CN106434902B - 多重pcr检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组和试剂盒及其检测方法 - Google Patents

多重pcr检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组和试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3‑24所示的引物，本发明还提供了多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的检测方法和试剂盒。通过上述技术方案，本发明为蜡样芽孢杆菌毒力基因的快速、准确筛查提供了完备的技术手段，能实现食物中毒事件发生后和疫情暴发后的致病性蜡样芽孢杆菌快速筛检与鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。

Description

多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组和试剂盒及其 检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组和试剂盒及其检测方法。
背景技术
蜡样芽胞杆菌为芽胞杆菌属第I群中的一个种，与苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌的生化特征非常相似，通过过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验等生化试验可以将蜡样芽孢杆菌与同一属中的其他种区分开。但是，传统生化方法无法将含有致病因子的菌株区分开。
应用分子生物学手段不仅可以对蜡样芽孢杆菌的种进行鉴定，还能够获得菌株携带致病因子(毒力基因)的信息，这些信息对于评价食品安全或者菌株致病性起到关键性作用。当前，已经有一些分子生物学方法和技术对蜡样芽孢杆菌的毒力基因进行筛查检测，比如中国专利申请号为200910272677.X的发明申请公开了致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增引物对与检测方法。再如，中国专利申请号为201210380431.6的发明专利公开了“一种高特异高敏感检测分泌呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的方法“；再如文献“Diagnostic Real-Time PCR Assays for the Detection of Emetic Bacillus cereus Strains in Foodsand Recent Food-Borne Outbreaks”(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Mar.2007,p.1892–1898Vol.73,No.60099-2240)公开了一种实时荧光定量PCR方法检测食物中毒爆发中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素基因，该方法针对呕吐毒素设计引物探针序列，扩增103bp特异性基因片段；再如文献“Detection of Enterotoxic Bacillus cereus andBacillus thuringiensis Strains by PCR Analysis”(APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,0099-2240)公开了蜡样芽孢杆菌溶血素B L基因(hblA、hblC和hblD)、非溶血性的肠毒素Nhe基因(nheA、nheB和nheC)、肠毒素T基因(bceT)7个肠毒素相关基因的检测方法，该方法设计了hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT7个基因的特异性引物，使用普通PCR体系逐个扩增目标基因。
蜡样芽孢杆菌毒力基因检测通常要包括1个阳性内对照(IAC)、1个种属鉴定基因、10个毒力基因，并且蜡样芽孢杆菌毒力基因存在多基因并存的情况，最多可以同时存在9个肠毒素基因，所以，无论采用普通单重PCR方法、实时荧光PCR方法，还是等温扩增PCR方法，逐个检测毒力基因，操作繁琐，非常耗时和耗力，并且对不同体系之间的质量控制要求较高。目前，还没有采用多重PCR对蜡样芽孢杆菌1个种属鉴定基因、10个毒力基因以及阳性内对照同时检测分析的报道。
普通单重PCR方法可以通过区分扩增产物大小实现多基因检测，但是检测灵敏度不高；实时荧光PCR方法和等温扩增PCR方法具有较高的检测灵敏度，但是同时检测多个目标毒力基因的数量有限，无法实现减低工作量的目的。对蜡样芽孢杆菌毒力基因的实际检测中，需要一种具有较高灵敏度，较高多重检测能力的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于解决当前蜡样芽孢杆菌毒力基因检测技术中存在的问题，提供一种蜡样芽孢杆菌毒力基因多重PCR检测的引物组和试剂盒，
为达到以上目的，本发明提供了一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-24所示的引物，其中，所述蜡样芽孢杆菌毒力基因包括呕吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因。
本发明的还提供了一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；
(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有417bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有DNA促旋酶基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有135bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有呕吐毒素合成酶基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有120bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因A；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有150bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因C；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有183bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因D；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有165bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因A；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有300bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有223bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因C；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有363bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有肠毒素FM基因；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有272bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有肠毒素T基因；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有330bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有细胞毒素K基因。
本发明还提供了一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶。
本发明还提供了本发明所述的引物组在制备多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的试剂盒中的用途；其中，所述蜡样芽孢杆菌毒力基因包括呕吐毒素合成酶基因B、溶血素BL基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因及细胞毒素K基因。
通过上述技术方案本发明建立了蜡样芽孢杆菌毒力基因多重PCR检测引物组和方法，能够实现血清学、病原培养学和免疫学所无法完成的毒力基因鉴定工作，克服其他分子生物学技术手段鉴定毒力基因的不足之处，达到如下的检测效果：
(一)多重检测
致病性蜡样芽孢杆菌普遍存在多重毒力基因共存的情况，最多可达到单株细菌中携带9种不同的毒力基因。本发明所建立的检测方法能够在一次PCR反应中鉴定蜡样芽孢杆菌的同时(通过DNA促旋酶基因B)，可筛查蜡样芽孢杆菌的10个毒力基因cesB、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM、bceT、cytK。该检测方法能快速简便地确定样品是否为蜡样芽孢杆菌及其携带的毒力基因种类，进而判定其是否为致病株，能够快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。
(二)特异性高
本发明所建立的检测方法的特异性主要体现在一整套特异性引物的特异性，所有引物都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性试验验证能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，包括苏云金芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌及嗜水气单胞菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。
(三)灵敏度高
本发明所建立的检测方法具有与单重实时荧光PCR相当的检测灵敏度，主要是因为本发明针对所有目标基因的特异性引物对序列设计了特定的LHP序列，LHP序列中的同源通用引物能够在第二阶段PCR中提高多重PCR反应的扩增效率，降低多重PCR反应的非特异性扩增和引物二聚体的产生，而LHP中的6个碱基连接序列能够保证同源通用引物扩增不同毒力基因时具有相同的扩增效率，避免多重PCR扩增过程中不同目标基因产量的失衡，从而总体上提高多重PCR检测的灵敏度。本发明所建立的检测方法在每一个反应体系中每个检测目标的检测灵敏度可达到103CFU/mL。
(四)成本较低
本发明所建立的多重PCR检测方法采用普通PCR原理，减低了使用荧光探针的高成本，同时保证检测效果。即使与普通单重PCR方法相比较，该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省90％的试剂成本；在操作性上一次反应检测12个目标基因，至少节省了90％的人力成本和时间成本，原来单重检测需要12次人工和12倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1个反应的时间。
(五)预防假阴性结果
本发明反应体系中添加的阳性内对照(IAC),可以有效的提示因为反应体系抑制原因造成的假阴性检测结果。
本发明为蜡样芽孢杆菌毒力基因的快速、准确筛查提供了完备的解决方案，能实现食物中毒事件发生后和疫情暴发后的致病性蜡样芽孢杆菌快速筛检与鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明试剂盒对三株蜡样芽孢杆菌及其所含毒力基因的检测结果毛细管电泳图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明的一种实施方式提供了一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌种属基因及毒力基因用引物组，其中，该引物组能够检测蜡样芽孢杆菌种属基因：DNA促旋酶基因B，所述蜡样芽孢杆菌毒力基因包括呕吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素BL基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因以及细胞毒素K基因。(见表1)。
表1蜡样芽孢杆菌毒力基因多重PCR检测目标基因
优选的，为了做好质量控制，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照(IAC)引物对，所述阳性内对照引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25-26所示，该引物对是以pET28a质粒为IAC模板设计的一对引物。
根据包括IAC在内的12对特异性引物对序列，设计与之匹配的LHP序列。LHP序列与每条特异性引物连接后使用，同源通用引物单独使用。序列详见表2。
表2蜡样芽孢杆菌毒力基因多重PCR引物汇总表
*注：斜体为每个目标基因的特异性引物对序列
在本发明的一种实施方式中，涉及一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；
(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有417bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有DNA促旋酶基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有135bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有呕吐毒素合成酶基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有120bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因A；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有150bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因C；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有183bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因D；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有165bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因A；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有300bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有223bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因C；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有363bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有肠毒素FM基因；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有272bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有肠毒素T基因；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有330bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有细胞毒素K基因。
可选的，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。优选为核酸毛细管电泳。
在本发明的一种实施方式中，采用QIaxcel全自动毛细管电泳分析仪作为结果分析的平台。基于QIaxcel的全自动操作和设定的智能化结果分析程序，从而实现结果的自动判定，第一阶段(10-15个反应)长引物序列中特异性引物序列与模板中的特异性序列结合，积累一定数量的模板，同时将同源通用引物序列引入扩增子中；第二阶段(30-35个反应)同源通用引物扩增第一阶段积累的模板。
具体的，多重PCR反应的条件包括如下a-i的步骤：
a：94-96℃，4-6min；
b：94-96℃，15-60s，
c：50-60℃，15-60s，
d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；
e：94-96℃，15-60s，
f：55-65℃,15-60s，
g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环；
h：71-73℃，5-10min。
其中，SEQ ID NO.3-24所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQ IDNO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。
在本发明的一种实施方式中，多重PCR反应体系的配置如下：
Taq DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer(Tris-HCl 100mM(pH8.3)，KCl250mM，tween-20 0.2％)5μL，10mm的dNTP 0.5-1.5μL，25mM的MgCl2 1-5μL，10x引物混合物2.5μL(包括阳性内对照在内的每个待测目标的长引物浓度1μm-8μm，同源通用引物浓度4μm-8μm)，pET28a0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超纯水补至25μL。
本发明的一个方面还提供了一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶。
优选的，所述试剂盒还包括PCR反应所需的PCR反应试剂，所述反应试剂可以为反应缓冲液和dNTP。
本发明还提供了上述引物组在制备多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的试剂盒中的用途；其中，所述蜡样芽孢杆菌毒力基因包括呕吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因。
下面结合实施例对本发明进行说明。
实施例1蜡样芽孢杆菌毒力基因多重PCR检测试剂盒的组建
该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、超纯水构成，其具体组分如下：
按照表2所示的序列，进行SEQ ID NO.1和3-26的引物的合成。配置多重PCR反应体系：2×PCR Buffer(Tris·HCl 40mM(pH8.3)，KCl 100mM，
tween-20 0.08％，0.0006ng/μL pet28a，1.5mM dNTP、8mM MgCl2)；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液(包括IAC在内的长引物对浓度各2μM，
同源通用引物SEQ ID NO 1浓度为8μM))；阳性对照(含有9个肠毒素的蜡样芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63303)。所含基因为溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因)和呕吐型蜡样芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63304。所含基因为呕吐毒素合成酶基因B，上述两个菌株都含有DNA促旋酶基因B)混合模板，每种均为106CFU/ml。
试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水4μL。
实施例2试剂盒的操作和结果判断
1、基因组的提取
取增菌液或划线培养的菌落(取自上述阳性对照的两个菌株的培养菌落)溶于水中，用浊度计调整细菌悬液浓度至108CFU/ml，取1ml细菌悬液，13000rpm离心3min，使用提取缓冲液(1.7％SDS，200mM Tris，pH 8，20mM EDTA，200mM NaCl)重悬菌体，加入蛋白酶K，55℃孵育1h。沸水浴10min后冰浴，13000rpm离心10min，取上清作为试剂盒检测用模板。
2、反应体系的配制
取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水4μL。
3、PCR反应
将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循环10个反应；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循环35个反应；h：72℃5min。
4、全自动毛细管电泳分析PCR产物
将PCR反应管放入全自动毛细管电泳仪Qiaxcel Advanced(凯捷公司)，使用高分辨率卡夹，选择15-2000bp的alignment marker，100-61500bp的size marker，自动分析目标条带的大小。
5、结果判断
根据gyrB 417bp、cesB 135bp、hblA 120bp、hblC 150bp、hblD 183bp、nheA165bp、nheB 300bp、nheC 223bp、entFM 363bp、bceT 272bp、cytK 330bp。判定某菌株是否是蜡样芽孢杆菌及其所含毒力基因的种类。
具体判定如下：扩增的结果如图1所示，由图1可知，包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照(第5泳道)有阳性内对照(532bp)的扩增，其他检测有目标条带和(或)阳性内对照的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。
第1泳道为2000bp的size marker，在阳性内对照扩增的基础上，第2泳道还出现5条PCR产物，120bp的是hblA的扩增条带，150bp的是hblC的扩增条带，183bp的是hblD的扩增条带，330bp的是cytK的扩增条带，417bp的是gyrB的扩增条带。第3泳道还出现7条PCR产物，120bp的是hblA的扩增条带，150bp的是hblC的扩增条带，183bp的是hblD的扩增条带，223bp的是nheC的扩增条带，272bp的是bceT的扩增条带，330bp的是cytK的扩增条带，417bp的是gyrB的扩增条带。第4泳道还出现10条PCR产物，120bp的是hblA的扩增条带，150bp的是hblC的扩增条带，165bp的是nheA的扩增条带，183bp的是hblD的扩增条带，223bp的是nheC的扩增条带，272bp的是bceT的扩增条带，300bp的是nheB的扩增条带，331bp的是cytK的扩增条带，363bp的是entFM，417bp的是gyrB的扩增条带。对图1的具体描述如表3：
表3
实施例3试剂盒的保存期试验
以105CFU/mL的含有9个肠毒素基因的蜡样芽孢杆菌和含有cesB呕吐毒素基因的蜡样芽孢杆菌模板混合物为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180及360天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表4所示：
表4保存期试验结果
由表4可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测蜡样芽孢杆菌的12个目标基因均为阳性，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为6个月。
实施例4试剂盒的特异性试验
选择苏云金芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21675)、大肠埃希氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为43317)、阪崎肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21665)、志贺氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为51054)、金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、单核增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1109)、空肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21865)、结肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21669)和嗜水气单胞菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为44016)这些与检测目标菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌。
应用本发明试剂盒检测这些待检细菌，阳性内对照均为阳性，证明检测系统成立；待检细菌均没有非特异性的杂带，表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。
实施例5试剂盒最低检出限试验
评估用检测样本(源自中国疾病预防控制中心)：选择4个蜡样芽孢杆菌菌株，菌株1(模板1)含有hblA、hblC、hblD、cytK四个毒力基因，菌株2(模板2)含有hblA、hblC、hblD、cytK、nheC、bceT六个毒力基因，菌株3和菌株4混合(模板3)含有cesB、hblA、hblC、hblD、cytK、nheA、nheB、nheC、bceT、entFM10个毒力基因。将3个模板的菌悬液分别调整至108CFU/mL，将3个模板梯度稀释成105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL的检测样品。
使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的模板1、2、3。根据实施例2进行操作和结果判断，试剂盒检测11个目标基因的最低检出限试验结果如表5所示：
表5试剂盒检测蜡样芽孢杆菌11个目标基因最低检出限试验结果
从表5看出，试剂盒检测cesB、hblA、hblC、hblD、cytK、nheA、nheB、nheC、bceT、entFM、gyrB基因的最低检出限均为102CFU/mL，试剂盒总体的最低检出限为103CFU/mL，每个PCR反应检测每个目标基因的最低检出限为1个目标分子。
对比例1
按照与实施例1相同的方法组装对比试剂盒1。
区别仅在于，将SEQ ID NO.3-24所示的引物替换为SEQ ID NO.27-48所示的引物获得对比试剂盒1，具体序列请见表6。
表6对比引物序列表
按照与实施例8和9相同的方法进行特异性和敏感性试验，区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-4所示的引物替换为SEQ ID NO.27-28所示的引物获得对比引物组1。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.5-6所示的引物替换为SEQ ID NO.29-30所示的引物获得对比引物组2。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7-8所示的引物替换为SEQ ID NO.31-32所示的引物获得对比引物组3。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9-10所示的引物替换为SEQ ID NO.33-34所示的引物获得对比引物组4。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11-12所示的引物替换为SEQ ID NO.35-36所示的引物获得对比引物组5。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.13-14所示的引物替换为SEQ ID NO.37-38所示的引物获得对比引物组6。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.15-16所示的引物替换为SEQ ID NO.39-40所示的引物获得对比引物组7。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.17-18所示的引物替换为SEQ ID NO.41-42所示的引物获得对比引物组8。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.19-20所示的引物替换为SEQ ID NO.43-44所示的引物获得对比引物组9。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.21-22所示的引物替换为SEQ ID NO.45-46所示的引物获得对比引物组10。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.23-24所示的引物替换为SEQ ID NO.47-48所示的引物获得对比引物组11。
其中，用对比引物组1-11分别扩增阳性对照(含有9个肠毒素的蜡样芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63303。所含基因为溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因)及呕吐型蜡样芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63304)。所含基因为呕吐毒素合成酶基因B)。
将对比引物组混合，扩增11种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本。
分别按照与实施例1和2相同的方法进行特异性和最低检出限试验，结果显示本对比例的引物27-48的特异性、敏感性和覆盖率均差于实施例1-3的引物。
虽然各实验组都检测出了蜡样芽孢杆菌的种属鉴定基因DNA促旋酶基因B，但对比引物组2、3、4、11没有扩增出对应目标的条带，最低检出限为每个反应每个基因为10-100个分子，较本试剂盒差。在对11种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本的特异性展示中，除了阳性内对照外还有其余的杂带，说明其特异性较本试剂盒的特异性的引物组差。
与本发明所提供的方法比较可知本发明所提供的的多重PCR检测方法具有高度的敏感性和重复性。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组，其特征在于，该引物组包括SEQ IDNO.1和3-24所示的引物，其中，所述蜡样芽孢杆菌毒力基因包括呕吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因及细胞毒素K基因。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.25-26所示的引物。
3.一种用于非诊断目的的多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；
(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有417bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有DNA促旋酶基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有135bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有呕吐毒素合成酶基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有120bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因A；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有150bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因C；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有183bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶血素B L基因D；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有165bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因A；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有300bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因B；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有223bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有非溶血性的肠毒素Nhe基因C；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有363bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有肠毒素FM基因；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有272bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有肠毒素T基因；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有330bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有细胞毒素K基因。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，SEQ ID NO.3-26所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQ ID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤：
a：94-96℃，4-6min；
b：94-96℃，15-60s，
c：50-60℃，15-60s，
d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；
e：94-96℃，15-60s，
f：55-65℃,15-60s，
g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环；
h：71-73℃，5-10min。
6.根据权利要求3-4中任意一项所述的检测方法，其中，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。
7.一种多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组和DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液和dNTP。
9.权利要求1或2所述的引物组在制备多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因的试剂盒中的用途；其中，所述蜡样芽孢杆菌毒力基因包括呕吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的肠毒素Nhe基因A、非溶血性的肠毒素Nhe基因B、非溶血性的肠毒素Nhe基因C、肠毒素FM基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因。
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