCR结果具有100％的匹配。比较RT-qPCR和RT-LAMP的结果，可以看出RT-qPCR对Orf1ab基因的Ct值为38，这表明RT-LAMP的视觉颜色变化读数是具有高敏感性。

表4.SARS-CoV-2临床RNA样本的RT-PCR和RT-LAMP检测实验结果对比

注：Ct:循环阈值；ORF1ab:orf1ab基因；N:N基因；E:E基因；IC:内标,RNase P基因.

实施例7：一步核酸检测法的RT-LAMP反应实验

本实施例是使用人细胞系和人引物为例，检验本申请所述的一步核酸检测方法的RT-LAMP反应实施例。本领域技术人员可以知晓，通过改换适当的引物、酶和反应试剂，本实施例所述的方法还可以用于检测各种样本中的其他不同细胞。

一、实验步骤

根据如下处理组设置，将适量人细胞系(Human episomal iPSC line，产品号A18945,ThermoFisher Scientific Ltd)细胞分别分散于HBSS和0.85％NaCl溶液后，各取1μl用于后续实验。

本实验的处理组为：

A.HBSS：(1)0细胞+人类β-肌动蛋白引物；(2)10细胞+人类β-肌动蛋白引物；(3)50细胞+人类β-肌动蛋白引物；(4)100细胞+人类β-肌动蛋白引物；(5)hRNA+人类β-肌动蛋白引物；(6)水+人类β-肌动蛋白引物；(7)水(无引物)；和

B.0.85％NaCl(1μl)：(1)0细胞+人类β-肌动蛋白引物；(2)10细胞+人类β-肌动蛋白引物；(3)50细胞+人类β-肌动蛋白引物；(4)100细胞+人类β-肌动蛋白引物；(5)hRNA+人类β-肌动蛋白引物；(6)水+人类β-肌动蛋白引物。

本实施例中采用的人引物为前述实施例中所用的人类β-肌动蛋白引物，所使用的试剂和RT-LAMP实验步骤均如实施例4所述，但反应时间为40分钟。

RT-LAMP反应进行30分钟后，对PCR反应管内反应混合物的颜色变化进行肉眼观察。

二、实验结果

如图7A和7B所示，分散于HBSS和0.85％NaCl溶液中的细胞在30分钟的RT-LAMP反应后，含有细胞和人类引物的PCR试管从粉红色变为黄色，说明样本细胞在同一个反应体系中一步实现细胞裂解，RNA提取、RNA反转录和DNA扩增，并在自然光下即可肉眼观察到阳性结果，具有高效、简单的特点。

此外，当细胞浓度低至100、50甚至10个细胞/μl时，仍能清楚观察到阳性结果，说明本方法具有极低的检出限，能够高敏感地检测样本中的病毒。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 牛津大学（苏州）科技有限公司

<120> 用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物及其试剂盒、检测方法和应用

<130> GP20604881GB

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agatcacatt ggcacccg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccattgccag ccattctagc 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgctcccttc tgcgtagaag ccaatgctgc aatcgtgcta c 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcggcagtc aagcctcttc cctactgctg cctggagtt 39

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaatgttgt tccttgagga agtt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttcctcatc acgtagtcgc aaca 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccccaaaatg ctgttgtt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagcacgtgg aacccaat 18

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggttttcaag ccagattcat tatggatgtc acaattcaga agtagga 47

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcttcgtaag ggtggtcgca gcacacttgt tatggcaac 39

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcggcaagac tatgctcagg 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgcctttgg aggctgtgt 19

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggaccccaa aatcagcg 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccttgtcct cgagggaat 19

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccactgcgtt ctccattctg gtaaatgcac cccgcattac g 41

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgcgatcaaa acaacgtcgg cccttgccat gttgagtgag a 41

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgaatctgag ggtccaccaa a 21

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggtttaccca ataatactgc gtctt 25

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tctttcacac gtggtgtt 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtaccaaaaa tccagcctc 19

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

catggaacca agtaacattg gaaaacctga caaagttttc agatcc 46

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctctgggacc aatggtacta agaggacttc tcagtggaag ca 42

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaaaggtaag aacaagtcct gagt 24

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ctgtcctacc atttaatgat ggtgt 25

<210> 25

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccatgggtta atacgactca ctatagggag atgataatgg accccaaaat cagcgaaatg 60

caccccgcat tacgtttggt ggaccctcag attcaactgg cagtaaccag aatggagaac 120

gcagtggggc gcgatcaaaa caacgtcggc cccaaggttt acccaataat actgcgtctt 180

ggttcaccgc tctcactcaa catggcaagg aagaccttaa attccctcga ggacaaggcg 240

ttccaattaa caccaatagc agtccagatg gatccact 278

<210> 26

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccatgggtta atacgactca ctatagggag atgcaactga gggagccttg aatacaccaa 60

aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta caacttcctc 120

aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag cagaggcggc agtcaagcct 180

cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta 240

ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgcggatcca ct 292

<210> 27

<211> 284

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccatgggtta atacgactca ctatagggag acactaattc tttcacacgt ggtgtttatt 60

accctgacaa agttttcaga tcctcagttt tacattcaac tcaggacttg ttcttacctt 120

tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta tacatgtctc tgggaccaat ggtactaaga 180

ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg atggtgttta ttttgcttcc actgagaagt 240

ctaacataat aagaggctgg atttttggta ctactggatc cact 284

<210> 28

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccatgggtta atacgactca ctatagggag agttacttac cccaaaatgc tgttgttaaa 60

atttattgtc cagcatgtca caattcagaa gtaggacctg agcatagtct tgccgaatac 120

cataatgaat ctggcttgaa aaccattctt cgtaagggtg gtcgcactat tgcctttgga 180

ggctgtgtgt tctcttatgt tggttgccat aacaagtgtg cctattgggt tccacgtgct 240

agcgctaaca taggatccac t 261

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

actgggacga catggagaa 19

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tcaccggagt ccatcacg 18

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gttggccttg gggttcaggg ttctacaatg agctgcgtgt 40

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ttgagacctt caacacccca gcgaggcgta cagggatagc a 41

Claims

1.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：

正向引物：SEQ ID No.1；

反向引物：SEQ ID No.2；

正向内引物：SEQ ID No.3；

反向内引物：SEQ ID No.4；

正向环引物：SEQ ID No.5；和

反向环引物：SEQ ID No.6。

2.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：

正向引物：SEQ ID No.7；

反向引物：SEQ ID No.8；

正向内引物：SEQ ID No.9；

反向内引物：SEQ ID No.10；

正向环引物：SEQ ID No.11；和

反向环引物：SEQ ID No.12。

3.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：

正向引物：SEQ ID No.13；

反向引物：SEQ ID No.14；

正向内引物：SEQ ID No.15；

反向内引物：SEQ ID No.16；

正向环引物：SEQ ID No.17；和

反向环引物：SEQ ID No.18。

4.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：

正向引物：SEQ ID No.19；

反向引物：SEQ ID No.20；

正向内引物：SEQ ID No.21；

反向内引物：SEQ ID No.22；

正向环引物：SEQ ID No.23；和

反向环引物：SEQ ID No.24。

5.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，其具有根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸引物组的序列，且其中所述正向内引物序列的5’端带有荧光标记。

6.用于扩增SARS-CoV-2基因的引物组集合，其包括根据权利要求1-5所述的寡核苷酸引物组中的任意两种或两种以上的组合。

7.用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其包括根据权利要求1-5中任一项所述寡核苷酸引物组或根据权利要求6所述的引物组集合。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括的引物组为根据权利要求1所述的引物组和根据权利要求2所述的引物组，且所述引物组分别独立地在其正向内引物序列5’端携带或不携带荧光标记。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶；且所述试剂盒还包括RNA反转录酶、pH指示剂中的至少一种或两者都不包括。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括具有RNA反转录酶和DNA聚合酶双重功能的单个酶。

11.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因扩增反应液、阴性对照、质控品和使用说明书中的任意一种或多种。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为人β-肌动蛋白引物。

13.使用根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸引物组或根据权利要求6所述的引物组集合检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：

获取待测样本；

提取待测样本的RNA作为模板；

对所述RNA进行反转录并使用根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸引物组或根据权利要求6所述的引物组集合对反转录所得DNA进行扩增，或者，使用根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸引物组或根据权利要求6所述的引物组集合对所述RNA进行反转录扩增；和

基于所述扩增结果或反转录扩增结果，确定所述待测样本是否含有SARS-CoV-2。

14.根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸引物组或根据权利要求6所述的引物组集合在制备用于检测SARS-CoV-2的试剂中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，

所述检测SARS-CoV-2包括：

获取待测样本；

提取待测样本的RNA作为模板；

16.用于一步检测核酸的方法，所述方法包括：

获取待测样本，并从所述待测样本采集细胞；

使用适于检测所述核酸的引物，在同一个反应体系中对所述细胞一步实现：细胞裂解；核酸提取；扩增或反转录扩增；和

基于所述扩增结果，确定所述待测样本是否含有所述核酸。