CN105401221A - 一种检测海洋环境拟杆菌群落的基因芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测海洋环境拟杆菌群落的基因芯片及应用，即可平行、快速、高通量的检测海洋环境拟杆菌群落，使基因芯片技术更好的应用于海洋环境监测。本发明的基因芯片，包括有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测海水中的拟杆菌群落的探针。本发明芯片所使用的探针可以快速、高通量地对海水中的拟杆菌群落进行检测，最大可以检测13个科的拟杆菌信息，从而为海洋环境细菌群落的监测提供了有力的技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测海洋环境拟杆菌群落的基因芯片及应用。
背景技术
国家海洋经济快速发展引发海洋环境安全问题，海洋环境监测是保护海洋生态环境可持续健康发展的重要环节。海洋环境监测包括化学监测和生物监测。生物监测主要是对海洋环境中的浮游生物、底栖生物、潮间带生物、游泳动物、大肠杆菌等生物种类组成和数量分布进行监测，缺少对海洋细菌群落的监测。微生物群落在海洋生态系统中发挥着重要的作用，参与物质和能量循环。细菌作为一类多样性最高的生命形式，在海洋环境中承担着重要的生态功能(碳循环，氮循环，硫循环，磷循环和金属循环等)。细菌复杂的群落结构、功能、相互作用和动态变化对海洋生态功能的维持有着重要意义。微生物群落对环境变化响应快速，对污染具有指示作用。因此，增加对海洋环境各个细菌种类组成和数量分布的监测，对建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系来说十分必要。
目前针对海洋大肠杆菌的监测主要是利用传统的分离培养方法。这种监测方法繁琐、耗时、耗力，不适合对多种细菌同时进行监测。亟需发展高通量、高效、便捷的海洋细菌群落监测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测海洋环境拟杆菌群落的基因芯片及应用，即可平行、快速、高通量的检测海洋环境拟杆菌群落，使基因芯片技术更好的应用于海洋环境监测，以弥补现有检测技术的不足。
本发明的基因芯片，包括有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测海水中的Saprospiraceae菌、Sphingobacteriaceae菌、Rhodothermacea菌、Prevotellaceae菌、Cryomorphaceae菌、Porphyromonadaceae菌、Cytophagaceae菌、Flavobacteriaceae菌、Marinilabiacea菌、Flammeovirgaceae菌、Cyclobacteriaceae菌、Chitinophagaceae菌、Bacteroidaceae菌的探针；
其中用于检测Saprospiraceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:1-3中的任一种或几种；
其中用于检测Sphingobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:4-5中的任一种或几种；
其中用于检测Rhodothermacea菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:6-7中的任一种或几种；
其中用于检测Prevotellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:8-9中的任一种或几种；
其中用于检测Cryomorphaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:10-11中的任一种或几种；
其中用于检测Porphyromonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:12-14中的任一种或几种；
其中用于检测Cytophagaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:15-17中的任一种或几种；
其中用于检测Flavobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:18-20中的任一种或几种；
其中用于检测Marinilabiaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:21-22中的任一种或几种；
其中用于检测Flammeovirgaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:23-24中的任一种或几种；
其中用于检测Cyclobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:25-27中的任一种或几种；
其中用于检测Chitinophagaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:28-29中的任一种或几种；
其中用于检测Bacteroidaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:30-32中的任一种或几种；
在本发明的基因芯片上还固定有杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探针、表面化学质控探针中的任一种或几种，
杂交阳性对照质控探针(PC)的核苷酸序列为SEQIDNO:33；
杂交阴性对照质控探针(NC)的核苷酸序列为SEQIDNO:34；
表面化学质控探针(CK)的核苷酸序列为SEQIDNO:35，是一条用HEX染料标记的40个T的寡核苷酸序列。这些荧光探针点的位置可作为芯片上DNA微阵列坐标，在芯片检测过程中起到定位探针位置的作用。
本发明芯片所使用的探针可以快速、高通量地对海水中的拟杆菌群落进行检测，最大可以检测13个科的拟杆菌信息，从而为海洋环境细菌群落的监测提供了有力的技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
附图说明
图1：本发明基因芯片的探针布局示意图。
图2：本发明基因芯片的特异性检测。
图3：本发明基因芯片的应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
实施例1：拟杆菌群落检测基因芯片的探针设计
采用高通量测序技术和克隆文库技术获得东海海水中拟杆菌群落信息。根据拟杆菌群落16SrRNA基因序列信息，利用ARB软件对东海海水中13个主要的拟杆菌科(Saprospiraceae、Sphingobacteriaceae、Rhodothermacea、Prevotellaceae、Cryomorphaceae、Porphyromonadaceae、Cytophagaceae、Flavobacteriaceae、Marinilabiacea、Flammeovirgaceae、Cyclobacteriaceae、Chitinophagaceae、Bacteroidaceae)进行探针设计，并在BLAST中进行验证，获得用来制备基因芯片的探针序列。
申请人从检测特异性的角度出发，对上述可能作为探针的序列进行筛选，最终确定了如下的探针序列：
用于检测Saprospiraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:1-3中的任一种或几种；
其中用于检测Sphingobacteriaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:4-5中的任一种或几种；
其中用于检测Rhodothermacea微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:6-7中的任一种或几种；
其中用于检测Prevotellaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:8-9中的任一种或几种；
其中用于检测Cryomorphaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:10-11中的任一种或几种；
其中用于检测Porphyromonadaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:12-14中的任一种或几种；
其中用于检测Cytophagaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:15-17中的任一种或几种；
其中用于检测Flavobacteriaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:18-20中的任一种或几种；
其中用于检测Marinilabiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:21-22中的任一种或几种；
其中用于检测Marinilabiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:21-22中的任一种或几种；
其中用于检测Flammeovirgaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:23-24中的任一种或几种；
其中用于检测Cyclobacteriaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:25-27中的任一种或几种；
其中用于检测Chitinophagaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:28-29中的任一种或几种；
其中用于检测Bacteroidaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:30-32中的任一种或几种；
还有点制在芯片上的：
杂交阳性对照质控探针(PC)，采用的是细菌16SrRNA基因的保守性片段。其主要功能是与PCR扩增过程中扩增出来的基于16SrRNA基因的标记物杂交，从而对扩增、标记和杂交等检测过程的正确性进行有效控制，其核苷酸序列为SEQIDNO:33；
杂交阴性对照质控探针(NC)，采用的是一段40个T的寡核苷酸序列。该探针不会与任何的扩增和标记产物结合，因此该探针可从反面监控杂交过程的可靠性，其核苷酸序列为SEQIDNO:34；
表面化学质控探针(CK)是一条用HEX染料标记的40个T的寡核苷酸序列，可监测点样过程的可靠性，另外荧光探针点的位置可作为芯片上DNA微阵列坐标，在芯片检测过程中起到定位探针位置的作用，其核苷酸序列为SEQIDNO:35(图1)。
实施例2：本发明的拟杆菌群落检测基因芯片的特异性检测
选择拟杆菌中的海水优势科Saprospiraceae的代表性克隆UnculturedHaliscomenobactersp.3-17，优势科Flavobacteriaceae的代表性克隆Aureimarinamarisflavi1-30，优势科Cryomorphaceae的代表性克隆Phaeocystidibacterluteus2-5，分别对拟杆菌群落检测基因芯片的特异性进行检测。
①DNA的提取：用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
②16SrRNA基因的扩增：利用克隆载体pEASY-T1通用引物M13F(GTAAAACGACGGCCAGT)和M13R(GTCCTTTGTCGATACTG)对16SrRNA基因进行线性扩增。扩增程序为94℃5min，25个循环(94℃30s，55℃30s，72℃1min30s)，72℃10min。
③荧光标记：利用荧光标记的随机引物(Cy3-NNNNNNNNN)和Klenow酶对16SrRNA基因扩增产物进行标记。37℃1.5h，70℃10min。
④杂交：将15μL荧光标记产物和5μL杂交液混合与α变形菌群落基因芯片50℃杂交12h。芯片清洗，干燥后用扫描仪检测结果。
结果显示(图2)，克隆UnculturedHaliscomenobactersp.3-17与本发明的基因芯片上对应的Saprospiraceae科的探针具有明显的杂交信号，与其他科的探针无杂交信号(图2A)；克隆Aureimarinamarisflavi1-30与本发明的基因芯片上对应的Flavobacteriaceae科的探针具有明显的杂交信号，与其他科的探针无杂交信号(图2B)；克隆Phaeocystidibacterluteus2-5与本发明的基因芯片上对应的Cryomorphaceae科的探针具有明显的杂交信号(图2C)。说明本发明的海洋α变形菌群落检测基因芯片具有较好的特异性。
实施例3：利用芯片检测海水样品中的拟杆菌种类
将海水样品22A与本发明的海洋拟杆菌群落检测基因芯片进行杂交，具体方法如实施例2。并与高通量测序的结果进行比较。结果如表1所示。
表1海水样品22A中拟杆菌种类检测结果
注：+表示检出，-表示未检出。
基因芯片检测结果表明海水样品22A中含有Flammeovirgaceae、Sphingobacteriales、Saprospiraceae、Rhodothermaceae、Flavobacteriaceae、Cyclobacteriaceae、Cyclobacteriaceae、Cryomorphaceae、Chitinophagaceae。高通量测序结果表明海水样品22A中含有Flammeovirgaceae、Sphingobacteriales、Saprospiraceae、Rhodothermaceae、Flavobacteriaceae、Cryomorphaceae、Prevotellaceae、Balneolaceae。本发明的基因芯片的检测结果与高通量测序结果大体一致，说明该基因芯片可以较准确地鉴定出海洋环境拟杆菌的种类。
实施例4：利用芯片检测海水样品中的拟杆菌群落结构
将海水样品22A、151A、Y1P404、PE104、HSP104、P203、P602与本发明的海洋拟杆菌群落检测基因芯片进行杂交，具体方法如实施例2。将芯片检测出的各个拟杆菌的种类和丰度进行PCoA分析，并与高通量测序结果的PCoA分析进行比较。结果如图3所示。
芯片检测结果表明海水样品HSPI104的拟杆菌群落结构以及PE104的拟杆菌群落结果与其他五个海水样品的拟杆菌群落结构分别具有明显的差异。高通量测序结果同样表明海水样品HSPI104、PE104的拟杆菌群落结构与其他五个海水样品的拟杆菌群落结构具有明显不同。这说明本发明的基因芯片可以准确、快速的对海水拟杆菌群落进行鉴定，且大大缩短了检测时间。因此，为海洋环境细菌群落的监测提供了有力的技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
Claims (7)
1.一种基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片包含有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测海水中的Saprospiraceae菌、Sphingobacteriaceae菌、Rhodothermacea菌、Prevotellaceae菌、Cryomorphaceae菌、Porphyromonadaceae菌、Cytophagaceae菌、Flavobacteriaceae菌、Marinilabiacea菌、Flammeovirgaceae菌、Cyclobacteriaceae菌、Chitinophagaceae菌、Bacteroidaceae菌的探针；
其中用于检测Saprospiraceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:1-3中的任一种或几种；
用于检测Sphingobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:4-5中的任一种或几种；
用于检测Rhodothermacea菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:6-7中的任一种或几种；
用于检测Prevotellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:8-9中的任一种或几种；
用于检测Cryomorphaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:10-11中的任一种或几种；
用于检测Porphyromonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:12-14中的任一种或几种；
用于检测Cytophagaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:15-17中的任一种或几种；
用于检测Flavobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:18-20中的任一种或几种；
用于检测Marinilabiaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:21-22中的任一种或几种；
用于检测Flammeovirgaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:23-24中的任一种或几种；
用于检测Cyclobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:25-27中的任一种或几种；
用于检测Chitinophagaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:28-29中的任一种或几种；
用于检测Bacteroidaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:30-32中的任一种或几种。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的芯片载体还固定有杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探针、表面化学质控探针中的任一种或几种。
3.如权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述的杂交阳性对照质控探针的核苷酸序列为SEQIDNO:33。
4.如权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述的杂交阴性对照质控探针的核苷酸序列为SEQIDNO:34。
5.如权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述的表面化学质控探针的核苷酸序列为SEQIDNO:35。
6.如权利要求5所述的芯片，其特征在于，所述的表面化学质控探针用HEX染料进行了标记。
7.权利要求1-6任一项所述的芯片在检测海水拟杆菌群落中的应用。
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