CN102796810B - 一种检测多种高致病性病原细菌的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测多种高致病性病原细菌的方法和试剂盒。具体地，本发明公开了一种同时检测多种高致病性病原细菌的方法，包括在聚合酶反应体系中，用特异性的针对高致病性病原菌的引物集进行PCR反应，从而获得扩增产物；以及用特异性探针或探针微球进行检测。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可灵敏、简便地检测和鉴定多种高致病性病原菌，其中包括：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。

Description

一种检测多种高致病性病原细菌的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及检测多种高致病性病原细菌的方法和试剂盒。
背景技术
引起突发传染病的病原体，在平时可造成烈性传染病爆发流行，在战时可作为生物武器。这些病原微生物主要分为六大类：病毒类、细菌类、立克次体类、衣原体类、支原体类和真菌类，主要的有40余种。炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)，鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，羊布鲁菌(Brucella mallei)，牛布鲁菌(Brucella abortus)，猪链球菌2(Streptococcus suis II)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，土拉弗菌(Francisella tularensis)，鼻疽假单胞菌(Burkholderia mallei)，类鼻疽假单胞菌(Burkholderia pseudomallei)，贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)等都是高致病性病原细菌。
目前，可能引起国内突发传染病(生物恐怖或生物突发事件)的细菌类病原体主要有：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肉毒梭菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、布鲁氏菌、猪链球菌、贝纳柯克斯体(属立克次体类)、嗜肺军团菌等。这些病菌对人的危害巨大，其中鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌属于甲类传染病致病菌，布鲁氏菌、炭疽芽胞杆菌属于乙类传染病致病菌，土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、猪链球菌、嗜肺军团菌也具有很强的致病性，严重时可以危及生命。
传统的检测方法为培养鉴定法，通过病菌培养后的外观和一些理化指标进行鉴定，耗时要二至五天时间，同时相对容易出现误判。后来兴起的分子鉴定法，利用链式聚合酶反应(PCR)对病菌的基因的脱氧核糖核酸(DNA)进行检测与鉴定。
分子鉴定法主要分为两类。
第一，对病菌的16S rRNA或23S rRNA基因基因检测和鉴定，一般是进行序列测定，即PCR-测序法，其中16S rRNA的检测应用最广泛；这种方法一般需要先对病菌进行分离培养，然后再进行分子鉴定，可靠性最高，鉴定最准确，不过耗时仍然很长。
第二，对病菌的特异性基因的DNA进行检测和鉴定，这种方法无需培养，大大缩短了检测时间，一般只需要几个小时就可以完成；但这种方法有一个缺点，即每次检测只能判断其是或不是某种病菌，然后进行另一次反应判断其是或不是另一种病菌，因此这个方法都有相应检测范围，即只能检出其检测范围内的病菌，假如要检测十种病菌就要进行十次反应，虽然这些反应可以依次，也可以平行进行，但总体来讲比较繁琐。
有人采用“PCR-固态芯片”的办法来进行分子检测，即先对病菌DNA进行PCR扩增，然后将能识别不同病菌序列的DNA探针按照一定的顺序和位置偶联在玻璃片、膜条等固态介质上构成DNA芯片，将PCR产物置于芯片上进行杂交和信号检测，提高了检测的通量，一次反应就能检测出多种病菌。不过，与其他固态芯片检测一样，受固态芯片自身缺陷所致，这种方法需要多次洗涤，过程仍显繁琐，同时灵敏度一般也不高，更重要的是重复性较差，检测质量不稳定。
综上所述，本领域尚缺乏令人满意的、能够同时检测多种高致病性病原菌的技术。因此，本领域迫切需要开发高灵敏度的、简便快捷的、高通量地检测多种高致病性病原菌的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏的、简便快捷的、高通量地检测多种高致病性病原菌的方法和试剂盒。
本发明的第一方面提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤：
(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少5种高致病性病原菌的扩增产物的特异性引物集，其中所述的高致病性病原菌选自：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
在另一优选例中，所述的反应体系中含有特异性扩增以下6、7、8、9或10种高致病性病原菌的扩增产物的特异性引物集：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括：
上游引物：所述上游引物含有SEQ ID NO.：1、24、25或26所示核苷酸序列；和
下游引物：所述下游引物含有SEQ ID NO.：2、27、28或28所示核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的扩增高致病性病原菌的特异性引物集包括：SEQ ID NO.：1、24、25或26所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO.：2、27、28或28所示核苷酸序列的下游引物。
在另一优选例中，所述聚合酶链式反应，还包括步骤：
(b)对步骤(a)获得的扩增产物用高致病性病原菌的特异性探针进行检测。
在另一优选例中，所述引物的5’末端标记生物素。
在另一优选例中，所述的特异性探针带有可检测标记。
在另一优选例中，所述的可检测标记包括：荧光团、荧光微球。
在另一优选例中，在步骤(b)还包括使用作为阴性对照的探针。较佳地，所述的阴性探针含有SEQ ID NO.：3所示的序列。
在另一优选例中，步骤(b)中用Luminex xMAP进行检测。
在另一优选例中，所述的探针的5’端或3’端具有NH2-间隔臂；或者所述的探针通过“-NH-间隔臂”结合于微球或固相载体。
在另一优选例中，所述的间隔臂选自下组：
(i)连续的脱氧胸腺嘧啶核苷即(dT)n，n＝10-15；
(ii)烷基链-(CH2)m-，m＝6-12；和
(iii)乙二醇己醚(HEG)。
在另一优选例中，在步骤(b)中，先进行扩增产物与探针的杂交反应，杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的SA，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。
本发明的第二方面提供了一种引物集，所述的引物集可特异性扩增至少5种高致病性病原菌的扩增产物，其中所述的高致病性病原菌选自：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括：
上游引物：所述上游引物含有SEQ ID NO.：1、24、25或26所示核苷酸序列；和
下游引物：所述下游引物含有SEQ ID NO.：2、27、28或28所示核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的引物集包括：SEQ ID NO.：1、24、25或26所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO.：2、27、28或28所示核苷酸序列的下游引物。
在另一优选例中，所述引物集是SEQ ID NO.：1和2构成的引物对。
本发明的第三方面提供了一种检测试剂盒，它包括：第一容器以及位于所述容器内本发明第二方面所述的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括：
上游引物：所述上游引物含有SEQ ID NO.：1、24、25或26所示核苷酸序列；和
下游引物：所述下游引物含有SEQ ID NO.：2、27、28或28所示核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括使用说明书。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。
在另一优选例中，所述的探针是针对炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌的特异性探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括可以被引物组合扩增但内部序列为其它非相关病原菌的外源核酸片段，以及包被有可以与这个外源核酸片段良好杂交的探针的微球，作为内参。
在本发明的第四方面，提供了本发明第二方面中所述的引物集的用途，它被用于制备检测高致病性病原菌的试剂盒。
在另一优选例中，所述的高致病性病原菌包括炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于同时检测5-50种(较佳地5-10种)高致病性病原菌。
在本发明的第五方面，提供了本发明第二方面所述的引物集或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，它用于体外非诊断地检测样品中是否存在高致病性病原菌。
在另一优选例中，用于检测在环境样品是否存在高致病性病原菌。
在本发明的第六方面，提供了一系列寡核苷酸片段，它们具有选自SEQ ID NO.1-29的核苷酸序列。所述的寡核苷酸可作为引物或探针。
在本发明的第七方面，提供了本发明上述特异性引物对和特异性探针的用途，它们被用于制备用于检测高致病性病原菌的试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过对多种高致病性病原菌的核酸序列的广泛而深入的研究，并经过大量筛选，首次确定了多种高致病性病原菌基因序列中相对保守的、且多病原菌检测时相互干扰较小的16s rRNA区域。针对所述区域不仅可以设计出特异性扩增多种高致病性病原菌的引物，还可设计出特异性探针。这样，在一次PCR反应中，通过检测探针的荧光信号，就可快速简便地鉴定多种高致病性病原菌(炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌)。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“高致病性病原菌”包括引起哺乳动物(如人)的疾病的病原菌，其中包括(但并不限于)：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
引物
如本文所用，术语“高致病性病原菌特异性引物”指这样的引物(对)，它的扩增产物具有高致病性病原菌保守的且各病原菌之间差异较大的16s rRNA基因区域的核苷酸序列。
如本文所用，术语“特异性引物”，指长度通常为18-28nt的寡核苷酸链，其与多种高致病性病原菌中一种病原体的基因组上16s rRNA基因的DNA序列(也称作16s rDNA)完全互补或者相同。
在一个优选例中，本发明人针对细菌16S rRNA基因设计了通用引物，能对全部所要检测的病原细菌的16S rRNA基因片段进行扩增。结果表明，该引物对可以同时扩增上述多种高致病性病原菌的核酸。所述引物对具有以下特点：
1.上下游引物所在的位置是细菌16S rRNA基因片段高度保守区域，所有要检测的病菌的16S rRNA基因在此位置的DNA序列都完全相同；
2.上下游引物之间间距，即扩增产物在150～200碱基对(bp)之间(因不同细菌的序列有差异，所以扩增产物长度不完全一样)，这样长度的PCR扩增效率高，其后与相应的探针杂交的效率也高，因此灵敏度较高；
3.上下游引物之间的序列是16S rRNA基因的可变区域，不同细菌之间差异极大，不同属(Genus)甚至不同种(Species)的细菌之间的序列都不相同，一般作为细菌分子鉴定的金标准；
4.引物对的两条或者其中一条5’末端可任选地标记有生物素(biotin)，其可以与亲和素(avidin)或链亲和素(streptavidin，SA)紧密结合，在后来检测时的起到信号放大、显示或标记等作用。
名称 序列 SEQ ID NO.：
Tg16sF 5’TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’ 1
Tg16sR 5’TATTACCGCGGCTGCTGG-3’ 2
*SEQ ID NO.：1-2所示引物较佳地在5’末端标记有生物素。
此外，上述上游和下游引物的衍生引物也可用于本发明。并且任一上游引物可与任一下游引物组合构成引物对。
其中，适用于本发明的上游引物还包括：
名称 序列 SEQ ID NO.：
Tg16sF1 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’ 24
Tg16sF2 5’-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 25
Tg16sF3 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’ 26
其中，适用于本发明的下游引物还包括：
名称 序列 SEQ ID NO.：
Tg16sR1 5’-TATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’ 27
Tg16sR2 5’-GTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’ 28
Tg16sR3 5’-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’ 29
探针
如本文所用，术语“高致病性病原菌特异性探针”指能够结合于高致病性病原菌的扩增产物，但不结合于其他无关的扩增产物的探针。更佳地，所述的高致病性病原菌特异性探针具有SEQ ID NO：4-23所示的核苷酸序列。
本发明的特异性探针带有可检测标记。所述的可检测标记的例子包括(但并不限于)：荧光团、荧光微球。
一种优选的可检测标记是荧光微球。利用Luminex xMAP法可方便地同时区分和检测多种不同的荧光微球。
Luminex xMAP是一个非常灵活的多功能技术平台。其原理是把微小的乳胶颗粒(Beads，简称为“微球”)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的探针或蛋白以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物(被测物可以是血清或样品中的核酸(如扩增产物)、抗原、抗体、或酶等)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)，所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。
在Luminex检测仪上，这些微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测PCR扩增产物的种类；另一束测定微球上PE的荧光强度，经数据处理得出被测的PCR扩增产物的含量。
关于Luminex xMAP的技术平台详细资料，请参见产品说明书或文献，(1)CancerChemotherapy and Pharmacology，51：321-327，(2)Journal of Immunological Methods，227：41-52；(3)WWW.luminexcorp.com。
探针微球集
本发明还提供了可用于检测多种高致病性病原菌的式I荧光微球和荧光微球集。
P-bead (I)
式中，“P”表示针对扩增产物的特异性探针，“bead”表示微球，“-”表示探针与微球之间的结合方式。
在本发明的一个优选例中，提供了一套检测多种高致病性病原菌的探针微球集。该探针微球集具有一个或多个以下特征：
1.它可包括10-50种不同的荧光编码微球；
2.其中一个微球上固定有一条不与任何一种病菌相关位置DNA序列相同的探针，其余的每种微球上固定有一种针对特定病菌的特异性核酸探针，每种探针在试剂盒描述的条件下仅能与对应的病菌的16s rRNA基因PCR扩增产物相结合，并且具有较强的结合能力，同时又不与其他任何病菌的产物结合；
3.为了与微球交联固定，探针的5’端均可标记有氨基。
4.为了减小空间位阻，5’端氨基和探针之间插入有间隔臂(spacer)，典型的间隔臂是连续的10至15个脱氧胸腺嘧啶核苷即dT，也可以是烷基链，如C6[即-(CH2)6-]或C12[即-(CH2)12-]，也可以是乙二醇己醚(HEG)，等等。
5.探针序列既可以是正向序列，也可以说其反向(互补)序列，探针的序列见下表(其中标记为2的探针是另一优选例，其序列是1的互补序列，可任选其一使用)：
*在SEQ ID NO.：3-23所述的探针的5’或3’端带有“NH2-间隔臂。
应理解，特异性探针与特异性引物匹配使用可用于检测相应的病原体。例如，当对炭疽芽胞杆菌进行检测时，选用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2作为引物进行PCR扩增，将SEQID NO：3或4作为探针进行检测。
参照物
本发明还提供了用于高致病性病原菌检测的标准参照物(质粒标准分子)。所述的标准参照物可以是高致病性病原菌DNA，或是含高致病性病原菌扩增目的片段的质粒DNA(质粒标准分子)。
检测方法
本发明还提供了用于同时检测多种高致病性病原菌的方法。包括步骤：用本发明的引物集进行扩增，以及用本发明的特异性探针(或探针微球)进行检测。
在本发明中，除了检测所针对的靶序列以及相应采用的引物(对)和探针等与现有技术不同之外，诸如从样品总抽提DNA、PCR扩增和荧光检测等步骤的条件可与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。当然，也可采用本申请实施例中所给出的优选条件。
例如，可用于本发明的DNA提取技术和方法没有特别的限制，可以是本领域应用较多、稳定性好、可靠性高的各种提取技术。
一种优选的方法是检测样本中是否存在多种高致病性病原菌的方法，所述的方法包括：
(I)使用本发明的引物集对标本抽提出的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
(II)将这些扩增产物与本发明上述的核酸探针微球集混合；
(III)检测微球上的核酸探针是否与扩增产物结合。
在另一优选例中，步骤(III)中的检测方法是Luminex xMAP。
本发明所称的杂交是PCR产物变性后和核酸探针微球集充分混合，在一定的条件下进行核酸的杂交。
本发明所称的信号标记是在杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的SA，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。
试剂盒
本发明还提供了可用于同时检测多种高致病性病原菌的检测试剂盒。
一般，本发明的试剂盒包括：第一容器以及位于所述容器内的本发明上述的引物集；和任选的说明书。
较佳地，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。
此外，本发明的试剂盒还可含有以下任选组分：PCR扩增试剂、核酸探针微球集、杂交试剂和信号标记试剂。
一种优选的可用于检测多种高致病性病原菌的试剂盒包括：容器以及位于容器内的PCR扩增试剂、引物组合(a)、核酸探针微球集(b)、杂交试剂和信号标记试剂。更佳地，还含有一个可以被引物组合扩增但内部序列为其它非相关病原菌的外源核酸片段，以及包被有可以与这个外源核酸片段良好杂交的探针的微球，作为内参或称阳性质控，以监控检测过程是否符合标准。
本发明的主要优点在于：
1、高通量，相对于普通的实时荧光定量PCR，本方法可以同时检测多达10种或更多种的病原菌。
2、高灵敏度，只用一对引物进行扩增，解决了多对引物多重PCR扩增时带来的灵敏度降低的问题。
3、操作简便，微球杂交及后续检测如果与Luminex xMAP技术配合使用时，杂交后可以直接上机读数，不需要像固态芯片一样反复洗涤多次。
4、检测时间短，不需要进行培养分离，只需要约3小时时间就可以完成检测。
5、结果稳定，重复性高，悬浮微球(又称液态芯片)杂交相对于固态芯片杂交可以提高杂交效率，每次检测是读取一百或更多颗微球上的信号后取中位数作为检测最终读数，相当于做了一百或更多次重复实验。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1高致病性病原菌的检测
一、探针微球包被：
1.按照下面的列表合成探针
注：间隔臂为10个T构成的poly(T)10-，故探针Ban-P1等于poly(T)10+SEQ ID NO.：3，探针Ype-P1等于poly(T)10+SEQ ID NO.：4，依此类推。
2.选取编号22、24、26、28、31、32、33、34、35、36和42号11种荧光编码微球【Luminex公司】，依次与上表中各探针对应进行探针的包被，方法如下：
(1)将各种微球和-20℃保存的一份EDC粉末置于室温下平衡30分钟；
(2)取各对应的探针用双蒸水溶解，浓度为0.01mM(10pmol/μL)；
(3)用振荡器将微球混合均匀；
(4)各取50ul(6.0×105)微球，放入预先标记号码的洁净的1.5ml离心管中；
(5)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，小心弃取上清液；
(6)加入100μl双蒸水，充分振荡悬浮微球，8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(7)弃去上清液，用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(8)每一种探针各自取2μl(10pmol/μL)加到上步骤中的对应的微球悬液中，用振荡器混匀；
(9)按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；
(10)取2.5μl上步骤的EDC溶液加入各微球悬液中(25μg或≈[0.5μg/μL]终浓度)，用振荡器混匀；
(11)避光，37℃静置30分钟；
(12)重复(10)-(11)步骤；
(13)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(14)弃去上清液，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(15)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(16)弃去上清液，用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(17)微球计数：
a.将连接好的微球悬液用水稀释50倍；
b.振荡器混匀；
c.取10μl到计数板上；
d.对四个角上的计数室内的微球计数；
e.计算微球悬液的浓度；
(18)将包被好的微球避光保存在2-10℃条件下。
3.芯片制备：
取等体积的上述包被有探针的微球进行混合，各种微球的终浓度为1.2×103个/μl，2-10℃条件下避光保存，即为检测炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肉毒梭菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌/类鼻疽假单胞菌、布鲁氏菌、猪链球菌、贝纳柯克斯体(属立克次体类)和嗜肺军团菌的液态芯片。
二、样本的制备
将1～15号来自疾控中心菌株、减毒株或灭活株标本，使用QIAGEN公司的QIAampDNA mini kit试剂盒，按说明书操作，所抽提产物直接用于PCR，如暂时不用，可于-20℃保存。
三、PCR扩增
1.按照如下的序列合成病菌检测PCR扩增的通用引物：
Tg16sF：5’-生物素-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(SEQ ID NO.：1)
Tg16sR：5’-生物素-TATTACCGCGGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO.：2)
2.混合引物工作液的配制：
(1)合成的每条引物配制成100μmol/L的储备液；
(2)分别取各引物储备液2μl加入同一容器中，加入双蒸水196μl补足体积到200μl，混合均匀为混合引物工作液；
3.PCR反应
反应体系：20μl
扩增程序：95℃5分钟→[95℃30秒、58℃1分钟、72℃1分钟]共40个循环→72℃5分钟→4℃保温.
四、探针杂交
1.取上述1-15号15份样本的PCR扩增产物各5μl至1-15号的洁净1.5ml离心管中，分别加入12μl TE缓冲液混匀后95℃变性5分钟，立即放在冰上5分钟；
2.分别加入33μl 1.5×杂交液(含11种微球，数量是2000个/种)，混匀，48℃杂交15分钟。
五、信号标记及检测
1、分别加入150μl内含有2ng/ml SA-PE的TE缓冲液，混匀，48℃保温5分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物；
2、使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
样本结果如下：
六、数据分析
依据本试剂盒判定规则判定上述1-15号样本的检测结果如下：
检测读数/阴性对照探针读数≥2.5为阳性(+)，
检测读数/阴性对照探针读数＜2.5为阴性(-)；
结果说明：
1号样本含肉毒梭菌；
2号样本含肉毒梭菌；
3号样本含土拉弗菌；
4号样本含鼠疫耶氏菌；
5号样本含霍乱弧菌；
6号样本含布鲁氏菌；
7号样本含猪链球菌；
8号样本含炭疽芽孢杆菌；
9号样本含鼻疽或类假单胞菌；
10号样本含贝纳柯克斯体；
11号样本含嗜肺军团菌；
12号样本含贝纳柯克斯体和嗜肺军团菌；
13号样本含肉毒梭菌和猪链球菌；
14号样本不含所检测病菌；
15号样本不含所检测病菌。
这些检测结果与各样品的实际所含的病原菌品种完全一致。
实施例2
一、探针微球包被：
1.按照下面的列表合成探针
注：间隔臂为-HEG-。
2.选取编号22、24、26、28、31、32、33、34、35、36和42号11种荧光编码微球【Luminex公司】，依次与上表中各探针对应进行探针的包被，方法如下：
(1)将各种微球和-20℃保存的一份EDC粉末置于室温下平衡30分钟；
(2)取各对应的探针用双蒸水溶解，浓度为0.01mM(10pmol/μL)；
(3)用振荡器将微球混合均匀；
(4)各取50μl(6.0×105)微球，放入预先标记号码的洁净的1.5ml离心管中；
(5)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，小心弃取上清液；
(6)加入100μl双蒸水，充分振荡悬浮微球，8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(7)弃去上清液，用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(8)每一种探针各自取2μl(10pmole/μL)加到上步骤中的对应的微球悬液中，用振荡器混匀；
(9)按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；
(10)取2.5μl上步骤的EDC溶液加入各微球悬液中(25μg or≈[0.5μg/μL]final)，用振荡器混匀；
(11)避光，37℃静置30分钟；
(12)重复(10)-(11)步骤；
(13)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(14)弃去上清液，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(15)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(16)弃去上清液，用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(17)微球计数：
a.将连接好的微球悬液用水稀释50倍；
b.振荡器混匀；
c.取10μl到计数板上；
d.对四个角上的计数室内的微球计数；
e.计算微球悬液的浓度；
(18)将包被好的微球避光保存在2-10℃条件下。
3.芯片制备：
取等体积的上述包被有探针的微球进行混合，各种微球的终浓度为1.2×103个/μl，2-10℃条件下避光保存，即为检测炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肉毒梭菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌/类鼻疽假单胞菌、布鲁氏菌、猪链球菌、贝纳柯克斯体(属立克次体类)和嗜肺军团菌的液态芯片。
二、样本的制备
将16～27号疾控中心菌株、减毒株或灭活株标本，使用QIAGEN公司的QIAamp DNAmini kit试剂盒，按说明书操作，所抽提产物直接用于PCR，如暂时不用，可于-20℃保存。
三、PCR扩增
1.按照如下的序列合成病菌检测PCR扩增的通用引物：
Tg16sF：5’-生物素-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(SEQ ID NO.：1)
Tg16sR：5’-生物素-TATTACCGCGGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO.：2)
2.混合引物工作液的配制：
(1)合成的每条引物配制成100μmol/L的储备液；
(2)分别取各引物储备液2μl加入同一容器中，加入双蒸水196μl补足体积到200μl，混合均匀为混合引物工作液；
3.PCR反应
反应体系：20μl
扩增程序：95℃ 5分钟→[95℃ 30秒、58℃ 1分钟、72℃ 1分钟]共40个循环→72℃ 5分钟→4℃保温。
四、杂交
1.取上述1-15号15份样本的PCR扩增产物各5μl至16～27号的洁净1.5ml离心管中，分别加入12μl TE缓冲液混匀后95℃变性5分钟，立即放在冰上5分钟；
2.分别加入33μl 1.5×杂交液(含11种微球，数量是2000个/种)，混匀，48℃杂交15分钟。
五、信号标记及检测
1、分别加入150ul内含有2ng/ml SA-PE的TE缓冲液，混匀，48℃保温5分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物；
2、使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
样本结果如下
六、数据分析
依据本试剂盒判定规则判定上述1-15号样本的检测结果如下：
检测读数/阴性对照探针读数≥2.5为阳性(+)，
检测读数/阴性对照探针读数＜2.5为阴性(-)；
结果说明
16号样本含猪链球菌；
17号样本含贝纳柯克斯体；
18号样本含鼠疫耶氏菌；
19号样本含炭疽芽孢杆菌；
20号样本含猪链球菌；
21号样本含土拉弗菌；
22号样本含布鲁氏菌；
23号样本含鼻疽或类假单胞菌；
24号样本含霍乱弧菌；
25号样本含嗜肺军团菌；
26号样本含肉毒梭菌；
27号样本含土拉弗菌。
这些检测结果与各样品的实际所含的病原菌品种完全一致。
实施例3高致病性病原菌的检测
重复实施例2，不同点在于，用28和29号样本替换样本16-27。其中，将1号和16号样本合并，作为28号样品。将3号和25号样本合并，作为29号样品。
检测结果表明，28号样品含有肉毒梭菌和猪链球菌；29号样品含有土拉弗菌和嗜肺军团菌。检测结果与样品实际情况相符。
实施例4高致病性病原菌的检测
重复实施例2，不同点在于，用SEQ ID NO.：24替换SEQ ID NO.：1作为上游引物。
检测结果与实施例2的结果完全相同。
实施例5高致病性病原菌的检测
重复实施例2，不同点在于，用SEQ ID NO.：25替换SEQ ID NO.：1作为上游引物，并且用SEQ ID NO.：27替换SEQ ID NO.：2作为下游引物。
检测结果与实施例2的结果完全相同。
实施例6
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中的以下引物：
Tg16sF：5’-生物素-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(SEQ ID NO.：1)
Tg16sR：5’-生物素-TATTACCGCGGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO.：2)
(b)使用说明书。
与相应的针对高致病性病原菌的特异性探针配合使用，该试剂盒可用于同时检测多种高致病性病原菌：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
实施例7
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中序列如SEQ ID NO.：1-2所述的引物：
(b)第二容器，以及位于该容器中的实施例1中制备的分别带有特异性探针SEQ IDNO.：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22的荧光微球；
(c)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测多种高致病性病原菌：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
实施例8
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中序列如SEQ ID NO.：24和27所述的引物：
(b)第二容器，以及位于该容器中的实施例2中制备的分别带有特异性探针SEQ IDNO.：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的荧光微球；
(c)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测多种高致病性病原菌：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
实施例9
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中序列如SEQ ID NO.：24和27所述的引物：
(b)使用说明书。
与SEQ ID NO.：3、5、7、9所示的探针配合使用时，该试剂盒可用于同时检测4种高致病性病原菌。
实施例10
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中序列如SEQ ID NO.：24和27所述的引物：
(b)第二容器，以及位于该容器中的实施例2中制备的分别带有特异性探针SEQ IDNO.：13、15、17、19、21、23的荧光微球；
(c)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测以下多种高致病性病原菌：猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (24)

1.一种非治疗非诊断性的聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤：
(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少5种高致病性病原菌的扩增产物的特异性引物集，其中所述的高致病性病原菌选自：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌，
其中所述特异性引物集包括：
上游引物：所述上游引物选自下组：SEQ ID NO.:1、24、25或26所示核苷酸序列；和下游引物：所述下游引物选自下组：SEQ ID NO.:2、27、28或29所示核苷酸序列；
(b)对步骤(a)获得的扩增产物用高致病性病原菌的特异性探针进行检测，
其中所述特异性探针选自下组：SEQ ID NO.:4-23所示的核苷酸序列，并且所述特异性探针用于检测上述的至少5种高致病性病原菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高致病性病原菌包括类鼻疽假单胞菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增高致病性病原菌的特异性引物集包括：SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的下游引物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
在步骤(b)中，所述的特异性探针包括以下所示的正向序列探针或反向序列探针：
5.如权利要求4所示的方法，其特征在于，所述的探针的5’端或3’端具有NH2-间隔臂；或者所述的探针通过“-NH-间隔臂”结合于微球或固相载体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中含有特异性扩增以下6、7、8、9或10种高致病性病原菌的扩增产物的特异性引物集：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物集包括：
上游引物：所述上游引物选自下组：SEQ ID NO.:1、24、25或26所示核苷酸序列；和
下游引物：所述下游引物选自下组：SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物的5’末端标记生物素。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的特异性探针带有可检测标记。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记包括：荧光团、荧光微球。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)还包括使用作为阴性对照的探针。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的阴性探针选自下组：SEQ ID NO.:3所示的序列。
14.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中用Luminex xMAP进行检测。
15.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的间隔臂选自下组：
(i)连续的脱氧胸腺嘧啶核苷即(dT)n，n＝10-15；
(ii)烷基链-(CH2)m－，m＝6-12；和
(iii)乙二醇己醚(HEG)。
16.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，先进行扩增产物与探针的杂交反应，杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的链亲和素(streptavidin，SA)，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。
17.一种组合，所述组合由引物集和探针集组成，其特征在于，所述的引物集可特异性扩增至少5种高致病性病原菌的扩增产物，其中所述的高致病性病原菌选自：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌，
其中所述引物集包括：
上游引物：所述上游引物选自下组：SEQ ID NO.:1、24、25或26所示核苷酸序列；和下游引物：所述下游引物选自下组；SEQ ID NO.:2、27、28或29所示核苷酸序列；
其中所述探针集包括：SEQ ID NO.:4-23所示的核苷酸序列，并且所述探针用于检测上述的至少5种高致病性病原菌。
18.如权利要求17所述的组合，其特征在于，所述的引物集包括：
上游引物：所述上游引物选自下组：SEQ ID NO.:1、24、25或26所示核苷酸序列；和
下游引物：所述下游引物选自下组：SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列。
19.如权利要求17所述的组合，其特征在于，所述的引物集包括：SEQ ID NO.:25所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的下游引物。
20.如权利要求17所述的组合，其特征在于，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
21.如权利要求17所述的组合，其特征在于，所述引物集是SEQ ID NO.:1和2构成的引物对。
22.一种检测试剂盒，其特征在于，它包括：
第一容器以及位于所述容器内的引物集；所述的引物集可特异性扩增至少5种高致病性病原菌的扩增产物，其中所述的高致病性病原菌选自：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌，并且所述引物集包括：上游引物：所述上游引物选自下组：SEQ ID NO.:1、24、25或26所示核苷酸序列；和下游引物：所述下游引物选自下组：SEQ ID NO.:2、27、28或29所示核苷酸序列；和
第二容器以及位于所述容器内的核酸探针，其中所述特异性探针选自下组：SEQ IDNO.:4-23所示的核苷酸序列；所述特异性探针用于检测上述的至少5种高致病性病原菌。
23.如权利要求22所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于体外非诊断地检测样品中是否存在高致病性病原菌。
24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，用于检测在环境样品是否存在高致病性病原菌。
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