CN115612752A

CN115612752A - 基于环介导的等温扩增检测SARS-CoV-2的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN115612752A
Application number: CN202110796538.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡守锋; 叶学帅; 张孟雅
Original assignee: Nongfuyu Pharmaceutical Hebei Co ltd
Current assignee: Yuetenong Biotechnology Hebei Co ltd
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2023-01-17

Abstract

本发明提供一种基于环介导的等温扩增(LAMP)检测样品中的SARS‑CoV‑2的核酸的方法。本发明还提供用于基于LAMP检测样品中的SARS‑CoV‑2的核酸试剂盒或引物组。

Description

基于环介导的等温扩增检测SARS-CoV-2的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病原体检测领域。具体而言，本发明通过基于环介导的等温扩增检测SARS-CoV-2的核酸，例如N基因。

背景技术

新型冠状病毒2020年1月12日被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”，随后被更名为“SARS-CoV-2”，并被列为对人类危害最严重的病毒之一。SARS-CoV-2在人群中传播主要途径可能是呼吸道飞沫以及接触，是一种主要通过呼吸道传播的RNA病毒，具有极高的传染性及组织损害性，可导致致死性新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。目前，全球感染病例超过1亿例，美国、印度、巴西是感染人数最多的国家，而且全世界报告了越来越多的无症状感染病例。COVID-19在世界范围大流行，成为21世纪影响人类健康的最重大疾病之一。

检测SARS-CoV-2对控制病毒传播是重要的。检测SARS-CoV-2核酸(例如通过PCR扩增检测)是当前主要的检测手段之一。

环介导的等温扩增(LAMP)是新近开发的核酸扩增方法，在等温条件(例如，约 60℃-65℃)温育30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。LAMP技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，同时不依赖复杂的设备，可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于实时荧光定量PCR。并且，LAMP反应时间(15-60分钟) 显著低于PCR(90-120分钟)，并且检测结果可以直接肉眼观测，不依赖于电泳仪和实时荧光定量PCR仪，即使在设备缺乏的实验室也可完成检测。

现有技术中开发了通过LAMP扩增SARS-CoV-2的N基因的检测方法，可以检出 10³拷贝/μL的靶核酸，例如CN111057798A和CN112195275A。但是，仍然需要改进的检测方法，例如，敏感性更高的检测方法。

发明内容

第一方面，提供一种基于环介导的等温扩增(LAMP)检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的方法，包括使所述样品与引物组合接触以制备LAMP反应混合物，和温育所述反应混合物，其中所述引物组合包含选自第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的至少四条引物，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物分别包含SEQ ID NO:1-6 的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述引物组合包含所述第一(SEQ ID NO:1)、第二 (SEQ ID NO:2)、第三(SEQ ID NO:3)、第四(SEQ ID NO:4)、第五(SEQ ID NO:5)和第六(SEQ ID NO:6)引物。

在一些实施方案中，所述反应混合物中第一(SEQ ID NO:1)、第二(SEQ ID NO:2)、第三(SEQ ID NO:3)、第四(SEQ ID NO:4)、第五(SEQ ID NO:5)和第六(SEQ ID NO:6) 引物的浓度比为约1:1:8:8:4:4。

在一些实施方案中，在约61-约69℃，例如约65℃温育所述反应混合物。在一些实施方案中，所述反应混合物温育至少约20分钟，至少约30分钟或至少约40分钟。

在一些实施方案中，所述反应混合物还包含核酸扩增物的指示剂。在一些实施方案中，所述方法还包括使扩增物与所述指示剂接触。在一些实施方案中，所述指示剂是 OTG染料。

在一些实施方案中，所述方法是非诊断方法。在一些实施方案中，所述方法是诊断方法。

第二方面，提供一种引物组合，包含选自第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的至少四条引物，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物分别包含SEQ ID NO: 1-6的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述引物组合包含所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物。

在第三方面，提供一种基于LAMP检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的试剂盒，包含本发明的引物组合。在一些实施方案中，所述试剂盒用于通过本发明第一方面的方法检测样品中的SARS-CoV-2的核酸。

在第四方面，提供本发明的引物组合在制备基于LAMP检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的试剂盒中的用途。在一些实施方案中，所述试剂盒用于通过本发明第一方面的方法检测样品中的SARS-CoV-2。

附图说明

图1显示不同来源的核酸样品的检测结果，按从左至右的顺序，所检测的样品为，第1管：阳性对照，第2管：健康人咽拭子提取DNA，第3管：健康人基因组DNA，第4管：鼻病毒逆转录DNA，第5管：呼吸道合胞病毒逆转录DNA，第6管：腺病毒 DNA，第7管：副流感病毒逆转录DNA，和第8管：阴性对照。

图2显示不同来源的核酸样品LAMP扩增产物的凝胶电泳结果，按从左至右的顺序，所检测的样品为，第1泳道：分子量标记(DL2000)，第2泳道：阳性对照，第3泳道：健康人咽拭子提取DNA，第4泳道：健康人基因组DNA，第5泳道：鼻病毒逆转录 DNA，第6泳道：呼吸道合胞病毒逆转录DNA，第7泳道：腺病毒DNA，第8泳道：副流感病毒逆转录DNA，和第9泳道：阴性对照。

图3显示不同浓度的样品的检测结果，按从左至右的顺序，所检测的样品为，第1管：阳性对照，第2管：浓度为10³拷贝/μL的pUC57-N质粒，第3管：浓度为10²拷贝/μL的pUC57-N质粒，第4管：浓度为10拷贝/μL的pUC57-N质粒，第5管：浓度为1拷贝/μL的pUC57-N质粒，第6管：阴性对照。

发明详述

尽管将结合以下所列举的实施方案描述本发明，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可包括在如权利要求所限定的本发明的范围内的所有替代、修改和等同形式。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料可用于实施本发明。本发明不限于所描述的方法和材料。如果所引用的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。

在本申请上下文中，“约”表示在给定值的±10％、±5％或±1％以内。

一、检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的方法

本发明提供一种基于环介导的等温扩增(LAMP)检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的方法。

在本文中，“环介导的等温扩增”是Notomi等在2000年开发的一种扩增核酸分子方法，其中针对靶核苷酸序列的6个区域设计4-6条特异性引物，在DNA聚合酶存在的条件下等温(例如61-69℃)温育，例如，15-60分钟，从而实现核酸扩增。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA) 和RNA分子(例如mRNA)及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。所述核酸分子可以是单链或双链的。

本领域已知的DNA聚合酶可以用于LAMP。优选地，使用具有链置换活性的DNA 聚合酶进行LAMP。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用经修饰以去除5’→3’外切核酸酶活性的来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)或热坚芽胞杆菌(Bacillus caldotenax，Bca)的DNA聚合酶，例如可商购的Bst DNA聚合酶大片段、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 4.0DNA聚合酶和Bca BEST DNA聚合酶。在一些实施方案中，所述反应混合物中的DNA聚合酶的浓度为0.05-0.5U/μL，例如 0.1U/μL。

在一些实施方案中，本发明的方法包括使所述样品与引物组合接触以制备LAMP反应混合物，和温育所述反应混合物，其中所述引物组合包含选自第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的至少四条引物，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物分别包含SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述引物组合包含所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物。在一些实施方案中，所述反应混合物中第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的浓度比为约1:1:8:8:4:4。在一些实施方案中，所述反应混合物中第一和第二引物的浓度为1μM，所述第三和第四引物的浓度为8μM，且所述第五和第六引物的浓度为4μM。

除了DNA聚合酶和引物以外，LAMP体系(反应混合物)中还包含缓冲剂、镁盐、dNTPs、表面活性剂等。

在一些实施方案中，所述LAMP反应混合物包含Tris-HCl，例如10mM，pH8.8的 TrisHCL。

在一些实施方案中，所述LAMP反应混合物包含MgSO₄，例如，3mM的MgSO₄。

在一些实施方案中，所述LAMP反应混合物包含各0.05μM的dNTPs。

在一些实施方案中，所述LAMP反应混合物包含Trion X-100，例如0.05％的TrionX-100。

在一些实施方案中，所述LAMP反应混合物不包含甜菜碱。

与PCR反应不同，LAMP反应在等温条件下进行，不要求温度控制复杂的扩增仪器。在一些实施方案中，本发明的方法还包括等温温育所述反应混合物，例如，在约61- 约69℃温育所述反应混合物。在一些实施方案中，在约61、约62、约63、约64、约 65、约66、约67、约68或约69℃，优选约65℃温育所述反应混合物。

此外，与PCR反应相比，LAMP反应所需的时间较短。在一些实施方案中，温育所述反应混合物至少约20分钟，至少约30分钟或至少约40分钟。在一些实施方案中，温育所述反应混合物约20-约90分钟、约30-约90分钟或约40-约90分钟。在一些实施方案中，温育所述反应混合物约20-约60分钟、约30-约60分钟或约40-约60分钟。在一些实施方案中，温育所述反应混合物约40分钟。

核酸扩增物可以通过本领域常规方法进行检测。在一些实施方案中，通过凝胶电泳的方法检测核酸扩增物。在一些实施方案中，使扩增物与指示剂接触，以使得核酸扩增物可视化。在一些实施方案中，所述LAMP反应混合物包含核酸扩增物的指示剂。在一些实施方案中，所述指示剂是与双链DNA反应的荧光染料，例如溴乙锭、SYBER GREEN I或Picogreen。在一些实施方案中，所述指示剂是与双链DNA反应的变色染料，例如橙绿变色(OTG)染料。

本发明的方法可以用于诊断或非诊断目的。

在一些实施方案中，本发明的方法用于诊断对象中的SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述样品衍生自所述对象的呼吸道样品或消化道样品。例如，所述样品衍生自咽拭子或肛拭子。

在一些实施方案中，本发明的方法用于检测环境或产品中的SARS-CoV-2污染。在一些实施方案中，所述样品衍生自环境样品、食物样品、产品包装、产品表面、运输设备(如冷链设备)等。

本领域已知，SARS-CoV-2是一种RNA病毒。可以将RNA逆转录为cDNA进行检测。在一些实施方案中，本发明的方法还包括逆转录的步骤。在一些实施方案中，采用逆转录-LAMP(RT-LAMP)进行检测，例如，在LAMP反应混合物中提供逆转录酶活性。在一些实施方案中，通过添加逆转录酶提供所述逆转录酶活性，例如使用DNA聚合酶和逆转录酶的混合酶，如Bst4.0 DNA聚合酶。在一些实施方案中，通过使用具有逆转录活性的DNA聚合酶提供所述逆转录活性，例如Bst3.0 DNA聚合酶。

与现有技术相比，本发明的检测方法可以达到更低的检出限，如低至10拷贝/μL的靶核酸。可见，本发明的检测方法具有比现有技术的方法更高的敏感性。

二、用于检测SARS-CoV-2的产品

本发明还提供一种引物组合，包含选自第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的至少四条引物，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物分别包含SEQ ID NO: 1-6的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述引物组合包含所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物。

本发明还提供一种基于LAMP检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的试剂盒，包含本发明的引物组合。

本发明还提供本发明的引物组合在制备基于LAMP检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，所述引物组合或试剂盒用于通过本发明的方法检测样品中的SARS-CoV-2的核酸。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶。优选地，所述DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶。在一些实施方案中，所述DNA聚合酶是经修饰以去除5’→3’外切核酸酶活性的来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)或热坚芽胞杆菌(Bca)的DNA 聚合酶，例如可商购的Bst DNA聚合酶大片段、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 4.0DNA聚合酶和Bca BEST DNA聚合酶。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于LAMP的其他物质，例如缓冲剂、镁盐、dNTPs和/或表面活性剂等。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含Tris-HCl。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含MgSO₄。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含dNTPs。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含Trion X-100。

本发明的试剂盒的组分以组合物的形式提供。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含组合物，所述组合物包含Tris-HCl、MgSO₄和Trion X-100。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含组合物，所述组合物包含DNA聚合酶、dNTPs和本发明的引物组合。在一些实施方案中，所述组合物作为冷冻干燥的组合物提供。在一些实施方案中，包含 DNA聚合酶的冷冻干燥的组合物还包含冷冻干燥保护剂，例如海藻糖。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物Tris-HCl、MgSO₄和Trion X-100，所述冻干的第二组合物包含DNA聚合酶、海藻糖、dNTPs和本发明的引物组合。在一些实施方案中，所述第一组合物包含Tris HCL(20mM，pH8.8)、MgSO₄(6mM)和Trion X-100(1％)。在一些实施方案中，所述第二组合物包含 DNA聚合酶如Bst4.0 DNA聚合酶(0.4U/μL)、dNTPs(0.2μM)、第一引物(4μM)、第二引物(4μM)、第三引物(32μM)、第四引物(32μM)、第五引物(16μM)、第六引物(16μM)。在在一些实施方案中，所述第二组合物是冻干的组合物，在使用前复水(例如用水溶解)所述第二组合物，复水的第二组合物包含DNA聚合酶如Bst4.0 DNA聚合酶(0.4U/μL)、 dNTPs(0.2μM)、第一引物(4μM)、第二引物(4μM)、第三引物(32μM)、第四引物(32μM)、第五引物(16μM)、第六引物(16μM)和海藻糖(10％)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于复水所述冻干的第二组合物的溶液，例如水，如无菌水、双蒸水、超纯水。在一些实施方案中，以例如2:1:1的体积比将所述第一组合物、所述复水的第二组合物和所述样品混合以制备所述LAMP反应混合物。在一些实施方案中，将10μL第一组合物、 5μL复水的第二组合物和5μL样品混合以制备所述LAMP反应混合物。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测核酸扩增物的检测剂(核酸扩增物的指示剂)。在一些实施方案中，所述指示剂是与双链DNA反应的荧光染料，例如溴乙锭、SYBER GREEN I或Pico green。在一些实施方案中，所述检测剂是与双链DNA 反应的变色染料，如橙绿变色(OTG)染料。在一些实施方案中，所述试剂盒包含OTG染料。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于LAMP的管，在所述管的盖中存在OTG 染料。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一组合物、冻干的第二组合物、用于复水第二组合物的水(如无菌水、双蒸水、超纯水)以及盖中存在OTG染料的管，其中所述第一组合物包含Tris HCL(20mM，pH8.8)、MgSO₄(6mM)和Trion X-100(1％)，其中在使用前所述水复水所述冻干的第二组合物，复水的第二组合物包含DNA聚合酶如Bst4.0 DNA聚合酶(0.4U/μL)、dNTPs(0.2μM)、第一引物(4μM)、第二引物(4μM)、第三引物 (32μM)、第四引物(32μM)、第五引物(16μM)、第六引物(16μM)和海藻糖(10％)，且其中将10μL第一组合物、5μL复水的第二组合物和5μL样品混合以制备所述LAMP反应混合物。

实施例

通过以下实施例，本领域技术人员会更清楚地理解本发明。应理解，实施例只是用于说明，而非限制本发明的范围。如无特别说明，本发明中使用的实验方法均为常规方法，基因克隆操作具体可参见Sambrook,et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd,ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989)。

实施例1、材料与方法

1.1.试剂：

Bst2.0 DNA聚合酶，购自哈尔滨新海基因检测有限公司；

dNTPs，购自北京百奥莱博科技有限公司；

海藻糖，购自深圳乐芙生物科技有限公司；

OTG染料，购自哈尔滨新海基因检测有限公司；

LAMP引物，由金唯智生物科技有限公司合成；

N基因标准阳性对照模板，由金唯智生物科技有限公司合成，并构建到pUC57质粒骨架中，获得阳性对照质粒pUC57-N。

1.2.扩增反应体系

反应混合物包含Tris-HCl，10mM，pH8.8；MgSO₄，3mM；Trion X-100，0.05％(v/v)；Bst 2.0DNA聚合酶，0.1U/μL；dNTPs，各0.05μM；海藻糖，2.5％(w/v)；引物F3和 B3(SEQ IDNO:1和2)，各1μM；引物FIP和BIP(SEQ ID NO:3和4)，各8μM；引物 LoopF和LoopB(SEQ IDNO:5和6)，各4μM；以及待测样品，共20μL。

1.3.病毒

博卡病毒、鼻病毒、人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒来自北京市农林科学院畜牧兽医研究所。

实施例2、确定反应条件

2.1.确定反应时间

将实施例1.2中所描述的反应混合物(包含10⁵拷贝的pUC57-N作为模板)在65℃温育20、30、40、50或60分钟，以不含模板的反应混合物作为阴性对照。

结果显示，温育40、50或60分钟后，模板扩增显示阳性，即反应混合物为绿色，经凝胶电泳，可见梯状条带。

2.2.确定反应温度

将实施例1.2中描述的反应混合物(包含10⁴和10²拷贝的pUC57-N作为模板，以不含模板的反应混合物作为阴性对照)，分别在61℃、63℃、65℃、67℃和69℃温育40 分钟。

结果显示，在上述温度温育的反应混合物都显示阳性扩增结果，而在琼脂糖凝胶电泳检测中，在65℃温育的反应混合物显示最亮的条带。

实施例3、评估检测方法的性能

3.1.检测方法的特异性

将实施例1.2中所描述的反应混合物(分别包含pUC57-N以及来自博卡病毒、鼻病毒、人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的核酸作为模板，以不含模板的反应混合物作为阴性对照)，在65℃温育40分钟。

如图1和2所示，包含pUC57-N的反应混合物成绿色，并且凝胶电泳观察到梯状条带；以其他病毒核酸作为模板的反应混合物均呈橙色，并且凝胶电泳没有观察到扩增产物。分析结果总结于表1。

表1、特异性测试结果

模板	结果
		博卡病毒	阴性
鼻病毒	阴性
		人间质肺病毒	阴性
呼吸道合胞病毒	阴性
		冠状病毒	阴性
腺病毒	阴性
		副流感病毒	阴性
甲型流感病毒	阴性
		乙型流感病毒	阴性
丙型流感病毒	阴性
		pUC57-N	阳性

可见，采用本发明的方法特异性强，不会因为其他病毒的干扰而产生假阳性结果。

3.2.检测方法的敏感性

用ddH₂O将质粒pUC57-N充分溶解并稀释到1×10⁷拷贝/μL，然后进行10^-1-10^-7梯度稀释，分别以梯度稀释的样品作为模板，以实施例1.2描述的反应混合物进行扩增，在65℃温育40分钟。以不含模板的反应混合物作为阴性对照，以实施例2.1中使用的的10⁵拷贝/μL质粒作为阳性对照。

如图3所示，模板起始浓度低至10拷贝/μL的反应混合物温育后呈绿色。具体实验结果总结于表2。

表2、敏感性测试结果

样品稀释倍数(拷贝/μL)	结果
		质粒10<sup>-7</sup>(1x10<sup>0</sup>)	—
质粒10<sup>-6</sup>(1x10<sup>1</sup>)	+
		质粒10<sup>-5</sup>(1x10<sup>2</sup>)	+
质粒10<sup>-4</sup>(1x10<sup>3</sup>)	+
		质粒10<sup>-3</sup>(1x10<sup>4</sup>)	+
质粒10<sup>-2</sup>(1x10<sup>5</sup>)	+
		质粒10<sup>-1</sup>(1x10<sup>6</sup>)	+
质粒10<sup>-0</sup>(1x10<sup>7</sup>)	+
		阳性对照	+
阴性对照	—

以10拷贝/μL的模板起始浓度重复20次检测，反应混合物均呈绿色。

可见，本发明的检测方法可以检测出10拷贝/μL的靶核酸，具有高敏感性。

3.3.检测方法的重复性

3.3.1.以不同批次提取的五个pUC7-N质粒(pUC57-N-1、pUC57-N-2、pUC57-N-3、pUC57-N-4、pUC57-N-5)作为模板。每个质粒4μg溶于ddH₂O，并稀释至1x10³拷贝/μL。

以实施例1.2中所描述的反应混合物进行检测，在65℃温育40分钟，以不含模板的反应混合物作为阴性对照，以实施例2.1中使用的的10⁵拷贝/μL质粒作为阳性对照。重复检测三次，结果示于表3。

表3、重复性测试结果

3.3.2.使用高、低两个浓度水平(分别为10⁵拷贝/μL和10拷贝/μL)的质粒pUC57-N作为模板，以实施例1.2中所描述的反应混合物进行检测，在65℃温育40分钟，以不含模板的反应混合物作为阴性对照。重复测定10次，结果如表4和表5所示。

表4、低浓度模板(10拷贝/μL)

表5、高浓度模板(10⁵拷贝/μL)

检测次数	结果
		1	阳性
2	阳性
		3	阳性
4	阳性
		5	阳性
6	阳性
		7	阳性
8	阳性
		9	阳性
10	阳性

可见，无论是低浓度模板还是高浓度模板，本发明的检测方法在10次检测中均呈现相同的阳性结果，重复性好。

序列

SEQ ID NO:1(引物F3，第一引物)

TCCTGCTAACAATGCTGC

SEQ ID NO:2(引物B3，第二引物)

TCTCAAGCTGGTTCAATCTG

SEQ ID NO:3(引物FIP，第三引物)

AACGAGAAGAGGCTTGACTGCTCAAGGAACAACATTGCCA

SEQ ID NO:4(引物BIP，第四引物)

CTCATCACGTAGTCGCAACAGTATTGCCAGCCATTCTAGC

SEQ ID NO:5(引物LoopF，第五引物)

CCTTCTGCGTAGAAGCCTT

SEQ ID NO:6(引物LoopB，第六引物)

AATTCAACTCCAGGCAGCA

SEQ ID NO:7(SARS-CoV-2的N基因，NCBI登录号NC_045512.2)

ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTC AGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGC CCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAA GACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCA AATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATC TCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGT GCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCA CATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAA CATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCC TCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCC TGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGA ACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAG AAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAA TGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGG AACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGC GCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTT GACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTT TGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGAC TCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTG CTGACTCAACTCAGGCCTAA

SEQUENCE LISTING

<110> 浓孚雨医药河北股份有限公司

<120> 基于环介导的等温扩增检测SARS-CoV-2的方法和试剂盒

<130> I2021TC5519CB

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 1

tcctgctaac aatgctgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

tctcaagctg gttcaatctg 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

aacgagaaga ggcttgactg ctcaaggaac aacattgcca 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

ctcatcacgt agtcgcaaca gtattgccag ccattctagc 40

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

ccttctgcgt agaagcctt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

aattcaactc caggcagca 19

<210> 7

<211> 1260

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 7

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims

1.一种基于环介导的等温扩增(LAMP)检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的方法，包括使所述样品与引物组合接触以制备LAMP反应混合物，和温育所述反应混合物，其中所述引物组合包含选自第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的至少四条引物，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物分别包含SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列。

2.权利要求1的方法，其中所述引物组合包含所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物。

3.权利要求2的方法，其中所述反应混合物中第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的浓度比为约1:1:8:8:4:4。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中在约61-约69℃温育所述反应混合物。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中温育所述反应混合物至少约20分钟，至少约30分钟或至少约40分钟。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述反应混合物还包含核酸扩增的指示剂，或所述方法还包括使扩增物与所述核酸扩增的指示剂接触，例如所述指示剂是OTG染料。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法是非诊断方法。

8.权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法是诊断方法。

9.一种引物组合，包含选自第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的至少四条引物，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物分别包含SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列。

10.权利要求9的引物组合，包含所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物。

11.一种基于LAMP检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的试剂盒，包含权利要求9或10的引物组合。

12.权利要求11的试剂盒，其中所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法检测样品中的SARS-CoV-2的核酸：使所述样品与所述引物组合接触以制备LAMP反应混合物，和温育所述反应混合物。

13.权利要求12的试剂盒，其中所述反应混合物中第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的浓度比为约1:1:8:8:4:4。

14.权利要求11-13任一项的试剂盒，其中在约61-约69℃温育所述反应混合物。

15.权利要求11-14任一项的试剂盒，其中温育所述反应混合物至少约20分钟，至少约30分钟或至少约40分钟。

16.权利要求11-14任一项的试剂盒，还包含核酸扩增的指示剂，例如OTG染料。

17.权利要求9或10的引物组合在制备基于LAMP检测样品中的SARS-CoV-2的核酸的试剂盒中的用途。

18.权利要求17的用途，其中所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法检测样品中的SARS-CoV-2：使所述样品与所述引物组合接触以制备LAMP反应混合物，和温育所述反应混合物。

19.权利要求17或18的用途，其中所述反应混合物中所述第一、第二、第三、第四、第五和第六引物的浓度比为1:1:8:8:4:4。

20.权利要求17-19任一项的用途，其中在约61-约69℃温育所述反应混合物。

21.权利要求17-20任一项的用途，其中温育所述反应混合物至少约20分钟，至少约30分钟或至少约40分钟。

22.权利要求17-21任一项的用途，其中所述试剂盒还包含核酸扩增的指示剂，例如OTG染料。