CN104164517B

CN104164517B - 苹果潜隐病毒和类病毒的多重rt-pcr检测方法

Info

Publication number: CN104164517B
Application number: CN201410347974.7A
Authority: CN
Inventors: 周涛; 郝璐; 陈善义; 范在丰; 国立耘; 叶婷
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2034-07-21
Also published as: CN104164517A

Abstract

本发明提供一种可同时检测苹果树叶片、枝条、花和果实是否携带3种潜隐病毒(苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒)和苹果锈果类病毒属3种类病毒(苹果锈果类病毒、苹果凹果类病毒、苹果皱果类病毒)的多重RT-PCR检测方法。利用该方法进行检测，具有检测结果易于判别、操作简便、反应快速、灵敏度高等优势，克服了现有技术中耗时、步骤繁琐、条带不易区分、灵敏度低等缺点，为苹果病毒病的检测提供了一种便于推广应用的快速检测方法。

Description

苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法

技术领域

本发明涉及植物保护领域及分子生物学检测领域，具体地说，涉及苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法。

背景技术

在苹果栽培生产过程中，病毒病害一直是严重影响果品产量和品质的主要因素之一。苹果树被病毒侵染后，终生带毒，病毒在树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退，产量下降，品质变劣，不耐贮藏，给我国的苹果生产造成了严重的经济损失。目前，我国已发现和鉴定的病毒主要包括：苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)、苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)、苹果锈果类病毒(Applescarskinviroid,ASSVd)、苹果凹果类病毒(Appledimplefruitviroid,ADFVd)。前3种(ACLSV、ASGV、ASPV)为潜隐性病毒，侵染苹果树不引起明显症状，但导致树势衰弱，果实产量和品质严重下降；后2种(ASSVd和ADFVd)为类病毒，同为苹果锈果类病毒属(Apscarviroid)成员，在果实上表现锈果、花脸、凹陷等症状，严重降低果实经济价值，甚至完全丧失经济价值。ADFVd是于2013年在我国首次发现并报道的危险性类病毒，在我国苹果主产区山东和新疆局部发生，但有快速蔓延趋势。此外，日本学者报道了苹果皱果类病毒(AFCVd)的发生和危害，尽管AFCVd还未在我国发现，因其危害严重，有必要进行监测。

与其他病害相比，苹果病毒病的发生与危害有几大明显特点，一是多数为潜隐性发生，难以通过观察症状判断是否有病毒；二是类病毒对苹果果实危害严重，在枝条和幼树上无任何症状，经3～5年生长到了结果期，果实发病，果农损失惨重，所以育苗和生产中对苹果锈果类病毒属的3种类病毒应为零容忍；三是一旦被侵染，果树将终生带毒，受到长期且持续的危害；四是目前没有有效的药剂防治，特别是类病毒病发生后，应将病树刨除。这些特点给病害的诊断和控制造成了困难，在苹果嫁接生产过程中不能轻易分辨健康苗和带毒苗，容易造成带毒苗的乱用，使得后续病害大范围快速扩散。为此，亟待开发一种简单、快速、灵敏的检测方法用于检测苹果树和果实是否携带病毒和类病毒。

目前常见的检测病毒的方法有2种，一是以ELISA为主的血清学检测方法，因该方法灵敏度低，果树病毒含量低，该方法不适合苹果病毒的检测；二是常规PCR方法，由于侵染苹果的病毒种类多，需对每种病毒进行PCR检测，操作繁琐，耗时长，花费高。近些年逐渐发展起来的多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction)，由于可以在一个反应管中同时扩增多个序列，大大缩短了检测时间，实现了对多种病毒的同步检测，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。相比常规PCR，多重PCR效率高，系统性强，节省了检测成本与检测时间，在果树病害的检测中多有报道，但没有关于同时检测3种潜隐病毒与苹果锈果类病毒属3种类病毒的相关文献和专利。

发明内容

本发明的目的是提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合。

本发明的另一目的是提供含有上述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。

本发明的再一目的是提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法。

为了实现本发明目的，首先参考现有文献与GenBank中已报道的序列，筛选和设计多重RT-PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于我国现有已确定的苹果所有潜隐病毒与类病毒，可特异地获得目标片段，且各目标片段可以用琼脂糖凝胶电泳清晰、明确地区分开。由于类病毒基因组较小(仅约330nt)，ASSVd、ADFVd、AFCVd同属Apscarviroid，且苹果栽培生产中，仅一种类病毒存在即引起严重危害，实际生产中不允许任一种类病毒存在，因此根据苹果锈果类病毒属3种类病毒设计通用引物检测3种类病毒。

本发明的苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)的引物对I：

ACLSV-F5′-GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3′

ACLSV-R5′-AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3′

其中，N为A或G，M为A或C；

用于特异性RT-PCR检测苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)的引物对II：

ASGV-F5′-TGGAAACCGAGGATGGACAG-3′

ASGV-R5′-CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3′；

用于特异性RT-PCR检测苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)的引物对III：

ASPV-F5′-GAAGTAATCGCATCATTCAC-3′

ASPV-R5′-GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3′；以及

用于特异性RT-PCR检测苹果锈果类病毒属(Apscarviroid)3种类病毒：苹果锈果类病毒(Applescarskinviroid)、苹果凹果类病毒(Appledimplefruitviroid)和苹果皱果类病毒(AFCVd)的通用引物对IV：

apscarviroids-F5′-AGACCCTTCGTCGACGACGA-3′

apscarviroids-R5′-TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3′。

为了减少假阳性的产生，加入了更加特异的EF-1α作为内标基因。因此，所述引物组合中还包括用于特异性RT-PCR检测内参基因ER-1α的引物对V：

ER-1α-F5′-TCATCATGAACCACCCCG-3′

ER-1α-R5′-CCTGTCCAGAACCCAATTC-3′。

本发明还提供含有上述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。

所述试剂盒还包括反转录酶、RNase抑制剂、DNaseⅠ、DEPC水、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述试剂盒在多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒中的应用。

本发明进一步提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，利用上述引物组合进行特异性PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。若794bp处有条带表明ACLSV为阳性，若666bp处有条带表明ASGV为阳性，若346bp处有条带表明ASPV为阳性，若220bp处有条带表明apscarviroids为阳性。

前述的方法，步骤1)具体为：提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品RNA3.5μL、10μM随机引物0.5μL、10μMOligodT0.5μL、5×M-MLV酶缓冲液4.0μL、10mMdNTPs1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL、200U/μLM-MLV反转录酶0.5μL，加DEPCddH₂O至总体积20μL，于42℃反应1h，即得第一条cDNA链。

其中，所述随机引物为5′-d(NNNNNN)-3′，N为A、G、C或T。

步骤2)中进行PCR扩增使用的PCR反应体系以25μl计为：

PCR反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，53℃45秒，68℃2分钟，共35个循环；72℃10分钟。

为了使所建立的多重RT-PCR技术有更广泛的适用性，根据潜隐病毒与类病毒在苹果植株内的分布特点，确定叶片、枝条韧皮部、花与果实都可以作为取样部位。其中，叶片与花可以用来直接研磨提取植物总RNA，枝条则需要用刀片削取韧皮部来研磨，果实需要削取果皮部分。

本发明针对在我国已发现和鉴定的3种苹果潜隐病毒和在生产上引起严重危害的苹果锈果类病毒属3种类病毒，首先根据文献和GenBank中已报道的序列筛选和设计多重RT-PCR引物，通过实验筛选、优化、最终确定最优的引物组合，使得各病毒的条带容易区分；考虑到苹果生产上不允许一种类病毒存在，任何一种类病毒均可引起苹果严重损失，也为了减少引物间的干扰，将苹果锈果类病毒属3种类病毒的检测用通用引物进行，既满足了检测需求，又增加了特异性和灵敏度；同时为了减少假阳性的产生，加入了更加特异的EF-1α作为内标基因。

为了使所建立的多重RT-PCR技术有更广泛的适用性，根据潜隐病毒与类病毒在苹果植株内的分布特点，确定叶片、枝条、花、果实都可以作为取样部位。接着在常规RT-PCR的基础上，确定了多重RT-PCR的体系，通过实验优化了多重RT-PCR条件，确定了最佳引物浓度、最佳退火温度、最佳循环数等参数。然后以质粒为模板模仿了病毒与类病毒在田间侵染的情况，证明了体系的可操作性。最后采用田间样品实验，与常规RT-PCR结果进行比较，验证了多重RT-PCR方法检测3种潜隐病毒和苹果锈果类病毒属3种类病毒的可靠性和实用性。利用该方法进行检测，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、检测结果易于判别等优势，克服了传统技术中耗时、步骤繁琐等缺点，为苹果病毒病的检测提供了一种便于推广应用的快速检测方法。

本发明的优点在于：

(一)涵盖了我国现已发生的所有潜隐病毒与类病毒，适用性广；

(二)筛选与设计的引物特异性强，灵敏度高，各条带大小区分明显，显著提高了结果判别准确度，显著提高了检测准确度和灵敏度；

(三)将检测3种类病毒的引物设计为通用引物，既降低了非特异性扩增，又能满足种苗繁育、栽培生产中对危险性类病毒的监测和检测需要。

附图说明

图1为利用本发明引物组合进行RT-PCR检测ACLSV、ASGV、ASPV和apscarviroids的结果；其中，1-4为单一病毒检测引物对常规RT-PCR结果，5-8为其与内标基因EF-1α共同RT-PCR结果；其中1和5为ACLSV，2和6为ASGV，3和7为ASPV，4和8为apscarviroids，-ve为阴性对照，M为Trans2K^TMplusDNAmarker。

图2为本发明实施例2中优化ACLSV、ASGV、ASPV和apscarviroids多重RT-PCR反应退火温度；其中，样品为田间生长的带有ACLSV、ASGV、ASPV与ASSVd的苹果，-ve为阴性对照，M为Trans2K^TMplusDNAmarker。

图3为本发明实施例2中优化ACLSV、ASGV、ASPV和apscarviroids多重RT-PCR反应循环数；其中，样品为田间生长的带有ACLSV、ASGV、ASPV与ASSVd的苹果，-ve为阴性对照，M为Trans2K^TMplusDNAmarker。

图4为本发明实施例2中以质粒为模板进行优化的多重RT-PCR扩增结果；其中，-ve为阴性对照，M为Trans2K^TMplusDNAmarker。

图5为本发明实施例3中对果园苹果样品携带的3种苹果潜隐病毒和3种类病毒的多重RT-PCR检测结果；其中，-ve为阴性对照，M为Trans2K^TMplusDNAmarker。

图6为本发明实施例4中对多重RT-PCR反应体系灵敏度的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合的获得

参考现有文献与GenBank中已报道的序列，筛选和设计多重RT-PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于我国现有已确定的苹果所有潜隐病毒与类病毒，可特异地获得目标片段，且各目标片段可以用琼脂糖凝胶电泳清晰地区分开。最终，设计选取了表1中的ACLSV(794bp)、ASGV(666bp)、ASPV(346bp)和apscarviroids(220bp)4对引物。为了减少假阳性的产生，以苹果基因组EF-1α(520bp)作为内标基因。使用常规PCR对其进行验证，可以看出，选取的引物可以清晰、特异的获得目标片段，引物二聚体不明显，各引物之间无明显的干扰(图1)，可以进行多重RT-PCR体系的建立。

表1用于多重RT-PCR的引物

实施例2苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR体系建立和优化

1、确定取样部位与取样方法

为了使所建立的多重RT-PCR技术有更广泛的适用性，根据潜隐病毒与类病毒在苹果植株内的分布特点，确定叶片、枝条、花与果实都可以作为取样部位。其中，叶片与花可以用来直接研磨提取植物总RNA，枝条则需要用刀片削取韧皮部来研磨，果实需要削取果皮部分。

2、提取总RNA：采用CTAB-苯酚法提取总RNA

配制RNA提取缓冲液：

取样0.1g，液氮研磨，迅速转入1.5ml离心管，加入500μL水饱和酚、氯仿和异戊醇混合液(酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1)，等体积RNA提取缓冲液，旋窝振荡1min，冰上裂解5min。4℃，12000rpm离心15min。

取上清，加入500μL上述水饱和酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀振荡，4℃，12000rpm离心15min。为除去苯酚，再用氯仿和异戊醇的混合液(氯仿：异戊醇体积比为24：1)抽提一次。

取上清，加入2/3体积异丙醇，混匀室温静置20min后，4℃，12000rpm离心15min。

弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，室温晾干，加50μLDEPCddH₂O溶解。除去RNA中的DNA，按照DNaseⅠ使用说明书进行。即：

在微量离心管中配制下列反应液，总体积为50μL：

37℃反应20-30min，加入50μLDEPCH₂O。

加入100μL上述水饱和酚、氯仿和异戊醇混合液，充分混匀，4℃，12000rpm离心5min，取上清至新管。

加入100μL上述氯仿和异戊醇的混合液，混匀，4℃，12000rpm离心5min，取上清至新管。

加10μL3MNaAc(pH5.2)和250μL的冷无水乙醇，-20℃放置30～60min，4℃，12000rpm离心5min收集沉淀。

用70％的冷乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心1min，弃上清，室温干燥数分钟，溶于30μLDEPCddH₂O，-20℃保存备用。

3、反转录

在1.5mL离心管中加入苹果样品总RNA3.5μL、随机引物(10μM)0.5μL、OligodT(10μM)0.5μL、5×M-MLVBuffer4.0μL、dNTPs(10mM)1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL、M-MLV酶(200U/μL)0.5μL，加DEPCddH₂O至20μL，42℃反应1h，于-20℃保存备用。

上述随机引物为5′-d(NNNNNN)-3′，N为A、G、C或T。

4、多重PCR体系的建立

以田间样品反转录的cDNA为模板，在单一病毒检测常规PCR的基础上建立了多重PCR体系，总体系为25μL。首先，经过大量的单一变量实验，确定了最佳的dNTPs(10mM)体积为0.5μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)的体积为0.5μL、10×TaqBuffer体积为5.0μL。然后，用正交实验确定了引物的最终浓度，分别为ACLSV正向引物(20μM)1.0μL、ACLSV反向引物(20μM)1.0μL、ASGV正向引物(20μM)1.0μL、ASGV反向引物(20μM)1.0μL、ASPV正向引物(20μM)0.4μL、ASPV反向引物(20μM)0.4μL、apscarviroids正向引物(20μM)0.5μL、apscarviroids反向引物(20μM)0.5μL、EF-1α正向引物(20μM)0.5μL、EF-1α反向引物(20μM)0.5μL。

5、优化多重RT-PCR体系反应条件

设定退火温度依次为44℃、47℃、50℃、53℃、56℃、59℃、62℃，进行多重RT-PCR温度梯度优化，结果显示(图2)，随着退火温度的升高，四条目标条带有变亮的趋势，直到59℃以上开始变暗，综合各引物对间的退火温度，最终选择53℃。

设定30、35、40三个梯度的循环数，进行多重PCR循环数梯度的优化，结果显示(图3)，在30个循环时，各个片断都有扩增，但含量差距较大，35个和40个循环都可以得到较好的扩增，结合扩增效率，最终选择35个循环。

最终确定多重RT-PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃复性45s，68℃延伸2min反应，共35个循环；最后72℃延伸10min。

6、检测和结果判定

取6μL反应产物经2％琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中150V电泳30min，在10mg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10～15min，染色后于凝胶成像系统中观察，若794bp处有条带表明ACLSV为阳性，若666bp处有条带表明ASGV为阳性，若346bp处有条带表明ASPV为阳性，若220bp处有条带表明apscarviroids为阳性。

7、以质粒为模板模仿田间侵染

以提取的质粒为模板，模仿病毒与类病毒在田间侵染的所有可能出现的情况，可以看出，不管是单独侵染，还是复合侵染，所建立的技术都可以特异、清晰地检测出病毒与类病毒(图4)。

实施例3果园苹果样品的检测及特异性验证

以采自某果园的苹果样品为材料，提取总RNA为模板，验证所建立的多重RT-PCR技术的可行性。

提取总RNA、反转录、多重PCR反应体系及优化的PCR反应条件同实施例2的描述。结果表明检测结果达到了非常好的效果(图5)。

为验证检测病毒的特异性，将电泳后的条带分别进行切胶回收纯化、克隆、序列测定。对获得的序列在GenBank中进行Blastn比对，结果表明，每一条带对应的病毒序列与目标病毒序列均一致，表明本方法具有高度特异性。

实施例4苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR反应体系灵敏度测定

以果园样品为材料，提取总RNA，反转录合成cDNA后，按十倍浓度梯度进行稀释，然后各取2μL模板进行与多重PCR检测，确定检测灵敏度。结果显示(图6)，多重PCR的检测灵敏度为10^-3，达到了常规单一PCR检测灵敏度，足以满足检测的需要。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus)的引物对I：

ACLSV-F5′-GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3′

ACLSV-R5′-AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3′

其中，N为A或G，M为A或C；

用于特异性RT-PCR检测苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus)的引物对II：

ASGV-F5′-TGGAAACCGAGGATGGACAG-3′

ASGV-R5′-CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3′；

用于特异性RT-PCR检测苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus)的引物对III：

ASPV-F5′-GAAGTAATCGCATCATTCAC-3′

ASPV-R5′-GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3′；以及

apscarviroids-F5′-AGACCCTTCGTCGACGACGA-3′

apscarviroids-R5′-TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3′；

所述引物组合中还包括用于特异性RT-PCR检测内参基因ER-1α的引物对V：

ER-1α-F5′-TCATCATGAACCACCCCG-3′

ER-1α-R5′-CCTGTCCAGAACCCAATTC-3′。

2.含有权利要求1所述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶、RNase抑制剂、DNaseⅠ、DEPC水、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.权利要求2-4任一项所述试剂盒在多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒中的应用。

6.苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，利用权利要求1所述引物组合进行特异性PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品RNA3.5μL、10μM随机引物0.5μL、10μMOligodT0.5μL、5×M-MLV酶缓冲液4.0μL、10mMdNTPs1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL、200U/μLM-MLV反转录酶0.5μL，加DEPCddH₂O至总体积20μL，于42℃反应1h，即得第一条cDNA链。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增使用的PCR反应体系以25μl计为：

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，待测苹果样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。