CN104988245B - 检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸 - Google Patents

检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测大丽花潜隐类病毒的RT‑qPCR检测试剂盒及寡核苷酸。具体地，本发明提供了一组检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测大丽花潜隐类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测大丽花潜隐类病毒的荧光探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的检测试剂盒及其检测方法，可达到准确检测待测样品中DLVd的目的。

Description

检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸
技术领域
本发明涉及一种检测大丽花潜隐类病毒的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测试剂盒及寡核苷酸，属于检验检疫领域。
背景技术
大丽花潜隐类病毒(Dahlia latent viroid，DLVd)，这一新类病毒的RNA分子大小为342nt，与其他已知病毒的序列相似性低于56％。其基因组能够折叠成棒状的二级结构，且能够形成亚稳定的发夹结构I和II(HairpinI，II)以及啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid)的CCR结构域，但与啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid，HSVd)不同，DLVd并没有末端保守的发夹结构(terminal conserved hairpin，TCH)，而是含有马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)的末端保守区(terminal conserved region，TCR)。这表明DLVd可能是由Hostuviroid和Pospiviroid重组形成的新种。虽然DLVd与Pospiviroid的辣椒小果类病毒(Pepper chat fruit viroid，PCFVd)的亲缘关系最接近，但是它们的寄主范围截然不同。DLVd的寄主范围相对较窄，到目前为止，发现其只侵染大丽花。因此，其分类地位有待进一步的研究。
目前，国内外已报道检测植物病毒的方法有指示植物法、分子杂交、ELISA、RT-PCR和基因芯片技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交叉污染，出现假阳性结果。RT-qPCR技术是在常规PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针与模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程。该技术可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测，其中绝对定量是目前采用最多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现。在RT-qPCR定量检测中，这些外标准品的制备成为其能否准确定量的关键。RT-qPCR整个过程在全封闭的状态下进行扩增及产物分析，有效地减少污染及对人体的危害。该技术具有特异性强、灵敏度高、自动化程度高、检测简单快速、技术易于掌握等特点，是快速分子诊断的发展趋势。
目前RT-qPCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检测、线虫检测等诸多领域，但对大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测尚未见公开报道。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸，包括引物和探针。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测方法。
为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：
一组检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测大丽花潜隐类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测大丽花潜隐类病毒的荧光探针，
具体为：
引物DLVd-FP：5'-CCGCTCCTTGTAGCTTTGAGA-3'，(SEQ ID No.1)；
引物DLVd-RP：5'-GGTCGCGTCCTCGAGTCA-3'，(SEQ ID No.2)；
探针DLVd-P：5'-TACCGCCCTTTTGCTTCCTTCTCGC-3'，(SEQ ID No.3)；探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针扩增的目标片段长度为69bp。
为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，其包括用于检测大丽花潜隐类病毒的引物和探针。具体地，引物和探针如序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测大丽花潜隐类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测大丽花潜隐类病毒的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针可以分装，也可以预先混合在一起。
所述检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。其中，所述阴性对照：采用无大丽花潜隐类病毒感染大丽花叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水；所述阳性对照：采用感染大丽花潜隐类病毒感染大丽花叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水。
进一步地，上述检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒还可以包括完成RT-qPCR反应所需的试剂和酶，优选地，其包括：10×PCR缓冲液(含Mg2+)，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水，均购自TaKaRa公司。
为解决第三个技术问题，本发明还提供了检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样品RNA；
取携带大丽花潜隐类病毒的大丽花叶片，经RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取植物总RNA，也可以使用现有技术中已知的提取RNA的方法进行提取；
(2)对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增：
表1 RT-qPCR反应体系
反应条件：
45℃15min；95℃5min；然后95℃5s，60℃30s，共40个循环。
(3)结果判定：
结果分析条件设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。CT值≤35，而且出现明显的扩增曲线为阳性，表明样品中存在DLVd；无CT值，并且无扩增曲线为阴性，表明样品中无DLVd。
本发明针对当前无大丽花潜隐类病毒检测有效方法，提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测方法，可达到准确定量待测样品中DLVd的目的。
本发明的有益效果：
1、本发明所提供的引物和探针可用于大丽花潜隐类病毒的定性及定量分析，对判断DLVd在植物体内复制规律、复制水平和用药后DLVd是否被清除等方面的研究具有重要意义；
2、本发明将在大丽花潜隐类病毒的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面发挥重要作用。
附图说明
图1为大丽花潜隐类病毒引物和探针特异性扩增曲线。
图2为6份待测样品的RT-qPCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。
实施例1检测大丽花潜隐类病毒的专用引物和探针的设计
从GenBank获得大丽花潜隐类病毒的基因序列，利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出DLVd的保守基因序列，用软件Primer Express 3.0设计引物和TaqMan探针，再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过筛选最终确定一对引物和一条探针，其序列为：引物DLVd-FP：5'-CCGCTCCTTGTAGCTTTGAGA-3'(SEQ ID No.1)；引物DLVd-RP：5'-GGTCGCGTCCTCGAGTCA-3'(SEQ ID No.2)；探针DLVd-P：5'-TACCGCCCTTTTGCTTCCTTCTCGC-3'(SEQ ID No.3)。探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有淬灭荧光染料BHQ1。所有引物和探针由大连宝生物技术公司合成。
实施例2检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒的组成
检测试剂盒包括用于检测大丽花潜隐类病毒的引物和探针、阴性对照和阳性对照。具体地，引物和探针如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测大丽花潜隐类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测大丽花潜隐类病毒的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针分装。
所述阴性对照：采用无大丽花潜隐类病毒感染大丽花叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水；所述阳性对照：采用感染大丽花潜隐类病毒感染大丽花叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水。
所述检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒还包括完成RT-qPCR反应所需的试剂和酶，优选地，其包括：10×PCR缓冲液(含Mg2+)，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水，均购自TaKaRa公司。
实施例3RT-qPCR检测大丽花潜隐类病毒的特异性试验
具体过程包括以下步骤：
一、样品来源
大丽花潜隐类病毒(GrapevineE virus，DLVd)，啤酒花矮化类病毒(Hop stuntviroid，HSVd)，辣椒小果类病毒(Pepper chat fruit viroid，PCFVd)由北京出入境检验检疫局植物检疫实验室保存。
二、植物总RNA的提取
对步骤一中的样品经RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取植物总RNA，具体操作见试剂盒说明书；
三、特异性检测试验
以步骤一和步骤二获得的植物总RNA为模板，即：DLVd、HSVd和PCFVd总RNA，水为空白对照，进行RT-qPCR反应。在25μL反应体系中加入2μL 10×PCR缓冲液(含Mg2+)，1μL dNTP混合物(各10mM)，0.4μL反转录酶(200U/μL)，0.5μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.025μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，0.4μL引物DLVd-FP(10μM)，0.4μL引物DLVd-RP(10μM)，0.2μL探针DLVd-P(10μM)，2μL RNA(10pg/μL～100ng/μL)，RNase-Free dH2O补至25μL。反应条件为：45℃15min；95℃5min；然后94℃15s，60℃30s，共40个循环。结果如图1所示，所设计的引物和探针有较强的特异性，只能检测出DLVd，不能检出HSVd和PCFVd。
实施例4田间样品检测
从荷兰进口的大丽花抽取6株，按本发明所述检测方法提取总RNA，然后进行RT-qPCR反应。扩增曲线见图2，定量数据见表3。
表3待测样品的RT-qPCR
待测样品 CT值
样品1 31.76
样品2 20.68
样品3 19.99
样品4 21.73
样品5 22.79
样品6 22.16
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一组检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQID No.1至序列表SEQ ID No.3所示；其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测大丽花潜隐类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测大丽花潜隐类病毒的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光探针序列SEQ ID No.3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。
3.权利要求1或2所述的检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸在制备检测大丽花潜隐类病毒试剂盒中的应用。
4.一种大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阴性对照和阳性对照。
6.根据权利要求4或5所述的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含Mg2+的PCR缓冲液，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水。
7.一种大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)提取样品RNA；
(2)对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增；其中，使用序列表SEQ ID No.1所示的正义引物，序列表SEQ ID No.2所示的反义引物，序列表SEQ ID No.3所示的荧光探针，所述荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1；
(3)根据RT-qPCR反应体系的荧光强度进行结果判定。
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