CN104232795A - 柑桔黄脉病毒的实时荧光定量rt-pcr 检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种利用实时荧光定量RT-PCR法对柑桔黄脉病毒（CYVCV）进行检测的引物、试剂盒及检测方法等。本发明针对柑桔黄脉病毒（CYVCV）的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物序列如SEQIDNO：1-2所示。本发明的试剂盒和引物，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，本发明的实时荧光定量PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍，可用于柑桔黄脉病毒（CYVCV）的田间早期快速诊断及定量检测。

Description

柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR 检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种针对柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。 

背景技术

柑桔黄脉病(Citrus yellow vein clearing disease,CYVCD)，也称柠檬黄脉病(Yellow vein clearing of Lemon)，是由柑桔黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的。该病是Bové(1989)在巴基斯坦调查发现后命名的，Loconsole等(2012)通过深度测序技术，获得了柑桔黄脉病毒的全基因组，该病毒由7529个(GenBank Accession No.JX040635)核苷酸的正义RNA链组成，它是威胁柠檬生产的重要病害之一。主要症状表现为叶片侧脉及侧脉附近脉明、黄化，对光看更为明显，叶背可见侧脉处水浸状，部分叶片皱缩、反卷或船形叶，嫩叶症状表现明显，到老叶症状也不消失。主要导致光合作用降低、树势减弱、减产20％左右。柠檬黄脉病目前主要发生在印度、巴基斯坦、土耳其等国家。 

到目前为止，世界上对该病害的研究较少，大都停留在生物学特性研究方面，近年在我国云南瑞丽、重庆、江西、四川安岳等地柠檬上也发生类似症状，是我国柑桔上的新发病害。本人近几年研究结果表明该病害具有嫁接传染性，对所有柠檬、酸橙品种都具有嫁接传染性并具典型症状，对甜橙、宽皮柑桔也具有侵染性，但症状不明显；能侵染辣椒和豇豆；柑桔黄脉病最适宜发病温度为18～24℃，柑桔黄脉病病毒微粒为13～15×400～1000nm联合丝状，通过热处理结合茎尖嫁接脱毒方法能有效脱除该病毒。这些研究结果与国外研究报道的相关结果相同。 

柑桔黄脉病毒对我国柑桔，尤其是柠檬的生产造成了极其严重的损失。目前还缺乏对该病有效的防治方法，使用无病毒苗木是防治柑桔黄脉病唯一有效的方法。为保证种苗安全，必须对采穗母树和砧木进行定期监测，并及时清除田间病树，因此要求具备快速、灵敏的检测技术体系。 

当前在检测CYVCV时主要采用指示植物鉴定的方法，该方法的检测周期较长，无法 满足生长上大量、快速检测的需要。近年来，发明人创建的RT-PCR检测体系虽可对CYVCV进行快速检测，但无法对植株中CYVCV的含量进行定量分析，并且在植株发病早期，当病毒含量较低时可能无法对该病进行有效检测。为此，需要建立更为灵敏的实时RT-PCR检测体系。目前还没有运用实时RT-PCR检测CYVCV的报道。 

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足，提供一种利用实时荧光定量RT-PCR法对柑桔黄脉病毒(CYVCV)进行检测的引物、试剂盒及检测方法等，可用于柑桔黄脉病毒(CYVCV)的田间早期快速诊断及定量检测。 

本发明首先公开了一种针对柑桔黄脉病毒(CYVCV)的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物，所述引物组成如下： 

上述针对柑桔黄脉病毒(CYVCV)的实时荧光定量RT-PCR检测用引物具体包括CYVCV上下游引物，用于扩增柑桔黄脉病毒(CYVCV)。 

本发明第二方面公开了一种柑桔黄脉病毒(CYVCV)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。 

进一步的，所述试剂盒包括柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液中含有前述的引物，所述PCR扩增反应液能和该对引物的靶序列结合，产生高度灵敏、特异性高的检测信号。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和H₂O。 

所述PCR扩增反应液中，引物、GoTaq qPCR Master Mix及H₂O均为常见组分，其含量亦为常规。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的终浓度分别为50～500nM/L和50～500nM/L。 

更优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的终浓度分别为200nM/L和200nM/L。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包括： 

柑桔黄脉病毒上游引物：10uM、0.5μL； 

柑桔黄脉病毒下游引物：10uM、0.4μL； 

GoTaq qPCR Master Mix：10ug/ul、12.5μl； 

CXR Refernce Dye(Promega)：30uM、0.25μL； 

ddH₂O：6.25μL。 

一般地，GoTaq qPCR Master Mix和CXR Refernce Dye均可经市售途径购买获得。 

较优的，所述实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒中还包括阴性对照品(DEPC-H₂O)、阳性对照品中的至少一种。 

本发明所述阳性对照品包括含有SEQ ID NO：3所示CYVCV目的扩增片段的质粒。 

并且，CYVCV目的扩增片段的序列为： 

5’-TCCAACTCACAAACCCAGTGCCCCGAACTCTCTCATGTCTACCAACGACAACAAGGGCAAACAACCACTTCACCCGACACCTCCGGGCCCTAACGACACGACCCCGAAACCTATCCCCGTGCCCACTCCCTCAGCTACACCCACAGCTGCAGGTAAGGAAAACCAAGAGCCCAT-3’(SEQID NO：3)。 

较优的，本发明柑桔黄脉病毒(CYVCV)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒所采用的PCR检测体系如下： 

柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液     20μL 

待测品                        5μL 

反应总体系为                  25μL。 

PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物及染料配置获得。 

较优的，本发明试剂盒的PCR检测体系中，所述待测品为样本核酸提取液反转录产物、阳性对照品或阴性对照品(DEPC-H₂O)。 

本发明的阳性对照品中，CYVCV质粒可以单独包装。 

进一步的，所述试剂盒还包括反转录体系，所述反转录体系中包括柑桔黄脉病毒下游引物。 

所述反转录体系中，引物、dNTPs、RT buffer、RNAsin、RTase以及H₂O均为常见组分，其含量亦为常规。 

较优的，所述反转录体系中，柑桔黄脉病毒下游引物的终浓度为50～500nM/L，更优为200nM/L。 

较优的，所述反转录体系包括： 

反转录体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用反转录体系加入引物配置获得。 

本发明样本核酸提取液的制备方法可参考现有病毒RNA提取技术，具体可采用下述方法具体制备：选取15～30mg样本，装于无菌eppendorf管，加入液氮研磨。加入RNAiso Plus1mL，盖紧离心管盖，涡旋，室温静置5min；12000g 4℃离心5min，上清液转至新的1.5mL的离心管中；加入200μL氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12000g4℃离心15min；上清液转至新的离心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置10min，12000g4℃离心10min；用与RNAiso Plus等量的75％乙醇清洗沉淀，7500g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀，放在通风橱干燥5min，溶解于30-50μLDEPC处理水中，即获得样本核酸提取液。 

反转录产物可通过如下方法获得：ddH₂O 0.75μL，100mM dNTP0.4μL，5×RT buffer 1μL， (40U/μL)RNAsin抑制剂0.125μL，RT酶(200U/μL)0.125μL，10uM YSS-R 0.1μL。运行程序：42℃20min，94℃1min。 

制备本发明所述样本核酸提取液的样本来自表现CYVCV典型症状的叶片。 

本发明试剂盒的PCR扩增程序为：95℃预变性2min。95℃变性10s，退火和延伸合并为一步即：60℃30s，40个循环；60℃时采集荧光。反应体系为25ul。 

选用仪器为BioRad iQ型实时PCR仪。荧光通道检测选择通道1(最大激发波长497nm，最大发射波长520nm)。 

使用前述引物或试剂盒对柑桔黄脉病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，包括以下步骤： 

1)制备植物样本核酸提取液； 

2)加入反转录体系，制备植物样本核酸提取液反转录产物； 

3)加样：将柑桔黄脉病毒PCR反应液置于PCR管中，将植物样本核酸提取液反转录产物、阳性对照品或阴性对照品分别加入装有检测液的不同PCR管，获得对应的样本反应管、阳性反应管和阴性对照反应管； 

4)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增； 

5)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚 

好超过DEPC-H₂O的最高点，荧光通道检测选择通道1(最大激发波长497nm，最大发射波长520nm)。 

较优的，步骤2)中，所述反转录体系中包括柑桔黄脉病毒下游引物。柑桔黄脉病毒下游引物的终浓度为50～500nM/L，更优为200nM/L。 

较优的，所述反转录体系包括： 

较优的，步骤3)中，所述PCR扩增反应液中含有前述的引物，所述PCR扩增反应液能和该对引物的靶序列结合，产生高度灵敏、特异性高的检测信号。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和H₂O。 

所述PCR扩增反应液中，引物、GoTaq qPCR Master Mix及H₂O均为常见组分，其含量亦为常规。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的终浓度分别为50～500nM/L和50～500nM/L。 

更优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的终浓度分别为200nM/L和200nM/L。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包括： 

柑桔黄脉病毒上游引物：10uM、0.5μL； 

柑桔黄脉病毒下游引物：10uM、0.4μL； 

GoTaq qPCR Master Mix：10ug/ul、12.5μl； 

CXR Refernce Dye(Promega)：30uM、0.25μL； 

ddH₂O：6.25μL。 

试剂盒质量控制：试剂盒各对照品须达到以下表1中的要求，否则实验视为无效。 

表1 试剂盒质量标准 

样本核酸提取液反转录产物结果的判断标准如表2所示： 

表2 检测结果判断标准 

如待检样本Ct值在33～35之间，需重复测定，如仍在33-35之间，则判为低于检测限，报告为阴性。 

本发明最后公开了前述针对柑桔黄脉病毒(CYVCV)的实时荧光PCR检测用引物及前述柑桔黄脉病毒(CYVCV)实时荧光PCR检测试剂盒在制备柑桔黄脉病毒(CYVCV)检测试剂或诊断试剂中的应用。 

本发明的有益效果如下： 

(1)本发明涉及了一对PCR引物用于特异性扩增柑桔黄脉病毒(CYVCV)基因序列，该对PCR引物具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点。特异性引物的设计保证了引物的高度保守和特异性，避免了交叉扩增的情况。 

(2)本发明的实时荧光定量PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍，适用于CYVCV的实时RT-PCR检测。 

(3)本发明的试剂盒及检测方法采用了更为灵敏的实时荧光RT-PCR检测体系，不仅可对CYVCV进行快速检测，还可以对植株中CYVCV的含量进行定量分析，并且在植株发病早期，当病毒含量较低时也可以对该病进行有效检测。 

附图说明

图1：目的基因扩增：阳性对照(即从表现典型黄脉症状的植株中提取的总核酸进扩增后的产物，1-7)都有特异的条带，且无引物二聚体和其他非特异扩增，片段长度为174bp，而阴性对照(即从健康无典型黄脉症状的植株中提取的总核酸进行扩增后的产物，8)和水对照即以DEPC水代替总核酸进行扩增后的产物，9)均无扩增 

图2：引物浓度为200nM时的融解曲线图 

图3：退火温度为60℃时的扩增曲线图 

图4：60℃退火温度下的标准曲线图 

图5：样本扩增曲线图 

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。 

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。 

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。 

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。 

实施例1柑桔黄脉病毒(CYVCV)实时荧光定量RT-PCR检测引物的设计和合成 

根据Loconsole报道的CYVCV基因组外壳蛋白序列，设计多个RT-PCR引物，通过实验筛选出具有稳定特异性的引物YSS-F、YSS-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性。所述引物由北京华大生物公司合成，引物的详细信息如下表所示。 

实施例2柑桔黄脉病毒(CYVCV)目的基因的扩增与鉴定 

柑桔黄脉病毒(CYVCV)模板的获取： 

(1)取样、研磨： 

由于CYVCV症状主要表现春季和秋季的叶片上，尤其在嫩叶上，故采样嫩叶叶脉及附近组织10-15mg装于无菌eppendorf管，液氮研磨； 

(2)加入RNAiso Plus 1ml，盖紧离心管盖，涡旋，室温静置5min；12000g 4℃离心5min，上清液转至新的1.5ml的离心管中；加入200μL氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12000g4℃离心15min；上清液转至新的离心管中，加入0.5-1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置10min，12000g4℃离心10min；用与RNAiso Plus等量的75％乙醇清洗沉淀，7500g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀，放在通风橱干燥5min,溶解于30-50μLDEPC处理水中备用。可放入冰中再放入-20℃保存。 

采用PCR法对上述获得的柑桔黄脉病毒(CYVCV)模板的核酸进行扩增，所用引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，获得含柑桔黄脉病毒(CYVCV)目的基因扩增序列(SEQ ID NO：3)的核酸片段，具体序列为： 

5’-TCCAACTCACAAACCCAGTGCCCCGAACTCTCTCATGTCTACCAACGACAACA AGGGCAAACAACCACTTCACCCGACACCTCCGGGCCCTAACGACACGACCCCGAAACCTATCCCCGTGCCCACTCCCTCAGCTACACCCACAGCTGCAGGTAAGGAAAACCAAGAGCCCAT-3’。 

PCR具体方法为： 

(1)解链：取柑桔黄脉病毒(CYVCV)模板1ul，ddH2O1μL，94℃3min解链； 

(2)反转录：5μL反转录(RT)体系为：分装2.5μL：ddH₂O 0.75μL，dNTP0.4μL，5×RTbuffer 1μL，RNAsin抑制剂0.125μL，RT酶0.125μL，YSS-R 0.1μL。运行程序：42℃20min，94℃1min； 

(3)RT-PCR：分装20μL：ddH₂O 15.4μL，25μmoLMgCL₂1.0μL，10×RT buffer 1.5μL，YSS-F 1.0μL，YSS-R 0.9μL，rTaq 0.2μL。运行程序：94℃预变性2min；94℃变性15s,48℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min。 

取50μL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经电泳、切胶回收纯化后与PMD19-T载体连接，转化pMD-19T,接种于含有AMP的LB平板，37℃过夜，挑取单菌落白斑接种于含AMP的LA培养基，37℃震荡过夜。采用菌液PCR的方法来鉴定是否有插入片段。将阳性菌液送大连宝生物公司进行测序。 

从图1中可以看出，阳性对照(即从表现典型黄脉症状的植株中提取的总核酸进扩增后的产物，1-7)都有特异的条带，且无引物二聚体和其他非特异扩增，片段长度为174bp，而阴性对照(即从健康无典型黄脉症状的植株中提取的总核酸进行扩增后的产物，8)和水对照即以DEPC水代替总核酸进行扩增后的产物，9)均无扩增。序列测序后，在NCBI经Blast分析，与CYVCV序列同源性最高达100％，由此确定，柑桔黄脉病毒(CYVCV)目的基因扩增片段的正确性。 

实施例3柑桔黄脉病毒(CYVCV)质粒的提取与纯化 

选取实施例2中PCR检测为阳性的菌液，采用OMEGA纯化试剂盒进行质粒纯化：10000g离心1min，倒掉上清，留沉淀；加入250μL SolutionⅠ,涡旋10s；加入250μLSolutionⅡ，上下轻轻颠倒混匀，再静置2min；加入350μLSolutionⅢ,上下轻轻颠倒，13000g离心10min；上清过柱后，分别用500uL Buffer HB和700μL DNA wash Buffer，进行离心清洗，然后13000g离心2min；最后向滤柱中加入30μL Elution Buffer，静置1min；13000g离心1min，将离心管中产物(即为纯化后的CYVCV质粒)放入-20℃冰箱保存备用。 

实施例4柑桔黄脉病毒(CYVCV)标准cRNA的制备 

将2μL实施例3中所得CYVCV质粒DNA，与0.2μL 50U/μL限制性内切酶Spe I，1.5μL缓冲液(10mM Bis-Tris-Propane-HCL，10mM MgCL2，1mM DTT)，11.3μL无菌水混合，37℃下酶切1h。产物用T7体外转录试剂盒(TOYOBO)根据说明进行体外转录，并用RNase-Free Dnase I(Promega)对cRNA进行纯化。纯化后的cRNA用分光光度计(SmartSpecTMplus(Bio-Rad)进行测定cRNA浓度：所得cRNA浓度一般大于900ng/μL，A260/A280一般在1.95～2.00之间，可作为标准品，并用下列公式计算： 

其中：MW＝RNA碱基数(bp)×330dalton/bp经计算得cRNA拷贝数为9.0×10¹²拷贝/μL制备1×10⁹拷贝/μL溶液作为标准品与原液，贮存于-80℃。 

实施例5实时荧光定量RT-PCR条件的优化及体系的确定 

1.引物浓度的确定 

以1×10⁵拷贝/μL的实施例4中所得的cRNA作为模板，设定50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM的引物浓度梯度，进行引物浓度优化，通过分析荧光扩增曲线的形态、比较荧光强度高低及Ct值的大小，以确定最佳引物浓度。如图2所示，通过观察荧光信号的变化可看出各个不同的引物浓度对扩增曲线的影响不是很大，但是当引物浓度为200nM时，荧光扩增曲线最平滑，荧光值最高，呈典型“S”型形状，平行管测定其重复性较好，且其Ct值也比其他组要小，说明其扩增效率及检测灵敏度比其它组高，同时其融解曲线只有单一的峰，无非特异性扩增。 

2.退火温度的优化 

以1.0×10⁹拷贝/μL到1.0×10²拷贝/μL的cRNA作为模板，引物终浓度为200nM，选取62℃到52℃的8个不同退火温度进行实时荧光定量PCR反应，通过观察不同退火温度下PCR的扩增效率看出该基因对62℃到52℃之间的温度变化不敏感，荧光信号均有增加，但是在60℃时PCR扩增效率最好，且其融解曲线如图3所示，只有一个单峰，因此确定60℃为该体系的最佳退火温度。 

3.标准曲线的建立 

将计算好拷贝数的实施例4中所得cRNA用TAKARA的EASY Dilution(D9160A)以10倍梯度稀释的9.0×10²拷贝/μL到9.0×10⁹拷贝/μL为模板，使用建立的实施例6中的检测体系进行反转录后，在最优的反应条件下进行定量RT-PCR，每一浓度设定3个重复，同时设定空白对照(以DEPC水代替检测样品)、阳性对照(从表现典型黄脉症状的植株中提取的总核酸)和阴性对照(从健康植株中提取的总核酸)，制作标准曲线。如图4所示，结果表明扩增效率达102.0，相关性为0.999，表明该体系可以准确检测CYVCV。 

实施例6柑桔黄脉病毒(CYVCV)检测体系的确定 

经大量实验摸索，最终证实，最优的反转录体系和实时荧光定量RT-PCR反应体系如下： 

(1)反转录体系(5μL)为：ddH₂O 0.75μL，100μM dNTP 0.4μL，5×RT buffer 1μL，2U RNAsin(40U/μL)，1U RTase(200U/μL)，模板0.5μL，10uM YSS-R 0.1μL。反转录程序为：42℃反转录20min，95℃变性1min。 

(2)实时荧光定量RT-PCR反应体系(25μL)：5μL反转录产物，GoTaq qPCR Master Mix12.5μL；10uM YSS-F 0.5μL，10uM YSS-R 0.4μL，ddH₂O 6.25μL，CXR Refernce Dye(Promega)0.25μL。 

扩增程序为：95℃预变性2min。95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。扩增后采集融解曲线程序：95℃变性15s后，从60℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设阴性对照(从健康植株中提取的总核酸)和空白对照(以DEPC水代替检测样品)。 

实施例7柑桔黄脉病毒(CYVCV)PCR反应液和反转录体系的制备 

将柑桔黄脉病毒上游引物：10uM、0.5μL；柑桔黄脉病毒下游引物：10uM、0.4μL；GoTaq qPCR Master Mix：10ug/ul、12.5μl；CXR Refernce Dye(Promega)：30uM、0.25μL；ddH₂O：6.25μL混匀即为柑桔黄脉病毒(CYVCV)PCR反应液。制备的所述柑桔黄脉病毒(CYVCV)PCR反应液中，CYVCV上游引物、CYVCV下游引物的终浓度分别为200nM/L和160nM/L。 

将柑桔黄脉病毒下游引物：10uM、0.1μL；dNTPs：100mM、0.4μL；5×RT buffer1μL；RNAsin：40U/μL 0.125μL；RTase：200U/μL 0.125μL；ddH₂O 0.75μL混匀，即得反转录体系。制备的所述反转录体系中，CYVCV下游引物的终浓度分别为200nM/L。 

实施例8柑桔黄脉病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的灵敏度和重复性分析 

1.实时荧光定量RT-PCR灵敏性试验 

对已知浓度的cRNA进行10倍梯度稀释得到1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10拷贝/μL等10个样品作为模板分别进行实时定量PCR反应和普通PCR反应。 

灵敏性测试结果：实时荧光定量PCR可检测出上述所有10浓度的样品，而常规RT-PCR只能检测到1×10³拷贝/μL的cRNA，这表明本发明的实时荧光定量PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍。 

2.重复性测试 

包括批内和批间重复性测试，批内重复性测试是一次对浓度高低不同(1×10⁸拷贝/μL和1×10⁴拷贝/μL)的标准品cRNA重复测定6次，通过测得的标准差进而计算最大变异系数(CV值)；批间重复性测试是连续6天对同一标准品(1×10⁸拷贝/μLcRNA)进行检测并计算CV值。 

重复性检测结果：组内重复的CV值为0.47％，说明该方法具有较好组内重复性。组间重复的CV值为3.71％，表面该方法具有较好的组间重复性，可同时或分批对样品进行稳定准确的定量检测(表3)。 

表3 重复性试验结果 

实施例9柑桔黄脉病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用验证 

1、实验方法 

1)样本来源： 

对29例从重庆、四川、云南等地采集的柑桔样品进行柑桔黄脉病毒核酸检测。这29例样本编号1-29，其中1-26号样本经指示植物鉴定确认为柑桔黄脉病毒；27-29号样本为柑桔黄脉病毒阴性，30号为水对照。 

2)样本处理： 

核酸提取： 

选取15～30mg样本，装于无菌eppendorf管，加入液氮研磨。加入RNAiso Plus 1mL，盖紧离心管盖，涡旋，室温静置5min；12000g 4℃离心5min，上清液转至新的1.5mL的离心管中；加入200μL氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12000g4℃离心15min；上清液转至新的离心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置10min，12000g4℃离心10min；用与RNAiso Plus等量的75％乙醇清洗沉淀，7500g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀，放在通风橱干燥5min，溶解于30-50μLDEPC处理水中，即获得样本核酸提取液。 

反转录： 

ddH₂O 0.75μL，dNTP0.4μL，5×RT buffer 1μL，RNAsin抑制剂0.125μL，RT酶0.125μL，YSS-R0.1μL。运行程序：42℃20min，94℃1min。 

3)试剂配制： 

取n×20μL柑桔黄脉病毒(CYVCV)PCR反应液(n为反应管数)，振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。 

4)加样： 

取上述各检测液体20ul置于PCR管中，然后将1-30号样本反转录产物各5ul分别加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。 

5)PCR扩增： 

反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置： 

95℃预变性2min。95℃变性10s，退火和延伸合并为一步即60℃30s，40个循环；60℃时采集荧光。反应体系为25ul。 

每个样品重复3次，并设立正负对照(正对照：从表现典型黄脉症状的植株中提取的总核酸；负对照：从健康植株中提取的总核酸)。 

荧光通道检测选择通道1(最大激发波长497nm，最大发射波长520nm6)阈值设定： 

阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H₂O的最高点。 

2、试验结果： 

样本扩增曲线图如图5所示，结果显示，田间植株感染CYVCV后检测样本(1-26号)的Ct值为14.79-24.15；实时RT-PCR的检测结果与随后进行的指示植物鉴定完全一致。并且普通RT-PCR不能检测出其中少数未表现症状样品中携带的CYVCV，而本发明的实时RT-PCR则能够检测出。因此，本发明的实时RT-PCR的检测方法灵敏度高于普通RT-PCR。可见，本发明的引物以及试剂盒可用于柑桔黄脉病毒的鉴定和定量检测。 

Claims (14)

1.一种针对柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物，其特征在于，所述引物的组成为：

柑桔黄脉病毒上游引物的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

柑桔黄脉病毒下游引物的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种柑桔黄脉病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中，柑桔黄脉病毒上游引物和下游引物的终浓度分别为50～500nM/L和50～500nM/L。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和H₂O。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包括：

柑桔黄脉病毒上游引物：10mM、0.5μL；

柑桔黄脉病毒下游引物：10mM、0.4μL；

GoTaq qPCR Master Mix：10ug/ul、12.5μl；

CXR Refernce Dye：30uM、0.25μL；

ddH₂O：6.25μL。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括反转录体系，所述反转录体系中包括柑桔黄脉病毒下游引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系中，柑桔黄脉病毒下游引物的终浓度为50～500nM/L。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系包括：

9.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括含有SEQ ID NO：3所示目的扩增序列的柑桔黄脉病毒质粒；所述阴性对照为DEPC-H₂O。

11.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所采用的PCR检测体系如下：

柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液     20μL

待测品                        5μL

反应总体系为                  25μL。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述待测品为样本核酸提取液反转录产物、阳性对照品或阴性对照品。

13.一种使用如权利要求1所述的引物或权利要求2-9任一权利要求所述试剂盒对柑桔黄脉病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，步骤如下：

1)制备植物样本核酸提取液；

2)制备植物样本核酸提取液反转录产物；

3)加样：将柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液置于PCR管中，将植物样本核酸提取液反转录产物、阳性对照品或阴性对照品分别加入装有检测液的不同PCR管，获得对应的样本反应管、阳性反应管和阴性对照反应管；

4)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

5)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H₂O的最高点。

14.根据权利要求1所述的引物或权利要求2-9任一权利要求所述试剂盒在制备柑桔黄脉病毒检测试剂或诊断试剂中的应用。