CN1397649A - 基于16S rDNA基因种专一序列的临床常见病原菌诊断的生物芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于16S rDNA基因种专一序列的病原菌诊断的生物芯片。包括固相载体和点载在固相载体上的500－800条寡聚核苷酸。所述及的寡聚核苷酸为基于病原菌的16S rDNA基因种专一序列，包括130种呼吸道、消化道及泌尿生殖道临床常见病原菌以及临床样品中常见的非致病菌16S rDNA基因片段。可用于呼吸道、消化道和泌尿生殖道130余种临床常见原菌引起的传染性疾病的诊断。本发明的基因芯片为一种规模大、集成度高、涵盖面广的临床诊断芯片。具有诊断周期短、操作简单、结果可靠、自动化程度高等优点，易于在临床中推广应用。

Description

基于16S rDNA基因种专一序列的临床常见病原菌诊断的生物芯片

技术领域

本发明涉及一种医学临床诊断用的DNA芯片，特别是基于16S rDNA种特异序列的用于临床常见致病细菌的诊断芯片。

背景技术。

目前临床上对细菌引起的疾病的诊断，主要依据患者病灶所在的部位、症状，以及对临床标本中的细菌经分离培养后，通过形态、生化、免疫学等方法进行检验分析，最终确诊病原菌的种类。该方法的鉴定周期较长，尤其对于生长缓慢的病原微生物(如：结核分枝杆菌(Mycrobacterium tuberculosis))、以及难以培养的病原微生物(如：厌氧微生物(anaerobic bacteria))。

16S rDNA基因编码细菌16S核糖体RNA，长度约为1600个碱基。由于核糖体的重要生理功能使得16S rDNA序列中有较多的高度保守的片段，通过分析可以找出每种病原菌的种专一序列片段；同时，也容易设计引物对各种细菌的16S rRNA序列进行扩增，在DNA数据库中，16SrDNA序列的所涵盖的物种数量是最多的。1992年Wisotzkey等采用16SrDNA序列分析，对芽孢杆菌属的几种进行了分类研究(Wisotzkey，J.D.，Jurtshuk，P.JR.，Fox，G.E.，et al，1992.Comparative sequence analyses on the16S rRNA(rDNA)of Bacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，andBacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillus gen.nov.Int.J.System.Bacteriol，Vol.42(2)：263-269.)该研究以及同类的研究表明，16S rDNA基因用于细菌的定种鉴别是科学和可靠的。依据16S rDNA基因序列进行细菌种类鉴定虽然有准确性高和快速等优点，但是也存在操作步骤多，涉及多种昂贵的仪器设备、难以实现自动化等缺点，尤其是测序这一环节，多数医院无法独立完成，而大量样品的委托测序，由于样品、报告交接等中间环节的增加，使诊断周期以及准确性等受到较大的影响。

1997年7月Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.(Encinitas，CA)；Mack；David(Menlo Park，CA)；Chee；Mark S.(Palo Alto，CA)；Bemo；Anthony J.(San Jose，CA)；Stryer；Lubert(Stanford，CA)；Ghandour；Ghassan(Atherton，CA)；Wang；等人公布了US6,228,575号专利，发明了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。由于DNA芯片的高度集成性，使其具有灵敏度高、速度快和通量高等优点。

因此，如果将生物芯片技术与基因型细菌鉴定技术相结合，可以形成一个准确性高、高灵敏、快速和高通量同时所需的设备条件又大大简化的技术平台，为基因型菌种鉴定技术的实际应用铺平了道路。

1994年12月美国AMOCO CORP公司的PELLETIER DALE A；；WEISBURG WILLIAM G等人公布了WO9428174号专利，发明了一组核酸探针可以专一的检测军团菌属的病原菌。该专利的核酸探针是根据军团菌(Legionella)的16S和23S核糖体RNA序列设计的。

Harmsen等人2002年报导，根据16S rRNA序列设计的17条16-20个碱基的寡聚核苷酸探针，可以分析人体肠道内的六组厌氧微生物，包括：Phascolarctobacterium，Veillonella，Eubacterium hallii，Lachnospira，Eubacterium cylindroides，Ruminococcus等(Harmsen，H.J.M.，Raangs，G.C.，He，T.，et al.，2002.Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection ofbacteria in Human feces.Appl.Environ.Microbiol.，Vol.68(6)：2982-2990)。

以上两个例子充分说明了基于种专一序列的DNA芯片技术用于细菌种的鉴定的可行性及优势。

但是，目前应用DNA芯片技术进行细菌种的鉴定的工作仍停留在实验室阶段，一般芯片的规模较小，只能用于检测有限的几种或特定的一类细菌。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种基于16S rDNA基因种专一序列的病原菌诊断的生物芯片，以克服现有技术存在的规模小、集成度低、涵盖面狭和不易在临床中推广应用的缺陷。

本发明的技术方案：

本发明的芯片包括固相载体和点载在固相载体上的500-800条寡聚核苷酸，构成中低密度DNA微矩阵，优选的固相载体为玻片。

所述及的寡聚核苷酸为基于病原菌16S rDNA基因的种专一序列，包括130余种呼吸道、消化道及泌尿生殖道临床常见病原菌以及临床样品中常见的非致病菌16S rDNA基因片段。

上述的寡聚核苷酸是通过对所有病原细菌的16S rDNA序列的比对分析而获得的，每种病原菌获得5-10条特有的16-20个碱基的候选短序列，经进一步杂交检验后，最终每种病原菌确定4条特有序列，称为“种专一序列”。

所述及的病原菌包括132种常见病原细菌，分别为46种消化道病原细菌，66种呼吸道病原细菌，20种泌尿生殖道病原细菌。

所述及的肠道病原细菌(gastrointestinal infectious agents)包括：副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi、薛氏沙门氏菌SalmonellaSchottmuelleri、斯坦利沙门氏菌Salmonella Stanley、德尔比沙门氏菌Salmonella Derby、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium、海德尔堡沙门氏菌Salmonella Heidelbeg、猪霍乱沙门氏菌SalmonellaHirschfeldii、猪霍乱沙门氏菌Salmonella Choleraesuis、昆氏沙门氏菌Salmonella kunzondolf、汤普森沙门氏菌Salmonella Thompson、波茨坦沙门氏菌Salmonella Potsdam、纽波特沙门氏菌Salmonella Newport、病牛沙门氏菌Salmonella bovis-morbificans、仙台沙门氏菌Salmonellasandai、伤寒沙门氏菌Salmonella typhi、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis、都柏林沙门氏菌Salmonella Dublin、鸡沙门氏菌Salmonellagallinarum、鸭沙门氏菌Salmonella anatum、火鸡沙门氏菌Salmonellameleagridi s、纽因吞沙门氏菌Salmonella Newington、森夫顿堡沙门氏菌Salmonella senftenberg、阿柏丁沙门氏菌Salmonella Aberdeen、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae、弗氏志贺氏菌Shigella flexneri、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii、索氏志贺氏菌Shigella sonnei、产肠毒素的大肠杆菌ETEC：enterotoxigenic E.Coli、侵袭肠粘膜的大肠杆菌EIEC：enteroinvasive E.Coli、致肠病的大肠杆菌EPEC：enteropathogenic E.Coli、肠出血性大肠杆菌EHEC：enterohemorrhagic E.Coli、肠聚集性大肠杆菌EaggEC：enteroaggregative E.Coli、霍乱弧菌O1 Vibrio choleraeO1、霍乱弧菌O139 Vibrio cholerae O139、副溶血弧菌Vibrioparahemolyticus、小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersinia enterocolitica、空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni、气单胞菌Aeromonas、邻单胞菌plesiomonas、产气荚膜梭菌Clostridium perfringens、肉毒梭菌Clostridiumbotulinum、艰难梭菌Clostridium difficile、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生利斯特氏菌Listeriamonocytogenes和拟杆菌属Bacteroides；

所述及的呼吸道病原菌包括：

结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis、白喉棒杆菌Corynebacterium diphtheriae、博德特氏菌Bordetella、葡萄球菌Staphylococcus、链球菌Streptococcus、肺炎链球菌Streptococcuspneumonia、脑膜炎奈瑟氏球菌Neisseria meningitids、粘膜炎布兰汉氏球菌B.Catarrhalis、大肠杆菌E.Coli、铜绿假单细胞菌Pseudomonasaeruginosa、流感嗜血菌Haemophilus influenzae、侵肺军团菌Legionellapneumop、鼠疫耶尔森氏菌Yersinia pestis、枝原体Mycoplasma、布鲁氏菌Brucella、拟杆Bacteroid、普雷沃氏菌Prevotella、卟啉单胞菌Porphyromonas、梭杆菌Fusobacterium、韦荣氏球菌Veillon、消化链球菌peptostreptococcus、炭疽芽孢杆菌Bacillu anthracis、弗朗西丝氏菌Francisella、变形菌Proteus、伯氏考克斯氏体C.Bumetii、砂眼衣原体Chlamydia trachomatis、肺炎衣原体Chlamydia pneumoniae、鹦鹉热衣原体Chlamydia psittaci、赘生物隐球菌Cryptococcus neoformans、白色念珠菌Candid、荚膜组织胞浆菌Histoplasma capsulatum、曲霉菌Aspergillus和突网脊肺囊虫病Pneumocystosis carinii；

所述及的尿道病原菌包括：

埃希氏菌Escherichia、肠杆菌Enterobacter、克雷伯氏菌Klebsiella、柠檬酸杆菌Citrobacter、沙雷氏菌Serratia、假单胞菌Pseudomonas、变形菌Proteus、嗜血菌Haemophilus、利斯特氏菌Listeria、葡萄球菌StaphyloCOccus、链球菌Streptococcus、淋病奈瑟氏球菌Neisseria gonorrhoeae、苍白密螺旋体Treponema pallidum、砂眼衣原体Chlamydia trachomatis、肉芽肿鞘杆菌Calymmatobacterium granulomatis、解脲脲枝原体Ureaplasma urealyticum、拟杆菌Bacteroides、消化球菌Peptococcus和消化链球菌Peptostrptococcus、白色念珠菌Candidaalbicans。

本发明的基因芯片可用于呼吸道、消化道和泌尿生殖道临床常见的130余中病原菌引起的传染性疾病的诊断。

本发明的基因芯片在临床应用时应当对临床样品进行预处理。

由于本发明的基因芯片点载了基于病原菌16S rDNA基因种专一序列，为一种规模大、集成度高、涵盖面广的临床诊断芯片，可以检测呼吸道、消化道和泌尿生殖道临床常见的130余中病原菌。具有操作简单、诊断周期短，结果可靠、自动化程度高等优点，易于在临床中推广应用。

附图说明

图1为本发明的芯片的外形图。

图2为芯片点样区构成图。

图3为芯片杂交后的局部信号图。

具体实施方式

由图1可见，本发明的芯片以60.0毫米×20.0毫米(厚1.2毫米)的玻片1为固相载体，将500-800条寡聚核苷酸点在玻片上10毫米×10毫米的点样区2中，从而构成中低密度DNA微矩阵。

由图2可见，在固相玻片载体的点样区2分成三个区，分别为呼吸道病原菌中专一序列区201，消化道病原菌中专一序列区202，泌尿生殖道病原菌的种专一序列区203。每区内病原菌的种专一序列依次排列。

实施例1

临床样品的预处理方法：

从采集的临床样品中，取样0.5毫升，加入1毫升样品预处理缓冲液，混匀，37℃保温10分钟。冰上冷却5分钟，4℃，12,000转/分钟离心10分钟；取上清，加入预冷的5M NaAc(pH4.8)100微升，混匀；加入-20℃预冷的无水乙醇2.75毫升，混匀。

样品与处理缓冲液成分：

100mM Tri(pH8.0)，100mM EDTA(pH8.0)，

100mM NaCl，1％PVP，2％SDS。

-70℃放置30分钟。4℃、12000转/分钟离心10分钟，弃上清。70％乙醇洗涤，12000转/分钟离心10分钟，弃上清，室温干燥，最后向总DNA中加入20微升10mM的Tris-EDTA(pH8.0)溶解后，4℃保存。然后采用本领域公知的方法经PCR扩增并同时完成Cy-3或Cy-5荧光标记或Biotin标记后，与点载在玻片上的基因进行杂交，结果如图3所示，在图3中，箭头示两个信号点，上面的信号为阳性信号，下面的是阴性信号。

由于种专一序列在芯片上排列规律决定每种病原菌有其独特的杂交图谱，临床诊断时可根据特定区域内的特定杂交谱确诊致病菌的种类。

Claims (11)

1.一种基于16S rDNA基因种专一序列的病原菌诊断的生物芯片，包括固相载体，其特征在于包括点载在固相载体上的500-800条寡聚核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述及的寡聚核苷酸片段为基于病原菌的16S rDNA基因种专一序列，包括呼吸道、消化道及泌尿生殖道临床常见病原菌以及临床样品中常见的非致病菌16SrDNA基因片段。

3.根据权利要求2所述的生物芯片，其特征在于所述及的的寡聚核苷酸片段是通过对所有病原菌的16S rDNA基因序列的比对分析而获得的，每种病原菌获得5-10条该细菌特有的16-20个碱基的候选短序列，经进一步杂交检验后，最终每种病原菌确定4条特有序列，称为“种专一序列”。

4.根据权利要求3所述的生物芯片，其特征在于固相载体的点样品区内分成呼吸道病原菌中专一序列区(201)，消化道病原菌中专一序列区(202)，泌尿生殖道病原菌的种专一序列区(203)，区内病原菌的种专一序列依次排列。

5.根据权利要求2、3或4所述的生物芯片，其特征在于所述及的病原菌包括130种常见病原细菌，分别为46种消化道病原细菌，66种呼吸道病原细菌，20种泌尿生殖道病原细菌。

6.根据权利要求5所述的生物芯片，其特征在于所述及的肠道病原细菌包括：副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi、薛氏沙门氏菌Salmonella Schottmuelleri、斯坦利沙门氏菌Salmonella Stanley、德尔比沙门氏菌Salmonella Derby、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium、海德尔堡沙门氏菌Salmonella Heidelbeg、猪霍乱沙门氏菌SalmonellaHirschfeldii、猪霍乱沙门氏菌Salmonella Choleraesuis、昆氏沙门氏菌Salmonella kunzondolf、汤普森沙门氏菌Salmonella Thompson、波茨坦沙门氏菌Salmonella Potsdam、纽波特沙门氏菌Salmonella Newport、病牛沙门氏菌Salmonella bovis-morbificans、仙台沙门氏菌Salmonellasandai、伤寒沙门氏菌Salmonella typhi、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis、都柏林沙门氏菌Salmonella Dublin、鸡沙门氏菌Salmonellagallinarum、鸭沙门氏菌Salmonella anatum、火鸡沙门氏菌Salmonellameleagridi s、纽因吞沙门氏菌Salmonella Newington、森夫顿堡沙门氏菌Salmonella senftenberg、阿柏丁沙门氏菌Salmonella Aberdeen、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae、弗氏志贺氏菌Shigella flexneri、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii、索氏志贺氏菌Shigella sonnei、产肠毒素的大肠杆菌ETEC：enterotoxigenic E.Coli、侵袭肠粘膜的大肠杆菌EIEC：enteroinvasive E.Coli、致肠病的大肠杆菌EPEC：enteropathogenic E.Coli、肠出血性大肠杆菌EHEC：enterohemorrhagic E.Coli、肠聚集性大肠杆菌EaggEC：enteroaggregative E.Coli、霍乱弧菌O1 Vibrio choleraeO1、霍乱弧菌O139 Vibrio cholerae O139、副溶血弧菌Vibrioparahemolyticus、小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersinia enterocolitica、空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni、气单胞菌属Aeromonas、邻单胞菌属plesiomonas、产气荚膜梭菌Clostridium perfringens、肉毒梭菌Clostridiumbotulinum、艰难梭菌Clostridium difficile、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生利斯特氏菌Listeriamonocytogenes和拟杆菌Bacteroides；

7.根据权利要求5所述的生物芯片，其特征在于所述及的呼吸道病原菌包括：结合分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis、白喉棒杆菌Corynebacterium diphtheriae、博德特氏菌Bordetella、葡萄球菌Staphylococcus(32 species)、链球菌属Streptococcus、肺炎链球菌Streptococcus pneumonia、脑膜炎奈瑟氏球菌Neisseria meningitids、粘膜炎布兰汉氏球菌B.Catarrhalis、大肠杆菌E.Coli、铜绿假单细胞菌Pseudomonas aeruginosa、流感嗜血菌Haemophilus influenzae、侵肺军团菌Legionella pneumop、鼠疫耶尔森氏菌Yersinia pestis、枝原体Mycoplasma、布鲁氏菌brucella、拟杆菌Bacteroid、普雷沃氏菌Prevotella、卟啉单胞菌Porphyromonas、梭杆菌Fusobacterium、韦荣氏球菌Veillon、消化链球菌peptostreptococcus、炭疽芽孢杆菌Bacilluanthracis、弗朗西丝氏菌Francisella、变形菌属Proteus、伯氏考克斯氏体C.Bumetii、砂眼衣原体Chlamydia trachomatis、肺炎衣原体Chlamydiapneumoniae、鹦鹉热衣原体Chlamydia psittaci、赘生物隐球菌Cryptococcusneoformans、白色念珠菌Candid、荚膜组织胞浆菌Histoplasmacapsulatum、曲霉菌Aspergillus和突网脊肺囊虫病Pneumocystosiscarinii。

8.根据权利要求5所述的生物芯片，其特征在于所述及的尿道病原菌包括：埃希氏菌Escherichia、肠杆菌Enterobacter、克雷伯氏菌Klebsiella、柠檬酸杆菌Citrobacter、沙雷氏菌Serratia、假单胞菌Pseudomonas、变形菌Proteus、嗜血菌Haemophilus、利斯特氏菌Listeria、葡萄球菌StaphyloCOccus、链球菌Streptococcus、淋病奈瑟氏球菌Neisseria gonorrhoeae、苍白密螺旋体Treponema pallidum、砂眼衣原体Chlamydia trachomatis、肉芽肿鞘杆菌Calymmatobacterium granulomatis、解脲脲枝原体Ureaplasma urealyticum、拟杆菌Bacteroides、消化球菌Peptococcus和消化链球菌Peptostrptococcus、白色念珠菌Candidaalbicans。

9.根据权利要求4～8任一项所述的生物芯片的应用，其特征在于用于呼吸道、消化道和泌尿生殖道临床常见的病原菌的诊断。

10.根据权利要求9所述的生物芯片的应用，其特征在于基因芯片在临床应用时对临床样品进行预处理。

11.根据权利要求10所述的生物芯片的应用，其特征在于，临床样品的预处理包括如下步骤：

在临床样品中样品预处理缓冲液，使其pH值为7.5-8.5，37℃保温10分钟，冷却至4℃，离心分离；取上清，加入预冷的5M NaAc(pH4.8)100微升，混匀；加入-20℃乙醇2.75毫升，混匀，-70℃放置30分钟，4℃、离心分离，弃上清，70％乙醇洗涤，离心分离，弃上清，室温干燥，最后向总DNA中加入20微升10毫摩尔的Tris-EDTA(pH8.0)缓冲液，待DNA溶解后，4℃保存备用。

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