CN102015996A

CN102015996A - 用于生物学病原体检测的系统及其用途

Info

Publication number: CN102015996A
Application number: CN2008801270693A
Authority: CN
Inventors: 科林·J·H·布伦安; 汤姆·莫里森
Original assignee: Biotrove Inc
Current assignee: Tylov biological acquiring Co.; Life Technologies Corp
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2011-04-13
Also published as: WO2009120183A3; WO2009120183A2; EP2231851A2; EP2231851A4

Abstract

本发明公开了用于检测样品中靶标分析物诸如病原体的组合物和方法。

Description

用于生物学病原体检测的系统及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年12月20日提交的下述美国临时专利申请61/015,555号的权益，在此通过引用将该临时申请全文并入。

发明背景

随着2001年末的炭疽袭击，医学和国防界认识到了对于这种可快速检测会造成健康风险和/或安全风险的生物学病原体的精确且敏感的方法的迫切需要。尽管在多核苷酸和多肽检测方法方面已取得了快速的进展，但目前用于检测病原体的方法还是不足的。目前亟需提供快速鉴定和表征存在于环境或生物样品中的病原体的方法。

发明概述

如下文所述，本发明公开了提供快速且敏感的检测样品诸如环境样品或临床样本中靶标分析物诸如人病原体的系统。

在一方面，本发明提供了用于检测靶标分析物(例如病原体多核苷酸或多肽)的系统，这一系统包含：提供靶标特异性扩增的第一模块；包含检测分析物(例如一种或更多种分析物，诸如多核苷酸和/或多肽)存在或不存在的检测器的第二模块；和包含用于多核苷酸(例如病原体多核苷酸和/或多肽)靶标特异性预扩增或扩增器件的第三模块(其可能与第一模块相同或不同)；以及鉴定特异性分析物的检测器。在一实施方案中，通过第一模块检测出分析物指示靶标分析物存在于样品中，且检测不出分析物指示靶标分析物不存在于样品中。在另一实施方案中，这一系统检测或鉴定1-50或1-20(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50)种特异性分析物。在另一实施方案中，靶标特异性扩增发生在管、珠、孔、板、通道、管道、通孔、微阵列中或基片上。仍在另一实施方案中，第一模块包含温度控制器件。还在另一实施方案中，扩增在通孔阵列中进行。还在另一实施方案中，检测器检测靶标特异性多核苷酸和/或多肽。在另一实施方案中，多核苷酸为细菌、病毒、真菌或其它的病原体。在另一实施方案中，病原体为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，肺炎军团菌(Legionella pneumonia)，小隐孢子球菌(Cryptosporidium parvum)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和炭疽杆菌(Bacillus anthracis)中的任一种或多种。在另一实施方案中，检测器检测炭疽杆菌芽孢(Bacillus anthracis spore)。仍在另一实施方案中，病原体为植物病原体，其是下述的任一种或多种：露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)、疫霉菌(Phytophthora spp)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、根癌农杆菌(Agrobacterium tum)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum coc)和Cylindocladium spatif、大丽花轮枝菌(Verticillium dahlia)、albo-tric轮枝菌(Verticillium albo-tric)、立枯丝核菌AG4-1(Rhizoctonia solani AG 4-1)、立枯丝核菌AG2-2(Rhizoctonia solani AG 2-2)、G_proteob、胡萝卜欧文氏菌(Erwinea carot)、立枯丝核菌AG4-2(Rhizoctonia solani AG 4-2)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。还在另一实施方案中，第一和第三模块相同或不同。

在相关的一方面，本发明提供了一种检测病原体的方法，其中这一方法使用本文所描述的系统。

在另一方面，本发明提供了一种检测和鉴定病原体的方法，这一方法包括：扩增样品中的靶标特异性多核苷酸；检测靶标特异性多核苷酸，其中多核苷酸的检测指示样品中的病原体存在还是不存在；和鉴定靶标特异性多核苷酸，从而检测和鉴定病原体。

在另一方面，本发明提供了一种检测和鉴定病原体的方法，这一方法包括：扩增样品中的靶标特异性多核苷酸；检测靶标特异性多核苷酸，其中所述检测鉴定样品中靶标分析物的存在或不存在；扩增或预扩增靶标特异性多核苷酸；和鉴定靶标特异性多核苷酸，从而检测和鉴定病原体。

在任一上述方面的一实施方案中，分析物、多核苷酸或多肽为下述的任一或多种：霍乱弧菌、军团菌肺炎、小隐孢子球菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、露湿漆斑菌、疫霉菌、致病疫霉、根癌农杆菌、北方根结线虫、辣椒炭疽病菌和Cylindocladium spatif大丽花轮枝菌、albo-tric轮枝菌、立枯丝核菌AG 4-1、立枯丝核菌AG 2-2、G_proteob、胡萝卜欧文氏菌、立枯丝核菌AG 4-2和尖孢镰刀菌。还在其它的实施方案中，这一方法还包括检测病原体多肽，例如，利用免疫测定。在本文所述的各种实施方案中，样品为环境样品，诸如空气样品、水样品或环境拭样。

在另一方面，本发明提供了一种检测系统网络，这一网络包含至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50个与计算机处理单元通讯的本文所述的检测系统。这些系统用于建筑物内，诸如医学中心、实验室、医院、航站楼、军事建筑或政府建筑内。可选择地，这些系统用于某一区域内，诸如城市、州、乡村或军事行动区内。在一实施方案中，本文所述的检测系统提供了到计算机处理单元的关于病原体检测或鉴定的输入，例如，经由无线通讯方法、以太网连接、WiFi、移动电话网络、无线电波、蓝牙、微波或红外线方法。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定多种病原体的组合方法，这一方法包含扩增样品中的靶标特异性多核苷酸；和利用至少两种探针来检测靶标特异性多核苷酸，所述探针每一种都具有独特的可检测部分，其中至少两部分的检测鉴定靶标特异性多核苷酸，从而检测和鉴定病原体。在一实施方案中，扩增在三个单独的聚合酶链反应(PCR)反应中进行，并且使用三种染料来检测至少27种不同的靶标。

在任一上述方面的多种实施方案中，通过第一模块或在第一阶段中检测出分析物指示靶标分析物存在于样品中，并且不能检测出分析物指示靶标分析物不存在于样品中。如果这一系统或方法不能检测出分析物，则不需要对样品进行进一步分析。在本文所述的发明的另一实施方案中，这一系统检测或鉴定1-50或1-20(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50)种特异性分析物(例如病原体多核苷酸或多肽)。在本文所述的发明的另一实施方案中，靶标特异性扩增发生在管、珠、孔、板、通道、管道、通孔、微阵列中或基片上。仍在另一实施方案中，这一系统包括温度控制器件。还在另一实施方案中，扩增在通孔阵列中进行。还在另一实施方案中，检测器检测靶标特异性多核苷酸和/或多肽。在另一实施方案中，多核苷酸为细菌、病毒、真菌或其它病原体。在另一实施方案中，病原体为霍乱弧菌、肺炎军团菌、小隐孢子球、金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌的任一种或多种。在另一实施方案中，检测器检测炭疽杆菌芽孢。还在另一实施方案中，病原体为植物病原体，其是选自下述的任一种或多种：露湿漆斑菌、疫霉菌、致病疫霉、根癌农杆菌、北方根结线虫、辣椒炭疽病菌和Cylindocladium spatif、大丽花轮枝菌、albo-tric轮枝菌、立枯丝核菌AG 4-1、立枯丝核菌AG 2-2、G_proteob、胡萝卜欧文氏菌、立枯丝核菌AG 4-2和尖孢镰刀菌。还在另一实施方案中，第一和第三模块是相同的或不同的。

通过下面的详述和权利要求书，本发明其它的特征和优势将会显而易见。

定义

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有本领域技术人员通常理解的含义。下列的参考文献为技术人员提供本发明所使用的许多术语的一般定义：Singleton et al.，微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第二版，1994)；剑桥科学技术词典(The Cambridge Dictionary of Science and Technology)(Walker ed.，1988)；遗传学术语汇编(The Glossary of Genetics)，第五版.，R.Rieger et al.(eds.)，Springer Verlag(1991)；和Hale & Marham，(哈珀柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991)。如本文所使用的，下列术语具有下文所赋予它们的意义，除非另有指定。

本文所用的“分析物”指的是任一核酸分子、多肽、标志物或其片段。

本文所用的“改变”指的是增加或减少。改变可以是少至1％，2％，3％，4％，5％，10％，20％，30％，或者是40％，50％，60％，或甚至多至75％，80％，90％，或100％。

本文所用的“扩增”指的是增加分子的拷贝数。在一实例中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增核酸。

本文所用的“结合”指对某一分子具有物理化学亲合力。通过本发明所述的任一方法，例如可检测的核酸探针的杂交，诸如基于TaqMan的探针或基于Pleiades的探针的杂交来测量结合。

本文所用的“检测系统”指的是提供分析物检测和/或鉴定的一种或多种的装置的套组。

在本文公开内容中，“包含(comprises)”，“包含(comprising)”，“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予它们的意义，可以表示“包括(includes)”，“包括(including)”等；“基本上由…组成(consisting essentially of)”或“基本上组成为(consists essentially)”具有美国专利法中所赋予的意义，且这一术语是开放式的，这允许超出其所述内容的内容的存在，只要超出其所述的内容的存在不改变其所述内容的基本或新颖的特征，但是除外现有技术实施方案。

本文所用的“样品”指的是任一被收集用于分析的物质。

本文所用的“检测”指的是鉴定分析物的存在、不存在或水平。

本文所用的“检测器”指的是辨别信号的装置。

本文所用的“可检测的”指使分析物可被检测的部分。检测可通过本领域中已知的任一方法，包括但不限于放射学的、光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法。使分析物可检测的有用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶状粒子、荧光染料、吸收染料、自发荧光分子、电子高密度试剂、酶、生物素、地高辛、半抗原、适配体、重金属原子(替换到DNA中)和量子点。

本文所用的“分析物或病原体的检测”指鉴定样品中分析物或病原体的存在或不存在。

本文所用的“分析物或病原体的鉴定”指鉴定

本文所用的“模块”指的是系统组件。

本文所用的“核酸或寡核苷酸探针”指的是能够结合到互补序列的靶标核酸的多核苷酸。通常这种结合通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基对，通常通过氢键形成来实现。如本文所使用的，探针可包括天然的碱基(即A，G，C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等等)。此外，探针中的碱基可通过除了磷酸二酯键之外的键进行连接，只要它没有妨碍杂交。本领域中技术人员应理解的是，探针可以结合缺乏与探针序列完全互补性的靶标序列，这取决于杂交条件的严格度。探针优选直接用同位素标记，例如生色团、发光团、色原或间接用链霉亲和素复合物可随后与之结合的生物素标记。通过测定探针的存在或不存在，技术人员能够检测感兴趣的靶标基因的存在或不存在。

本文所用的“杂交”指形成互补多核苷酸序列间的双链分子的配对。

本文所用的“标志物”指的是与病原体有关的任一蛋白或多核苷酸。

“微阵列”指排列于固体载体(例如芯片、板或珠)上的来自于一种或多种生物体的核酸分子或多肽的集合。这些核酸分子或多肽可网格化排列，其中每种核酸分子或多肽的位置仍然是固定的。

本文所用的“核酸分子”指的是核糖核酸或脱氧核糖核酸或其类似物的寡聚物或多聚物。

本文所用的“压板(platen)”指具有用于保持和/或分析多种液体样品的孔的高密度阵列的装置，例如第6,716,629；6,027,873；6,306,578；或6,436,632号美国专利所描述的，通过引用的方式将这些申请全部并入本文。

“引物组”指一组与一种或多种多核苷酸杂交的寡核苷酸。引物组由至少2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，30，40，50，60，80，100，200，250，300，400，500，600或更多的引物组成。

本文所用的“参照”指的是标准或对照条件。

短语“选择性地(或特异性地)与…杂交”指在严格的杂交条件下分子只与特定的核苷酸序列结合、成对或杂交，当该序列存在于复杂混合物中(例如全部细胞的DNA或RNA，或DNA或RNA文库)时。

本文所用的“特异地结合”指的是识别且结合本发明的多肽或多核苷酸，但基本上不识别和结合样品中其它的分子。

本文所用的“靶标核酸分子或多肽”指的是待被检测的样品的核酸分子、多肽或生物标志物。

本文所用的“靶标特异性扩增”指相对于非特异性扩增，优先发生的靶标多核苷酸的扩增。

附图简述

图1为用于靶标分析物检测的系统的示意图。

图2为显示阶段1分析的细节的示意图。

图3为显示阶段1分析的可选方法的细节的示意图。

图4为详细地显示阶段1直接检测的示意图，其中在扩增期间使用了半定量染料扫描。

图5为显示靶标特异性引物和染料特异性探针的组合如何能够用于病原体检测的表格。

图6为显示靶标特异性引物和染色特异性探针的组合如何能够用于检测特异性病原体的表格。

图7为利用多重单独PCR(multiple singleton PCR)检测用于测试分析物检测的系统的示意图。

图8A和8B为显示在OpenArray^TM平台上的实时PCR(Real-Time PCR)获得的数据有高度可重复性的图和表格。跨越9000多数据点所计算出的标准偏差对1000靶标拷贝数/通孔为0.11Ct，对100拷贝数/通孔为0.21Ct。

图9A-9C分别显示病原体检测、检测系统的预期性能和检测方法的预期益处的工作流程方案图。

图10A和10B包括三个图和一个表格，其提供了对自17种病原体的混合物中鉴定出来的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的定量分析。

图11包括显示霍乱弧菌、肺炎军团菌、小隐孢子球菌和金黄色葡萄球菌DNA样品的靶向区检测的四个图形。利用这四种生物体的每一种的引物对进行实时PCR。X轴显示PCR循环数目。Y轴显示荧光。NTC表示无模板对照。该图是扩增后的阶段2检测步骤的实例。该图显示病原体检测发生于开集合阵列中。这些图形也显示每一种PCR产物特异性扩增的检测发生于病原体混合物存在的情况下。

图12是显示用于一种靶标检测的示意性PRI-锁(PRI-lock)原理的示意图。

图13为显示PRI-锁(PRI-lock)原理联合OpenArray技术用于三种不同靶标多重检测的概述的示意图。

图14显示OpenArray玻片内连续稀释的单一靶标的实时检测和定量的图像。

图15显示OpenArray玻片中9种不同的植物病原体的实时多重检测和定量。图面A显示所使用的PRI-锁(PRI-locks)的总数量，黄色的靶标被应用于样品。图面B显示通孔子阵列的位点模式(Spotting pattern)。图面C显示32个循环后的子阵列图片。图面D显示发现的靶标的Ct值。测定下述病原体：露湿漆斑菌、疫霉菌、致病疫霉、根癌农杆菌、北方根结线虫、辣椒炭疽病菌和Cylindocladium spatif、大丽花轮枝菌、albo-tric轮枝菌、立枯丝核菌AG 4-1、立枯丝核菌AG 2-2、G_proteob、胡萝卜欧文氏菌、立枯丝核菌AG 4-2和尖孢镰刀菌。

发明详述

本发明提供了用于检测和鉴定样品中靶标分析物(例如多核苷酸、多肽)的系统、方法和组合物。

本发明至少部分基于以下发现：用于从样品(例如环境样品、空气样品、水样品)提取和浓缩DNA的系统可以与用于特异性扩增和检测一种或多种(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，75，100)感兴趣多核苷酸的系统结合。本发明的系统采用两阶段策略用以分析物鉴定(例如病原体多核苷酸的鉴定)。第一阶段涉及样品中分析物的存在或不存在的检测。实施这一检测步骤并不是鉴定分析物，而是确定分析物是否存在于样品中。第一检测步骤产生的信号可由样品中存在的一种或多种的分析物产生。第二阶段涉及分析物的鉴定。这一系统特别有利于样品中即便微量的多核苷酸的快速低成本的鉴定。在具体实施方案中，检测系统提供了病原体多核苷酸或预示生物威胁的其他分析物的鉴定。

这种两阶段靶标检测方法的优势是多重的，特别是在持续性监测环境特异性生物因子或快速处理大量暴露于感染性生物媒介下的临床样品的情况下。在这两种情况下，检测的速度、精确性和灵敏性是检测系统的关键要求。检测系统鉴定威胁(即样品中病原体的存在)的速度将取决于具体应用，但是通常病原体鉴定少于约两小时是理想的。优选地，完成病原体存在的检测和病原体鉴定的时间少于对感染原的生理反应时间。取决于生物体，这一时间能够少于约90分钟、60分钟或甚至30分钟。检测系统对不同微生物的灵敏性必须足以检测相对于病原体通常存在于环境中水平的病原体存在的增加。理想地，检测系统提供相对于病原体通常存在于环境中水平的病原体(例如微生物)检测水平。本发明系统有利地提供很少的假阳性和假阴性鉴定，通常小于约1∶10⁵，1∶10⁶，1∶10⁷，1∶10⁸，以确保在环境样品中或临床样本中可靠地检测这一因子。在一实施方案中，内部阳性对照被包括在内以降低假阳性率。

本发明的检测系统包含提供靶标特异性扩增(或预扩增)的第一组件或阶段1和包含检测器的第二组件(图1)。描述病原体检测工作流程的示意图显示于图9A中。靶标特异性扩增可在一个或一系列管、孔、板、通道、管道、微阵列、通孔或任一其它的提供合适反应环境的容器或基片中进行。优选地扩增在管、孔或通孔阵列中进行。若需要，第一组件还包含温度控制或温度循环器件以易化扩增反应。例如，通过保持由热传导材料制造的阵列的至少一边在特定温度(例如产生一种热区)，可穿越阵列的一维或二维施加温度梯度(图2)。如果温度随时间而变化，穿越阵列的温度分布可以是不同的。温度变化率通常与所应用的温度和至热源的距离是成比例的。可以利用本领域中已知的任一方法改变温度，所述方法包括但不限于珀尔贴单元(peltier unit)(图3)、水浴、导电金属板的欧姆加热(ohmic heating)或电磁能。

如果阶段1记录阳性结果(即指示分析物诸如病原体存在)，其余样品进入第二阶段以对形成阶段1中所观察到的阳性信号的特定分析物进行检测。阶段2中，利用一对或更多对靶标特异性引物对靶标进行预扩增，从而产生一种或多种的靶标特异性扩增子。然后将这些扩增子导至一种或多种单独的反应容器(例如微孔或通孔阵列)，其包含一对或更多对靶标特异性引物以及一种或多种探针。在阶段2的一实施方案中，测定每种病原体至少一种、两种、三种、四种或五种靶标(例如多核苷酸序列)。在阶段2的另一实施方案中，测定每种威胁至少约三种或更多的重复数。内部阳性和阴性对照减少了阶段2中的假阳性/假阴性率。

可选地，如果阶段1后存在可检测数量的分析物，通过例如特异性结合可检测的探针或抗体来鉴定分析物。在将扩增的样品引入到容器中后，将容器流体密封并进行热循环。这一检测可在多重单独PCR检测中进行(图7)。若需要，同时实时监测每一反应的扩增子产物以定量样品中每一靶标。相对于内对照的参照来完成定量。若需要，阵列可包括下列的一种或多种：

ο阳性对照以确认测定起作用；

ο阴性对照以鉴定假阳性结果的存在；

ο两个、三个、四个或更多个重复以增加精确度、产量和/或结果的精确性；和

ο检测每种病原体的多重靶标以提高检测的特异性而且减少假阳性的检测。

在一实施方案中，来自阶段1的样品被分到阵列中以检测单独的扩增子(图1)。在另一实施方案中，本发明公开了合并两个检测阶段，即阶段1和阶段2的微流体回路，在这种情况下，测试样品被分为两部分。第一体积用于阶段1中的分析，而且如果基于阳性信号发现含有一种或多种分析物，那么第二体积量被用于阶段2中的分析以鉴定形成阳性信号的特定分析物。

为加速PCR过程，可取的做法是减少总样品体积以便减少热反应时间。因为反应速度是由分子彼此发现并结合的时间所决定的，其中分子转运受扩散所控制，那么通过减小反应容器尺寸而使扩散长度减小是有利的。连续流动的PCR格式实现了这些目标。来自阶段1的样品当穿过提供样品加热和冷却的连续流动的PCR格式中的一系列环时，它移动经过这些环，并最终到达检测器(图4)。在这种概念下，通过将微通道中的样品转运穿过空间固定的温度区来实现温度循环。只有流动的液态柱必须经历PCR时相间的温度变化。而且，这一技术允许过程的连续流动而不是传统热循环仪的批次处理。理想地，分析步骤的整合也能够实现。在一实施方案中，利用连续过程进行阶段1分析。

连续流动PCR芯片可用硅、玻璃、一次性聚合物微流体芯片(例如聚碳酸酯)或金属生产。利用使用正性光刻胶SU-8的标准光刻蚀法，这些芯片是微结构的，而且应用本领域中已知的蚀刻方法形成这种微结构模式。可选地，通过用模具冲压基片衍生及通过随后改进型镍抗蚀剂结构的电镀术制造微结构。通道的尺寸规格可以是变化的，然而，在一实施方案中，通道宽度为500μm、深度为100μm及通道全长为818mm。在入口之后，液体在变性温度下穿过微通道较长的部分。然后这一芯片包含一些数目(例如5，10，15，20，30，50或更多)的温度循环，其受到样品在后延伸期之后离开芯片之前穿过贯穿一、二、三或更多的温度区的通道的通路影响。通道穿过变性区、退火区和延伸区。每一PCR循环的全长为35-74mm(例如35，40，50，60，70，80，90，100mm)，其代表着与通常PCR板中200μl的液体体积相比经历热循环的微升样品体积。理想地，芯片的外部尺寸规格为75.5mm×25.5mm，显微镜玻片大小以易于与标准实验室仪器联用(Gartner et al.，″Methods and instruments for continuous-flow PCR on a chip，″www.microfluidic-chipshop.com/files.php？dl_mg_id＝33&file＝dl_mg_l 199801133.pdf))。在其他实施方案中，连续流动PCR在具有不同宽度的长螺旋形微流体通道的一次性聚合物圆盘上进行。这一圆盘中间夹入恒温的热块(Chung et al.，″Continuous-flow PCR using a disposable polymer disk(www-samlab.unine.ch/ConferenceCD/IMCS1 1/pdfs/AP190M.pdf))。在连续流动PCR的一实施方案中，随着样品穿越一个或多个通道或通道，样品被一个或多个检测器所监测。因为它随着时间的推移而累积，这提供了扩增子的定量。

实时PCR方法基于与扩增产物的积累有关的荧光变化。在热循环期间实时监测荧光变化。荧光变化可归结为探针裂解(例如TaqMan

化学)、双链DNA结合染料(例如SYBR Green)、引物延伸(例如Molecular Beacons)或通过并入荧光猝灭剂以减少荧光标记引物所产生的信号(例如Plexor^TM技术)。PLEXOR^TM技术用于检测随时间的推移而产生的产物累积，其被测量为荧光信号的减少。利用PLEXOR^TM系统，产物累积被测量为扩增期间荧光信号的减少。这一反应仅使用两种引物，其中一种同时包含荧光标签和修饰的碱基。另一种引物是未修饰的。随着扩增的进行，通过荧光猝灭剂位点特异性的掺入来减少荧光，该荧光猝灭剂被连接到修饰的核苷酸(iso-dG)并相对互补修饰的碱基(iso-dC)插入。这一猝灭剂紧邻位于引物5′末端的荧光染料，导致了荧光信号的减少。

仍在另一实施方案中，阶段1利用例如多重PCR检测病原体的存在。阶段2中，一种或多种特异性扩增产物用于鉴定病原体。在一实施方案中，利用批次处理以鉴定和定量样品中的阳性威胁进行阶段2。为加强特异性，每一病原体可使用两种或更多的引物对。然后利用特异性荧光染料来实现每一扩增子的检测。染料特异组合的检测指示样品中病原体的阳性鉴定。阳性对照可用于确认这一测定有效。测定的失败可能与干扰PCR的抑制剂的存在、流体误差、试剂失效或另外的问题有关。

直接在廉价的微流体PCR中监测多种病原体是期望的。然而，每PCR反应的病原体鉴定数目受热循环仪反应容器中所采用的检测方法所限。熔融曲线分析基于PCR产物热熔融特性允许PCR产物的区别而且可用于鉴定特异的PCR产物。可选地，荧光染料与特异性PCR事件相配合。这些方法是通行的，并且允许单一PCR反应检测多种病原体。通过这些检测方法鉴定的病原体的数目受检测器分辨率所限。例如，荧光染料的光谱分离限制了单一反应中所使用的特异性探针的数目，或熔融产物的热分离限制了独特可鉴别的PCR产物的数目。一种简单的解决方案为进行多重PCR反应，从而通过额外的PCR数目增加使可检测的靶标的数目。图5和6中的方法利用了一种使可检测的靶标的数目超过简单多重性的组合方法。如图5中所示，三个PCR和三种染料被用于检测达27种不同的靶标。在靶标被视为存在前，每一靶标需要三种独特的探针在特异性PCR反应容器中扩增。传统地，每种病原体三种靶标的27种病原体的测定需要27个独立的利用三种不同荧光染料的PCR，而不是通过图5所述方法所描述的三个PCR反应。有利地，这些方法使用比常规方法更少的样品。尽管这些图显示了其中每一个在单独微流体通道中检测的三个不同的PCR，但本领域中技术人员会认识到多种的组合PCR反应都能进行。有利地，本发明提供在一个步骤中进行并分析多个(2，3，4，5，6或更多)反应。样品被分开到多个单独的反应中。若需要，可预扩增样品以产生足够的样品来保持灵敏性。

当检测的病原体极少存在，并且在单一样品中不可能鉴定多种病原体时，图5中所述的方法特别有用。图6描述了一种可选择的组合方法，这种方法在多种病原体很可能存在于单一样品中时特别有用。在这种情况下，三种染料和三个独立的PCR反应解决任一多达6种(即1，2，3，4，5，6)的病原体的组合。本领域中技术人员认识到这一方法容易适于鉴定另外的病原体组合。这一组合方法能与除了荧光染料之外的检测方法合并，诸如熔融曲线剖析图、毛细管电泳迁移率和通过质谱分光光度计测量的荷质比。

第一阶段的产量可能足以或不足以明确鉴定病原体。如果存在足够数量的多核苷酸，不需要进行另外的扩增。相反能够直接鉴定来源于阶段1的多核苷酸。

例如，如果第一阶段的染料组被设计为用信号表明样本中细菌、病毒或真菌的存在，那么另一不同的荧光探针与靶向为每一类微生物的探针序列结合。可选地，同样的荧光探针或嵌入染料诸如SYBRGreen I可与所有的引物组一起使用，而且来源于多个反应的荧光信号的普遍增加指示靶向微生物的存在但是并不能鉴定特异性病原体。

在一实施方案中，反应容器包含多个反应器(例如孔、通孔)以同时容纳多种病原体的检测(例如大于1、5、10)。阵列的几何构型提供了快速热循环。在一实施方案中，阳性或阴性信号检测所需要的时间少于约120分钟、60分钟、45分钟、30分钟、20分钟或15分钟。在另一实施方案中，在至少约15个循环，20个循环，25、26、27、28、29或30个循环中检测阳性或阴性信号。在另一实施方案中，在至少约30、35、40、45、50、55或60个循环中检测阳性或阴性信号。若需要，阶段2中使用嵌套引物以增加分析物检测的特异性和/或PCR扩增的特异性。

在预扩增阶段中通过利用靶标特异性引物的PCR增加了靶标序列的丰度。本发明的引物包含足够长度的寡核苷酸和适当的序列以便提供靶标位点中相当多数量核酸上的聚合作用的特异性启动。具体地，本文所使用的术语“引物”指的是包含两个或更多个核碱基的序列。优选地引物包含3个、且最优选多于8个的核碱基，其序列能够启动基本上与多态性位点链互补的引物延伸产物的合成。引物必须足够长以在聚合作用诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，其包括温度、缓冲液和核苷酸组成。寡核苷酸引物通常包含12-27个或更多个核苷酸，尽管它可以包含较少的核苷酸(例如8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40)。本发明的引物被设计为“基本上”与待扩增的基因组位点的每一条链互补而且包括适当的如上文所讨论的G或C核苷酸。这意味着在允许用于聚合作用的试剂发挥作用的条件下，引物必须与它们各自的链充分互补杂交。换句话说，引物应该具有充分的与5′和3′侧翼序列的互补性以便与之杂交并允许基因组位点扩增。

只需要少量的(例如1，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50)热循环就使每一靶标的增加超出背景千倍多(例如10个循环＝1024倍增加)。大量引物存在情况下的少量循环意味着扩增依然在对数期，因此可能实现每一靶标序列在多重反应中统一和已知的扩增。

在一可选实施方案中，来源于阶段1的扩增子的扩增混合物可被直接引入到阶段2中并在多容器结构中分配以用于在每一独特的反应容器中进行特异性DNA或RNA靶标的单独和离散的检测。

检测器鉴定样品中分析物(例如病原体多核苷酸)的存在或不存在。在识别分析物的过程中，检测器可辨别任一可检测的信号。检测器可采用光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学器件来检测分析物的存在。任选地，检测系统包括接收来自检测器的关于分析物存在或不存在的输入的处理单元。

在一实施方案中，通过探针结合检测PCR产物(即扩增子)或实时PCR产物。在一实施方案中，探针结合产生荧光信号，例如通过将荧光染料分子和猝灭剂部分到连接相同或不同的寡核苷酸底物(例如TaqMan

(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，Pleiades(Nanogen，Inc.，Bothell，WA，USA)，分子信标(Molecular Beacons)(例如见Tyagi et al.，Nature Biotechnology 14(3)：303-8，1996)，Scorpions

(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR，USA))。在另一实例中，通过结合时发射荧光信号的荧光染料(例如SYBR

Green(MolecularProbes)的结合检测PCR产物。这些检测方法对靶标特异性PCR产物的检测是有用的。靶标存在的检测引起了提供分析物鉴定的阶段2。

在一实施方案中，每一反应容器包含一对或更多对引物，其每一对都与感兴趣的多核苷酸互补而且能够扩增那一序列。若需要，反应容器还包含一种或多种被可检测地标记的探针。在一实施方案中，每一检测探针包含一独特的荧光染料，其提供扩增的靶标的分别检测。在一实施方案中，微流体装置或压板与上游样品收集装置(例如气溶胶或液体取样器)保持通讯。在另一实施方案中，微流体装置或压板与下游检测器，即分析装置或进行分析的器件(例如质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)、阵列毛细管电泳(CAE)、逆转录PCR(RT-PCR)、单一分子检测系统、荧光检测、光学检测)保持通讯。基于荧光探针的用于最初检测步骤的引物包括但不限于LUX，其可自Invitrogen和Plexor商购。LUX表示基于光扩增(Light-Upon-Extension)，其指探针掺入到双链DNA后其荧光强度的特征性增加。

实际上，本领域中任何已知的方法都可以用于分析物的检测。若需要，一种或多种分析方法学都能够在通孔、通道、贮器、反应室、毛细管或其组合物中进行。

本发明的方法特别用于监测环境样品诸如空气样品、水样品、农业样品或生物样品中病原体的存在。在一实施方案中，本文所述的检测系统与美国基因组公司(U.S.Genomics)用于DNA提取和浓缩的空气取样微流体系统联合以满足生物防御界的需要。说明书对于本文所述的检测系统的预期性能和益处的描述列于图9B和9C中。

若需要，本发明的检测系统可用于检测网络中。网络监测某一地区的病原体检测。所述网络提供以下信息：什么时候病原体通过第一检测系统被首次检测出，病原体是否到达第二或第三检测系统，以及病原体到达下一检测器所需的时间。这能够使关于例如大小、移动和病原体或病原体云穿越某地区的速度的信息被收集起来。该网络包含检测系统，其将信息从检测系统传输到一个或多个中央计算机以进行处理。

存在于样品中的测试分析物(例如多核苷酸，诸如DNA、RNA)被分离并浓缩至小体积，然后其被分成两部分以用于两阶段的检测过程。在第一阶段，进行鉴定样品中分析物存在或不存在的初步测定。第二阶段提供指示分析物的样品中分析物的鉴定。阶段1中靶标存在的检测指示应该将样品进一步在阶段2鉴定过程中进行处理。阶段2提高了测定的特异性和灵敏性，而且最终鉴定了样品中的病原体。

本公开内容提供了用于对来自各种样品的靶标分析物制备和分析的集成模块系统。该系统在制备和分析多种靶标分析物中是有用的，所述靶标分析物包括但不限于分子(例如毒素，诸如蓖麻毒素或药物)、生物分子(例如多核苷酸、多肽、脂质)、细胞(例如真核生物和原核生物细胞，诸如细菌)、孢子(例如炭疽芽胞杆菌)、病毒(例如流感、天花)和其它物质。在各种示例性实施方案中，通过一种或多种的如本文所述的系统模块能够进行微流体样品的制备和分析。

在一实施方案中，用于纯化或浓缩靶标分析物的第一模块包括一种或多种下列的方法，其包括但并不限于裂解、乳化、超声处理、离心、色谱分析、固相萃取(SPE)、免疫捕获(例如免疫磁性分离法(IMS))、磁珠捕获和其组合。在一些实施方案中，第一模块能使大规模的样品溶液减少至微量体积，例如通过浓缩毫升数到微升数或更小体积以引入到一种或多种的微流体装置，诸如包含通孔的压板。

如本文所使用的“微流体装置”指的是适用于操作、储存、处理或分析亚毫升数量的流体，诸如微升(μL)、纳升(nL)和/或皮升(pL)体积。在各种示例性实施方案中，微流体装置能包含一种或多种的微芯片(例如微米尺寸、纳米尺寸、皮米尺寸装置)、包含通孔的毛细管或压板。

微流体系统

有利地，本发明使用的微流体或纳流体系统包含高密度的反应容器阵列，诸如用于在小于约10、20或100微升流体中实施大量PCR分析的微升或纳升尺寸的通孔、通道或室。在具体实施方案中，本发明使用BioTrove纳流体系统-纳米尺寸的通孔或室的高密度阵列，其用于在显微镜玻片大小阵列上实现达3072个PCR分析，每反应33nl。例如美国专利申请6,716,629号描述了这种阵列，将该申请通过引用的方式并入本文。OpenArray(R)板为包含3072个直径约320μm的通孔的钢制压板。利用聚合物处理每一通孔以使每一孔的内表面亲水而外表面疏水。借助于液体表面张力和聚合物涂层间的表面力差异将液体分配并保持在每一通孔中。通孔分为48个子阵列，每一子阵列有64通孔。每一子阵列的间隔为大约4.5mm。

特别地，本发明提供了包含纳升尺寸的通孔或室的高密度阵列的压板，所述通孔或室包含小于约1000nl、750nl、500nl、250nl、100nl或甚至50nl的试剂和样品用于PCR分析。例如在美国第6,716,629，6,812,030及6,716,629号专利和美国第20080108112，20030180807及20030124716号专利公布中描述了用小体积试剂加载阵列的方法。压板的疏水性外表面不会潮湿，这使在每一通孔中的液体与其邻孔液体隔离。差异性表面涂层连同蚀刻通孔的尺寸精度导致液体到每一孔的准确且精确的自动计量的加载。用PCR引物和探针预加载PCR阵列。这些试剂通常通过4轴机器人操作自384孔板转移到具有48引脚阵列的通孔，从而使OpenArray^(R)板的每一通孔都具有不同的引物组。然后移除溶剂而导致引物或引物/探针固定于每一孔的内表面。被动荧光参照染料的共加载允许检测未能载量测定的孔。阵列是容易配置的，因为这一测定构型是基于384孔来源板的排列。OpenArray^(R)板的3072孔可基于分析需要配置，例如能通过16、32、64、64倍数直至3072个测定询问样品。

本文所公开的系统在生物防御监测、感染性疾病诊断、法医学、基因组学、蛋白组学和其它领域方面具有广泛的应用。对于生物防御，这一技术提供可在该领域中使用的紧凑单元以用来作为例如建筑物、高速公路、城市、国家、飞机、机场、船舶或港口的病原体监测装置。这一系统能够制备和分析来自空气、生物流体、农业产品或其它来源的样品以检测靶标病原体。低消耗成本与自动化制备和分析的组合提供了能够同时筛选大量样品以及高特异性地鉴定样品中测试分析物的存在或不存在的高通量分析系统。本文所公开的系统也能应用于药物基因学、人医学遗传学、生物医学研究、动物及植物分型和身份认证。

所公开系统的另外应用包括分子诊断学，诸如检测微生物、对生物体进行基因分型、测序和法医学；为各种方法学创造样品制备和分析平台，诸如RT-PCR、测序、氨基酸序列检测、蛋白分析、质谱分析、阵列毛细管电泳、差异显示和单种分子的检测。

检测样本中靶标序列的两阶段方法充分地增加了检测的特异性而且大大减少了测量的假阳性和假阴性。增加的特异性来自于每一检测阶段特异性的倍增性组合。基于阶段1中阳性信号和阶段2中阳性信号的观测认为信号是真阳性的。为评估这一改进，假定在阶段1和阶段2这两者中PCR测定扩增每一微生物的三种靶标。TaqMan PCR对每一靶标的特异性大于1∶10³，因此作为第一阶段的输出，对每一靶标预期的特异性将为(10³)³＝10⁹(例如至少约10⁷，10⁸，10⁹，10¹⁰，1θ¹¹)。在一实施方案中，本发明提供与10³传感器x10⁴测量/传感器相关的特异性。

在阶段2观察到类似的特异性，组合特异性为10⁹x10⁹或10¹⁸(例如至少约10¹⁵，10¹⁶，10¹⁷，10¹⁸，10¹⁹，10²⁰)。高特异性在检测生物战制剂的背景下是很重要的，在这种情况下，高假阳性或假阴性率会使得检测系统不可靠且不能使用。预扩增时，这两阶段系统的灵敏性会小于每微生物约100拷贝数，以及基于系统的复用-解复用检测性能能够检测每样品高达至少20种不同的微生物。特别为200拷贝x100bp/拷贝(1e^-8g/650g/mole*6e23bp/mole)。

两阶段系统设计增加了特异性和灵敏性而没有增加系统和测量成本，并且在单一系统中结合了高特异性与灵敏性。在一实施方案中，本发明提供了5-10ng DNA样品中至少约10，20，50，100，150，175，200，250，300，500或甚至1000个靶标的测定。在具体实施方案中，本发明提供了单一样品中至少约3，5，10，20，30，40或50个威胁(例如病原体)的分析。在一实施方案中，样品被批次处理或连续处理。

应答时间是快速的(少于约1小时、2小时、3小时)，而且与解复用组合的复用的最初检测、第二阶段中特异检测能够同时检测多种病原体且易于扩展为检测更多数量微生物。两阶段系统设计本质上提供了可靠且稳健的检测大量病原生物体所需要的高特异性和灵敏性。

利用本发明的系统和方法可以检测多种细菌和病毒病原体。示例性细菌病原体包括，但不限于产气杆菌属(Aerobacter)，气单胞菌属(Aeromonas)，不动杆菌属(Acinetobacter)，衣氏放线菌(Actinomyces israelii)，农杆菌属(Agrobacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)，炭疽杆菌(Bacillus antracis)，拟杆菌属(Bacteroides)，巴尔通体属(Bartonella)，博代氏杆菌属(Bordetella)，波氏杆菌属(Bortella)，疏螺旋体属(Borrelia)，布氏杆菌属(Brucella)，伯克氏菌属(Burkholderia)，鞘杆菌属(Calymmatobacterium)，弯曲菌属(Campylobacter)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，梭菌属(Clostridium)，产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringers)，破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)，棒状杆菌属(Cornyebacterium)，白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)，棒杆菌(corynebacterium sp.)，肠杆菌属(Enterobacter)，产期肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，肠球菌属(Enterococcus)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，埃希式杆菌属(Escherichia)，佛朗西斯氏属(Francisella)，核粒梭状杆菌(Fusobacterium nucleatum)，加德纳菌属(Gardnerella)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，哈夫尼菌属(Hafnia)，螺杆菌属(Helicobacter)，克雷伯菌属(Klebsiella)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，乳杆菌属(Lactobacillus)，军团菌属(Legionella)，钩端螺旋体属(Leptospira)，李斯特菌属(Listeria)，摩根氏菌属(Morganella)，莫拉氏菌属(Moraxella)，分支杆菌属(Mycobacterium)，奈瑟菌属(Neisseria)，巴斯德菌属(Pasteurella)，巴氏杆菌(Pasturella multocida)，变形杆菌属(Proteus)，普罗维登斯菌属(Providencia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，立克次氏体(Rickettsia)，沙门菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺菌属(Shigella)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，寡养单胞菌属(Stentorophomonas)，链球菌属(Streptococcus)，念珠状念杆菌(Streptobacillus monilifomis)，密螺旋体属(Treponema)，梅毒螺旋体(Treponema pallidium)，细弱螺旋体(Treponema pertenue)，黄单胞菌属(Xanthomonas)，弧菌属(Vibrio)和耶尔森菌属(Yersinia)。

利用本发明的系统和方法可检测的病毒实例包括逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒如HIV-I(也称为HDTV-III，LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III和其它的分离株如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒(polio viruses)，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)；肠病毒(enteroviruses)，人柯萨奇病毒(human Coxsackie viruses)，鼻病毒(rhinoviruses)，埃可病毒(echoviruses))；钙病毒科(Calciviridae)(例如引起肠胃炎的病毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒(equine encephalitis viruses)，风疹病毒(rubella viruses))；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒(dengue viruses)，脑炎病毒(encephalitis viruses)，黄热病病毒(yellow fever viruses))；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒(coronaviruses))；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如疱疹性口炎病毒(vesicular stomatitis viruses)，狂犬病病毒(rabies viruses))；线状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒(ebola viruses))；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒(parainfluenza viruses)，腮腺炎病毒(mumps virus)，麻疹病毒(measles virus)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus))；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒(influenza viruses))；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan viruses)，本雅病毒(bunga viruses)，静脉病毒属(phleboviruses)和奈洛病毒属(Nairo viruses))；砂粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒(hemorrhagic fever viruses))；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如呼吸道肠道病毒(reoviruses)，环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒(rotaviruses))；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；肝病毒科(Hepadnaviridae)(B型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒(parvoviruses))；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒(papilloma viruses)，多瘤病毒(polyoma viruses))；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分的腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯性疱疹病毒(herpes simplex virus(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)，巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)，疱疹病毒(herpes virus)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variola viruses)，牛痘病毒(vaccinia viruses)，痘病毒(pox viruses))；和虹彩病毒可科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒(African swine fever virus))；和未分类的病毒(例如丁型病毒性肝炎的病原体(认为是乙型病毒性肝炎病毒的缺陷附属物)，非甲型、非乙型病毒性肝炎的病原体(类别1＝内部传播的；类别2＝非肠道传播的(即丙型病毒性肝炎)；诺瓦克病毒(Norwalk)和有关病毒，以及星状病毒)。

其它的传染性生物体(即原生生物)包括疟原虫(Plasmodium spp.)，诸如热带疟原虫(Plasmodium falciparum)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)，卵形疟原虫(Plasmodium ovale)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)以及刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。血液播散的和/或组织寄生虫包括疟原虫，巴贝虫(Babesia microti)，分歧巴贝虫(Babesia divergens)，热带利什曼原虫(Leishmania tropica)，利什曼原虫(Leishmania spp.)，巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)，杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)，冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)(非洲睡眠病)，库氏锤虫(Trypanosoma cruzi)(查加斯氏病)，以及刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。

在具体实施方案中，本发明提供了用于检测可以用作生物武器的病原体的系统和方法。可以用作生物武器的示例性病原体提供在表1中(如下)。

表1

除非另有指示，本发明实践使用分子生物学(其包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们都在技术人员掌握范围内。在文献中对这些技术进行了充分地解释，诸如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，second edition(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture”(Freshncy，1987)；“Methods in Enzymology”；“Handbook of Experimental Immunology”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel，1987))；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis，1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，这样就可以在作出和实践本发明中被考虑。

提出下列的实施例以便为本领域技术人员提供关于如何进行和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完全的公开和描述，但并不是意欲限于本发明人认为是他们的发明的范围。

实施例

实施例1：筛选和验证

为了测试用于病原体检测的引物设计策略的特异性以及为了检测多个靶标以及多种环境水矩阵对OpenArray^TM平台上实时定量PCR(Real-time qPCR)分析的定量能力的影响，经设计靶向病原的毒力和标志物基因的110个测定(SYBR Green I引物对)询问来自20种水源性病原体的DNA样品。

通过用同样的引物对/样品组合加载3072通孔来检测OpenArray^TM平台上实时PCR(Real-time PCR)的性能均一性。实验包括三个平行循环的OpenArray^TM板，从而产生9216个数据点。自这一实验获得的数据指示OpenArray^TM平台上高度可重复的实时PCR。跨越9000多数据点所计算出的标准偏差对1000个靶标拷贝数/通孔为0.1Ct，对100个拷贝数/通孔为0.21Ct(图8A和8B)。

经验证的引物序列被加载到OpenArray^TM板上。标准的PCR程序，除了样品和反应混合物之外，被加载到OpenArray^TM板而不是其他介质。然后研究人员在玻璃柜里密封所述板，热循环在OpenArray^TM NT循环仪中进行。通过OpenArray^TM NT循环仪实时定量PCR(Real-time qPCR)软件采集SYBR Green I荧光并且处理成循环阈值(CT)、扩增子熔融温度(Tm)和其它的PCR质量分数。

以高度平行的方式进行实验以测试引物设计策略的特异性。引物对设计为靶向多达5个不同区域/每一经研究的病原体。通过连续地将来自个体生物体的稀释的基因组DNA掺入到自污水、三级污水和河水样品分离出的DNA样品。利用靶向多达各种病原体5个不同区域的每一组经设计的引物对单独地检验来自17种病原体的模板DNA。将自17种病原体分离出来的DNA混合物在不同浓度下掺入到10倍连续稀释的背景DNA，进到OA^TM板并在NT循环仪中进行循环。

利用设计为扩增靶病原体四个不同区域的测定进行副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的定量分析，并通过测量log初始DNA浓度对平均Ct值曲线的斜率确定测定效率(图10A，显示于相邻的表格中)。反应效率中观察到的差异允许为进一步研究而选择测定。自17种病原体混合物中鉴定副溶血弧菌(图10B)。NT循环仪的检测极限允许鉴定低至6.6基因组当量的病原体。而且，在环境样品中掺入纯培养物对OpenArray^TM系统的定量能力几乎没有影响。

实施例2：测定灵敏性和特异性

通过单独地以及在来自4或8种生物体的DNA混合物中检测来自单一生物体的基因组DNA来确定测定灵敏性和特异性。在OA^TM平台上进行实时PCR允许检测自纯化培养物中分离出来的以及自4或8种病原体中分离出来的霍乱弧菌、肺炎军团菌、小隐孢子球菌和金黄色葡萄球菌的DNA样品(图11)。

OpenArray^TM平台上的实时PCR对高度平行引物验证和用于病原体检测的多样品检验都是理想的工具。有利地，OA^TM上所产生的数据是非常有效的、可重复的而且直接经由实时SYBR Green I实时PCR测量的定量。OA^TM上的测定设计是相当灵活的，能够使研究人员测试无限制的各种测定/样品组合。通过解离曲线分析来确认测定的特异性。最后，这一方法适用于多种相对低丰度的微生物在高背景DNA中的分析(即环境样品)。

实施例3：Pri-锁(Pri-lock)探针和实时PCR

最近，新概念超高通量的OpenArray^TM平台已用于实时PCR，能够容纳超过3000个反应/每阵列。国际植物研究所(Plant ResearchInternational)已开发出用于多重检测的PRI-锁(Pri-lock)探针，其提供了在靶标特异性识别中的灵活性和高通量扩增(Szemes et al.，″Diagnostic application of Padlock Probes-Multiplex Detection of Plant Pathogens using universal microarray，″Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，No.8e70)。PRI-锁(Pri-lock)探针为具有人工选择的独特引物对和通用的TaqMan探针区域的可环化的长寡核苷酸，侧翼是靶标互补区域(图12)。在这一研究中，表征了可环化的连接探针的定量能力，并且开发了高通量的、定量性多重诊断测定。

实施例4：多重定量靶标检测

多靶标的实时定量在OpenArray中进行。在纳升PCR阵列中，利用独特的引物对和通用的TaqMan探针使多重PLP连接后跟随单扩增(图13，14和15)。图13，14和15所示的结果显示，PRI-锁(Pri-lock)/OpenArray技术提供了高特异性、高水平的多重技术、通用的连接后下游处理。重要的是这一方法有灵活性而且易于适用。利用通用的TaqMan探针和定量多重技术进行高通量格式。

其它的实施方案

通过前面的描述，显而易见的是，可以对本文所述的发明做出改变和修饰以便其在各种用途和条件下的利用。这些实施方案也在所附权利要求书的范围内。

在本文任一变量定义中，列出元素的陈述包括作为任一单一元素或所列元素的组合(或亚组合)的变量的定义。本文的实施方案的陈述包括作为任一单一的实施方案或与任何其它的实施方案或其部分组合的实施方案。

本说明书中所提到的所有专利和出版物都通过引用的方式并入本文，如同每篇独立的专利和出版物被特别且单独指出通过引用的方式并入一样。下列的专利和专利申请可公开相关的主题，而且每一篇都在此通过引用全文并入：20070166743，20050153354，20050123974，20040235014，2004021421 1，20040053399，20030059822，20010014850，美国专利U.S.Patent 7,282,330，6,927,065，6,790,671，6,772,070，6,762,059，6,696,022，6,403,311，6,355,420，6,263,286，6,210,896，5,837,115，5,427,663，7,262,859，6,927,065，6,772,070，6,762,059，66,696，6,263,286以及20030180807和20030124716。

Claims

1.用于检测靶标分析物的系统，所述系统包含：

提供靶标特异性扩增的第一模块；

包含检测分析物存在或不存在的检测器的第二模块；

包含用于多核苷酸靶标特异性预扩增或扩增的器件的第三模块；以及

鉴定特异性分析物的检测器。

2.如权利要求1所述的系统，其中所述系统检测或鉴定一种或多种特异性分析物。

2.如权利要求1所述的系统，其中通过所述第一模块扩增后检测出分析物指示靶标分析物存在于所述样品中，以及不能检测出分析物指示靶标分析物不存在于所述样品中。

3.如权利要求1所述的系统，其中靶标特异性扩增发生在管、珠、孔、板、通道、管道、通孔、微阵列中或基片上。

4.如权利要求1所述的系统，其中所述第一模块包含温度控制器件。

5.如权利要求3所述的系统，其中扩增发生在通孔阵列中。

6.如权利要求1所述的系统，其中所述检测器检测靶标特异性多核苷酸。

7.如权利要求6所述的系统，其中所述多核苷酸为细菌、病毒、真菌或其它的病原体。

8.如权利要求7所述的系统，其中所述病原体多核苷酸选自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肺炎军团菌(Legionella pneumonia)、小隐孢子球菌(Cryptosporidium parvum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和炭疽杆菌(Bacillus anthracis)。

9.如权利要求1所述的系统，其中所述分析物为炭疽杆菌芽孢。

10.如权利要求7所述的系统，其中所述病原体为选自下述的植物病原体：露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)、疫霉菌(Phytophthora spp)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、根癌农杆菌(Agrobacterium tum)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum coc)和Cylindocladium spatif、大丽花轮枝菌(Verticillium dahlia)、albo-tric轮枝菌(Verticillium albo-tric)、立枯丝核菌AG 4-1(Rhizoctonia solani AG 4-1)、立枯丝核菌AG 2-2(Rhizoctonia solani AG 2-2)、G_proteob、胡萝卜欧文氏菌(Erwinea carot)、立枯丝核菌AG 4-2(Rhizoctonia solani AG 4-2)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

11.如权利要求1所述的系统，其中所述第一和第三模块相同或不同。

12.如权利要求1所述的系统，其中所述检测器检测病原体多核苷酸和/或病原体多肽。

13.如权利要求1所述的系统，其中所述病原体多肽在免疫测定中检测。

14.检测病原体的方法，其中所述方法使用权利要求1所述的系统。

15.检测和鉴定病原体的方法，所述方法包含：

(a)扩增样品中的靶标特异性多核苷酸；

(b)检测所述样品中的靶标特异性多核苷酸，其中检测出所述多核苷酸指示病原体存在，以及不能检测出所述多核苷酸指示所述病原体不存在于所述样品中；和

(d)鉴定所述靶标特异性多核苷酸，从而检测和鉴定所述病原体。

16.检测和鉴定病原体的方法，所述方法包含：

(a)扩增样品中的靶标特异性多核苷酸；

(b)检测所述靶标特异性多核苷酸，其中所述检测鉴定所述样品中所述多核苷酸的存在或不存在；

(d)扩增或预扩增所述靶标特异性多核苷酸；和

(e)鉴定所述靶标特异性多核苷酸，从而检测和鉴定所述病原体。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述多核苷酸选自霍乱弧菌、肺炎军团菌、小隐孢子球菌、金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌。

18.如权利要求15或16所述的方法，其中所述多核苷酸选自露湿漆斑菌、疫霉菌、致病疫霉、根癌农杆菌、北方根结线虫、辣椒炭疽病菌和Cylindocladium spatif、大丽花轮枝菌、albo-tric轮枝菌、立枯丝核菌AG 4-1、立枯丝核菌AG 2-2、G_proteob、胡萝卜欧文氏菌、立枯丝核菌AG 4-2和尖孢镰刀菌。

19.如权利要求15或16所述的方法，其中所述方法还包含检测病原体多肽。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述病原体多肽在免疫测定中检测。

21.如权利要求1-15中任一项所述的系统或方法，其中所述样品为环境样品。

22.如权利要求1-15中任一项所述的系统或方法，其中所述样品为空气样品、水样品或环境拭样。

23.检测系统网络，所述网络包含至少两个与计算机处理单元通讯的如权利要求1所述的检测系统。

23.如权利要求22所述的网络，其中所述检测系统提供了到所述计算机处理单元的关于病原体检测或鉴定的输入。

24.如权利要求22所述的网络，其中所述通讯经由无线通讯方法、以太网连接、WiFi、移动电话网络、无线电波、蓝牙、微波或红外线方法发生。

25.鉴定多种病原体的组合方法，所述方法包含：

(a)扩增样品中的靶标特异性多核苷酸；

(b)利用至少两种探针检测所述靶标特异性多核苷酸，所述探针的每一种都具有独特的可检测部分，其中至少两个部分的检测鉴定所述靶标特异性多核苷酸，从而检测和鉴定所述病原体。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述扩增在三个单独的PCR反应中进行并且使用三种染料来检测至少27种不同的靶标。