CN112877448B - 含有特异性分子靶标的蜡样芽胞杆菌标准菌株及其检测和应用 - Google Patents
含有特异性分子靶标的蜡样芽胞杆菌标准菌株及其检测和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及5株具有我国自主知识产权的、符合国内传播规律的蜡样芽胞杆菌标准菌株，可用作食品、药品、临床检验等不同领域的标准参考菌株。其保藏号分别为：GDMCC 60865、GDMCC 60866、GDMCC 60867、GDMCC 60868和GDMCC 60869。5株标准菌株具有典型的生理生化特征，且样品来源、遗传背景、耐药性、毒力基因等信息清晰，完全满足食品、药品、临床检验方面对于标准菌株的要求。本发明还涉及一组用于检测、鉴别上述5株标准菌株的特异性靶标基因以及对应的PCR引物。最后，本发明还提供了一种存活率高、特异性的蜡样芽胞杆菌冻干保护剂，可用于本发明标准菌株的长期储存。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及5株可用作食品、药品、临床检验等不同领域的蜡样芽胞杆菌标准参考菌株，以及检测、鉴别这5株蜡样芽胞杆菌标准菌株的分子靶标基因和PCR扩增引物。此外还提供了一种便于长期储存蜡样芽胞杆菌标准菌株的新型冻干保护剂。
背景技术
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是我国常见的食源性致病菌。据国家卫计委公开发布的《2008-2015年我国食物中毒情况的通报》显示，由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒事件排在由食源性致病菌导致的食物中毒事件的第三位，危害性强。蜡样芽胞杆菌主要污染淀粉类含量高的食品，如米饭、米粉等，可导致腹泻型和呕吐型两种不同类型的食物中毒，分别由其产生的腹泻毒素(肠毒素) 和呕吐毒素引起。此外，蜡样芽胞杆菌也是乳品行业的头号威胁，常造成乳品生产链及终产品的污染，不仅造成严重的经济损失，也带来极大的安全隐患。在我国由蜡样芽胞杆菌引发的食品中毒主要是由呕吐毒素引起的(约占75％)，严重者甚至可导致死亡。由于分布广泛，且能够产生耐受性芽胞，蜡样芽胞杆菌不仅成为食品产业链中最为常见的污染与致病风险，也是药品及临床常见风险之一。因此，蜡样芽胞杆菌应作为食源性致病菌重点监控对象。建立适合的检测、监测与控制体系，对于食品、药品及临床方面均具有重要意义，其中标准菌株的使用以及标准菌株选择的合理性决定了相关体系的可靠性与实施力。标准菌株是由国际或国内菌种保藏中心保藏的，生物特性得到确认和保证并可追溯的菌株。
目前，在实际监管、监控过程中使用的蜡样芽胞杆菌标准菌株大部分为美国微生物菌株保藏中心来源的菌株。由于欧美饮食习惯的差异，由蜡样芽胞杆菌引发的食物中毒事件较少，并未作为重点监控对象，因此分离收集获得菌株少，不能很好地反映该菌在食品中的传播特征。我国居民以米饭、米粉等作为主食，蜡样芽胞杆菌的检出率一直处于较高的水平，但却缺乏代表性的分离株作为具有自主知识产权的标准菌株来研究该菌在中国的遗传特征和传播规律。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了5株从中国地区不同食品类型中分离而来的蜡样芽胞杆菌标准菌株。该菌株具有典型的蜡样芽胞杆菌生理生化特性，且能较好地反映该菌在中国地区的遗传背景，能弥补中国地区无本土分离源的食源性蜡样芽胞杆菌标准菌株的空缺。菌株2801是分离于猪肉样品，其保藏编号为：GDMCC 60865，分类名为：Bacilluscereus；260-1B是分离于凉拌粉面样品，保藏编号为：GDMCC 60867，分类名为：Bacilluscereus；菌株-1761-2A分离于炒粉样品，其保藏编号为：GDMCC 60868，分类名为：Bacilluscereus；菌株-Y1712分离于炒米饭样品，其保藏编号为：GDMCC 60869，分类名为：Bacilluscereus；菌株-2841-1B分离于黄瓜样品，其保藏编号为：GDMCC 60866，分类名为：Bacilluscereus。上述分离获得的5株蜡样芽胞杆菌均保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏日期为2019年10月27日。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了用于检测蜡样芽胞杆菌标准菌株的特异性分子靶标，所述分子靶标为：
(a)如SEQ ID NO:1～10所示的对应一种或几种核苷酸序列；或者，
(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且与(a)中核苷酸具有90％以上同源性的核苷酸序列。本发明从新获得的蜡样芽胞杆菌通过泛基因组分析比较，获得本发明包含的特异性分子靶标，能特异性的检测出本发明中包括的蜡样芽胞杆菌标准菌株，具有较强的特异性。
本发明提供了检测如权利要求1所述的特异性分子靶标的引物，针对如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括：如SEQ ID NO.11所示的上游引物和如SEQ IDNO.12所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括：如SEQID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO. 14所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO.15所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO.17所示的上游引物和如SEQ ID NO.18所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物和如SEQ ID NO.20所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO.21所示的上游引物和如SEQ ID NO.22所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO. 23所示的上游引物和如SEQ ID NO.24所示的下游引物；针对如SEQ IDNO.8 所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO.25所示的上游引物和如 SEQ IDNO.26所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的PCR 扩增引物包括如SEQID NO.27所示的上游引物和如SEQ ID NO.28所示的下游引物；针对如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID NO.29所示的上游引物和如SEQ ID NO.30所示的下游引物。
本发明还提供了一组蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)标准菌株，是(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：
(a)菌株2801，含有如SEQ ID NO:1～3所示的至少一种核苷酸序列；
(b)菌株260-1B，含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(c)菌株1761-2A，含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
(d)菌株Y1712，含有如SEQ ID NO:6～8所示的至少一种核苷酸序列；
(e)菌株2841-1B，含有如SEQ ID NO:9～10所示的至少一种核苷酸序列。
优选地，所述菌株-2801携带如下所示的毒力基因：nheA、nheB和nheC；其耐受的抗生素包括：氨苄西林、头孢噻吩、头孢西丁、青霉素、阿莫西林-克拉维酸、利福平、达福普汀和呋喃妥因。
优选地，所述菌株-260-1B携带如下所示的毒力基因：hblA、hblC、hblD、 nheA、nheB、nheC和cytK；其耐受的抗生素包括：氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、青霉素、头孢噻吩、头孢西丁、复方新诺明、利福平、达福普汀和呋喃妥因。
优选地，所述菌株-1761-2A携带如下所示的毒力基因：nheA、nheB和nheC；其耐受的抗生素包括：氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、青霉素、头孢噻吩、头孢西丁、四环素和利福平。
优选地，所述菌株-Y1712携带如下所示的毒力基因：nheA和cytK；其耐受的抗生素包括：氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、青霉素、头孢噻吩、头孢西丁、四环素和利福平。
优选地，所述菌株-2841-1B携带如下所示的毒力基因：hblA、hblC、hblD、 nheA、nheB、nheC、cytK和cesB；其耐受的抗生素包括：氨苄西林、头孢噻吩、头孢西丁、青霉素和利福平。
优选地，所述菌株-2801的保藏编号为GDMCC 60865；所述菌株-260-1B的保藏编号为：GDMCC 60867；所述菌株-1761-2A的保藏编号为GDMCC 60868；所述菌株-Y1712的保藏编号为GDMCC 60869；所述菌株-2841-1B的保藏编号为GDMCC 60866。
本发明还提供了所述的标准菌株在研究蜡样芽胞杆菌抗生素耐药性中的应用。优选地，所述菌株-2801抗生素耐药性为对氨苄西林、头孢噻吩、头孢西丁、青霉素、阿莫西林-克拉维酸、利福平、达福普汀和呋喃妥因的耐药性；所述菌株-260-1B抗生素耐药性为对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、青霉素、头孢噻吩、头孢西丁、复方新诺明、利福平、达福普汀和呋喃妥因的耐药性；所述菌株 -1761-2A抗生素耐药性为对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、青霉素、头孢噻吩、头孢西丁、四环素和利福平的耐药性；所述菌株-Y1712抗生素耐药性为对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、青霉素、头孢噻吩、头孢西丁、四环素和利福平的耐药性；所述菌株-2841-1B抗生素耐药性为对氨苄西林、头孢噻吩、头孢西丁、青霉素和利福平的耐药性。
本发明还提供了所述的蜡样芽胞杆菌在提高检验蜡样芽胞杆菌显色平板的准确性中的应用。
本发明还提供了一种蜡样芽胞杆菌的冻干保护剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：纤维二糖0.1～10份、脱脂奶粉5～10份、聚乙烯吡咯烷酮0.1-3 份、甘油磷酸钠0.3-1份、肌醇六磷酸0.1-2份。
本发明之所以选择上述组分是由于纤维二糖和甘油磷酸钠具有多羟基结构，可与菌体蛋白质极性基团形成氢键，替代水分子，在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用；脱脂奶粉能够包裹在菌细胞外层保护菌体；聚乙烯吡咯烷酮既能在冻结和脱水过程中降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变性，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用；肌醇六磷酸是一种抗氧化剂，能够在冷冻干燥和储存过程中保护细胞氧化酶的活性，防止冻干品的氧化变质。
优选地，所述冻干保护剂包括以下重量份的组分：纤维二糖7份、甘油磷酸钠0.5份、脱脂奶粉5份、聚乙烯吡咯烷酮2份、肌醇六磷酸1份。
本发明的有益效果为：本发明中创制的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)标准菌株具有更为详细的生理生化指标信息，包括菌株分离源、采样日期及地点、生化鉴定特征、蜡样芽胞杆菌毒力基因携带情况、抗生素耐药性特征、MLST 分型特征等，便于科研、生产等领域用作不同研究方向的参考及对照；本发明为确立的标准菌株筛选出了特异性的分子靶标基因，并带有详细的PCR扩增引物和体系，便于快速、准确的对该标准菌株进行识别。
另外，针对本发明的蜡样芽胞杆菌，发明人提供了一种冻干保护剂。所述保护剂具有以下优点：成型好，外观漂亮且水溶性好，1-2秒内能够完全溶解；冻干存活率能达到40％以上；在-20℃条件下，可保证冻干粉中活菌的数量级至少一年不发生变化，可用于长期储存质控菌株。
附图说明
图1为标准菌株2801的3个靶标基因的特异性检测结果示意图(其中a以标准菌株2801的特异靶基因2801_03520设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；b以标准菌株2801的特异靶基因 2801_03520设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果；c 以标准菌株2801的特异靶基因2801_03513设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；d以标准菌株2801的特异靶基因 2801_03513设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果；e以标准菌株2801的特异靶基因2801_02920设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；f以标准菌株2801的特异靶基因 2801_02920设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果)。
图2为标准菌株260-1B的特异靶标基因的特异性检测结果(其中a以标准菌株260-1B的特异靶基因260-1B_04473设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；b以标准菌株260-1B的特异靶基因 260-1B_04473设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果)。
图3为标准菌株1761-2A靶标基因的特异性检测结果(其中a以标准菌株 1761-2A的特异靶基因1761-2A_03332设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；b以标准菌株1761-2A的特异靶基因 1761-2A_03332设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果)。
图4为标准菌株Y1712的3个靶标基因的特异性检测结果(其中a以标准菌株Y1712的特异靶基因Y1712_05212设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；b以标准菌株Y1712的特异靶基因 Y1712_05212设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果；c 以标准菌株Y1712的特异靶基因Y1712_01910设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；d以标准菌株Y1712的特异靶基因 Y1712_01910设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果；e以标准菌株Y1712的特异靶基因Y1712_02045设计的引物对不同的蜡样胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；f以标准菌株Y1712的特异靶基因 Y1712_02045设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果)
图5为标准菌株2841-1B的2个靶标基因的特异性检测结果(其中a以标准菌株2841-1B的特异靶基因2841-1B_00711设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；b以标准菌株2841-1B的特异靶基因 2841-1B_00711设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果； c以标准菌株2841-1B的特异靶基因2841-1B_00745设计的引物对不同的蜡样芽胞杆菌环境分离株进行特异性扩增检测的结果；d以标准菌株2841-1B的特异靶基因2841-1B_00745设计的引物对其它不同菌属的菌株进行特异性扩增检测的结果)。
图6为蜡样芽胞杆菌定量质控菌储存期内的变化示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1蜡样芽胞杆菌标准菌株的分离和培养
采集的食品样品，在无菌条件下将其彻底剪碎，称取样品25g，放入盛有 225mLPBS缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000r/min均质1min～2min，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。吸取1：10的样品匀液1mL，加到装有9mLPBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。选择上述3个稀释度的样品匀液(包括原液)，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别移入三块MYP琼脂平板，然后用无菌L 棒涂布整个平板，静置10min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30℃±1℃培养24h±2 h。如果菌落不典型，可继续培养24h±2h再观察。在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)。从每个平板中挑取至少5个典型菌落(小于5个则全选)，分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24h±2h。将典型菌落接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30℃、200rpm培养12小时，在无菌条件下将菌液加入终浓度为25％甘油管中，保存于-80℃冰箱。纯化后的菌落可进行随后的筛选实验以及生化鉴定和分子分型。
上述获得的5株蜡样芽胞杆菌的样品来源以及采样地点信息如下表1：
表1 5株蜡样芽胞杆菌的样品来源以及采样地点信息
实施例2蜡样芽胞杆菌标准菌株特征序列分析
对实施例1获得的5株蜡样芽胞杆菌进行特异性序列分析，具体实施步骤如下：
(1)基因组提取
离心收集细菌，加入溶菌酶和玻璃珠同时作用去除细胞壁，加入蛋白酶和裂解液，裂解细菌，加入乙醇混匀上柱吸附DNA，洗涤去除杂质，加入洗脱液洗脱出DNA。洗脱出DNA后放置-40℃冰箱备用。
(2)全基因组测序
取提取的标准菌株的DNA样品运用Thermo Fisher Scientific Ion S5基因组测序平台进行全基因组测序，测序得到的序列文件运用Spades软件进行组装，组装后得到基因组序列运用Prokka软件进行注释。
(3)针对标准菌株的特异性分子靶标基因的泛基因组分析
利用Roary软件对标准菌株以及其它155株蜡样芽胞杆菌的全基因组序列注释结果进行泛基因组分析，从运算结果中筛选出分别只存在于5个标准菌株基因组中的特异性分子靶标基因，并运行脚本提取出靶标基因的碱基序列。
(4)标准菌株的特异性分子靶标基因的PCR引物设计
针对泛基因组分析得到的5株标准菌株的各个特异性分子靶标基因的碱基序列，利用NCBI官方网站的Primer-BLAST引物设计工具，设计相应的PCR 扩增引物，对不同的靶标基因分别进行特异性扩增检测。本发明中5株标准菌株的靶标基因及其扩增引物信息如表2所示：
表2标准菌株特异性分子靶标基因序列及其PCR引物信息
(5)利用合成的引物对标准菌株以及其它相同菌属、不同菌属的菌株进行 PCR检测，验证筛选的分子靶标基因及引物的特异性。PCR反应体系及反应程序等信息如下表3和4所示：
表3标准菌株特异性分子靶标基因的PCR扩增体系
表4标准菌株特异性分子靶标基因的PCR反应程序
注：表中的延伸时间随扩增基因的不同而不同，参照表2中不同靶标基因的长度进行换算。
PCR验证所选用的不同菌属的菌株信息如表5、表6所示：
表5标准菌株特异性识别检测所选用的不同菌属的菌株信息
表6标准菌株特异性识别检测所选用的蜡样芽胞杆菌分离株信息
针对5株标准菌株的各个特异性分子靶标基因的PCR检测结果如图1-5所示。从检测结果来看，利用5株标准菌株各个特异性分子靶标基因的PCR引物只从对应的标准菌株基因组DNA中扩增出了片段长度一致的特异条带，表明这些引物具有较好的特异性，无交叉扩增反应发生，可分别用作5株蜡样芽胞杆菌标准菌株特异性识别检测的引物。
(6)将标准菌株PCR扩增得到的产物送华大基因公司进行测序，以确定引物扩增结果的有效性。测序结果显示与前期筛选得到的特异性分子靶标基因的序列一致。
实施例3蜡样芽胞杆菌标准菌株的生理生化特征分析
1、标准菌株的生化鉴定结果
根据GB 4789.14—2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》进行生化鉴定，挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验、卵黄反应试验、酪蛋白分解试验。用蜡样芽胞杆菌标准菌株(ATCC14579)、蕈状芽胞杆菌标准菌株 (ATCC10206)和苏云金芽胞杆菌标准菌株(ATCC10792)作为对照进行同步试验，生化鉴定结果如下(表7)
表7标准菌株生化鉴定结果记录表
注：“+”表示90％～100％的阳性菌株；“-”表示90％～100％的阴性菌株。“+/-”表示大多数的菌株阳性；“-/+”表示大多数的菌株阴性；“/”表示没有进行试验。
实施例4 5株蜡样芽胞杆菌标准菌株的毒力基因携带特征
采用PCR的方法确认蜡样芽胞杆菌标准菌株的毒力基因携带情况。选择与蜡样芽胞杆菌引起腹泻症状有关的7个肠毒素基因(hblA,hblC,hblD,nheA,nheB, nheC,cytK)和引起呕吐症状有关的呕吐毒素合成酶基因(cesB)进行检测。PCR 扩增检测体系、反应条件及引物信息如下表8～10。引物均由上海生工生物有限公司合成。5株标准菌株的毒力基因检测结果如下表11。
表8标准菌株特异性分子靶标基因的PCR扩增体系
| 体系组分 | 体积 |
| 菌株DNA模板 | 1μL |
| PCR Mix | 12.5μL |
| 正向引物 | 1μL |
| 反向引物 | 1μL |
| ddH2O | 9.5μL |
| 总体积 | 25μL |
表9标准菌株特异性分子靶标基因的PCR反应程序
注：表中的退火温度随扩增基因及引物的不同而不同，详见下表10。
表10蜡样芽胞杆菌毒力基因检测所用引物
表11 5株蜡样芽胞杆菌标准菌株的毒力基因携带情况
| 标准菌株名称 | 毒力基因携带情况 |
| 2801 | nheA-nheB-nheC |
| 260-1B | hblA-hblC-hblD-nheA-nheB-nheC-cytK |
| 1761-2A | nheA-nheB-nheC |
| Y1712 | nheA-cytK |
| 2841-1B | hblA-hblC-hblD-nheA-nheB-nheC-cytK-cesB |
实施例5蜡样芽胞杆菌标准菌株的药敏特征
参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute， CLSI)关于金黄色葡萄球菌的检测标准，采用KB纸片扩散法对蜡样芽胞杆菌标准菌株进行抗生素敏感性评价。将抗生素药敏纸片贴在涂满菌液的MH琼脂平板上，纸片中的药物在琼脂中扩散形成浓度梯度，而纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，通过抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度。抗生素药敏纸片具体信息见表12。
具体步骤如下：
1)活化待测菌体。将其接种于胰蛋白胨大豆肉汤，培养24h，划线接种于营养琼脂平板，再隔夜培养。
2)配制悬菌液。挑选纯的新鲜菌落，重悬于生理盐水，然后用0.5号麦氏比浊管比浊，使其浓度相当。
3)菌液涂布。吸取1mL悬菌液到MH琼脂平板上，用棉签均匀涂布。然后按照事先划好的区域贴不同抗生素的药敏纸片，做好标记。放置于37℃恒温培养箱，孵育培养1d。
4)抑菌圈测量。观察实验结果，用抑菌圈测量仪或直尺测定抑菌圈大小。最后参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)有关金黄色葡萄球的药敏试验标准(CLSI,2010)，判断菌株对抗生素的敏感、中度耐药和耐药。5株标准菌株的抗生素耐药性检测结果见下表13。
表12 20种抗生素信息及抑菌圈评价标准
表13 5株蜡样芽胞杆菌标准菌株的抗生素耐药性
| 标准菌株 | 抗生素耐药性 |
| 2801 | AMP-KF-FOX-P-AMC-RD-QD-FD |
| 260-1B | AMP-AMC-P-KF-FOX-SXT-RD-QD-FD |
| 1761-2A | AMP-AMC-P-KF-FOX-TE-RD |
| Y1712 | AMP-AMC-P-KF-FOX-TE-RD |
| 2841-1B | AMP-KF-FOX-P-RD |
实施例6蜡样芽胞杆菌标准菌株的Multi-locus sequence typing分型分析
从PubMLST数据库(https://pubmlst.org/organisms/bacillus-cereus/primers) 获取蜡样芽胞杆菌7个管家基因引物序列信息(表16 )。根据引物信息，扩增管家基因序列，并进行测序，得到相应管家基因序列拼接后，上传至MLST数据库进行比对，得到基因的序列编码(allele number)。将各个菌株序列按照glpF、 gmk、ilvD、pta、pur、pycA、tpi排成等位基因谱，再通过MLST数据库查询菌株的ST型别。MLST-PCR扩增检测体系、反应条件及引物信息如下表14-16。引物均由上海生工生物有限公司合成。5株标准菌株的MLST检测结果如下表 17。
表14标准菌株MLST-PCR扩增体系
| 体系组分 | 体积 |
| 菌株DNA模板 | 1μL |
| TakaRa Primer STAR Max | 12.5μL |
| 正向引物 | 1μL |
| 反向引物 | 1μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 9.5μL |
| 总体积 | 25μL |
表15标准菌株MLST-PCR反应程序
注：表中的退火温度随扩增基因及引物的不同而不同，详见下表16。
表16蜡样芽胞杆菌的7个MLST管家基因的扩增引物信息
表17 5株蜡样芽胞杆菌标准菌株的MLST分型结果
| 标准菌株名称 | ST型别 |
| 2801 | ST1438 |
| 260-1B | ST1431 |
| 1761-2A | ST26 |
| Y1712 | ST90 |
| 2841-1B | ST1882 |
本发明还提供一种蜡样芽胞杆菌标准菌株的冻干保护剂，不同实施例以及对比例中冻干保护剂的组分如表18所示：
表18各组冻干保护剂的组分
在对比例中增加脱脂奶粉的重量份以补足由于其缺少组分的总分量。
将以实施例7～9与对比例1～3保护剂的冻干菌种(GDMCC 60865)其冻干存活率，具体方法如下：
将菌种复苏后接入培养基中培养至对数后期至稳定期前期，选取合适的菌量加入到实施例7～9与对比例1～3保护剂中，混合均匀后分装至西林瓶中，并取样进行稀释计数，为冻干前含菌量A0。将分装好的西林瓶半加塞转入冻干机中进行预冻，预冻温度为-40℃，时间为3小时，开启主干燥，时间20-25小时，之后进入解析干燥阶段，时间为6-8小时，结束干燥，在真空状态下压塞并移出冻干机，进行自动轧盖，保证样品的完全真空状态，并置于-20℃低温保存。取冻干后的样品进行稀释计数，计数结果为冻干后含菌量A，冻干存活率为A与 A0的百分比，结果如表19所示：
表19不同组成的冻干保护剂冻干存活率的比较
由表19可以看出，实施例9的冻干保护剂是本发明的最佳实施例，因此，以实施例9为比较对象，制备了对比例1～3冻干保护剂，结果如表19所示，由于对比例1～3分别缺少本发明冻干保护剂的其中一种组分，其保护效果均比实施例要差，由此说明本发明的冻干保护剂的中的组分纤维二糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘油磷酸钠之间存在协同增效效应，缺少其中任何一种均不能达到本发明保护剂的效果。
将以实施例7～9与对比例1～3保护剂的冻干菌种比较其冻干稳定性，具体方法如下：
按照上述制备方法使用不同的保护剂进行制备定量质控菌，并置于-20℃条件下储存，每个月抽取3支按照前述计数方法进行检验含菌量。为了更好的比较各保护剂在长期储存过程中的效果，在制备定量质控菌时按照各保护剂的冻干存活率进行计算冻干前的活菌数，使各保护剂冻干后，菌含量均约为3000cfu/ 瓶。各保护剂制备的定量质控菌经12个月储存后含菌量变化如下附图6所示。
由附图6可知，经12个月储存后由实施例7～9的冻干保护剂保护的含菌量无显著变化，而由对比例1～3冻干保护剂保护的含菌量在经2个月后菌含量显著下降，到12个月后菌含量接近0。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 广东环凯生物科技有限公司
<120> 含有特异性分子靶标的蜡样芽胞杆菌标准菌株及其检测和应用
<130> 12.3
<160> 33
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 141
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 1
tgctaatcaa gaaaagatag cggtaaaagc taattcttat tatgtaacca atttaaagca 60
attcatggaa ttttatgagg acttttattt tgatggtgag gaatgggaaa aagatatatg 120
ggatagacgg aaaatgaatc t 141
<210> 2
<211> 138
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 2
tcttcggttt agcggagagg attggtatat cgagcacctt ggtatgttaa atattccaag 60
ttatcgtgag cattgggaaa agaaaaagaa atggtacgac aaacatggtt tctctcaacg 120
tcttattgtt acggatga 138
<210> 3
<211> 235
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 3
ttttcagggc atgagccatt attatagaat tggtatgaat ggagcatctc tttataagga 60
tatagttaaa gaagttttgt taactggtac aaaagattcg tttttaaaag aaaacatttt 120
atttactatg atttttgaaa ttgttccaga tagtgatata gacgtttcaa aaattaatta 180
tgattttcta caaagtcttc ttcctgaaat gtttcgagcc tatcttcaga gcgtt 235
<210> 4
<211> 544
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 4
atgagaagga aaacacgacc taaattgatt ttgttagaga aaaagccgat tcatagaaat 60
agaaacagga acttaagatt ggtagattcg catgaaaatg aatatacacg taaaattaca 120
gggaaacctt tgatacataa aattttaaat tttctttgta ctgttagtgt tgtagcagga 180
attatatatt atgcatccaa ttacgatatt ccttggataa ctactggagt tactgaagaa 240
gaagccatgt caattacaga tgatgttgta aaaacacaaa cacaattaat tttgcaggat 300
ctaggtgtcg gagatgatgg aatctcgggt aaaattacaa ttcataatac ctatccaagt 360
aatggttatg ctggcttgtt ccatggccaa tctgtgatta caaatggatt gcaatcgtat 420
gttcaaagct ctggttttat tgatatatat ccgatggttt attttatgaa gcgggataag 480
gaagggaact tagtatcgat tccttctaat cagcgtctca ataaggatag attccgtgac 540
gcga 544
<210> 5
<211> 643
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 5
tcgttggtta tggttactct gtattgcagt tcttgttctt attacaggtt gttcgaaaaa 60
aaatgagatc ccaaaaggtt tttcagagca aagttatcaa gacttcacaa aagtatacag 120
cgattatcaa aaagcaaaaa agacaaatag tgaagatgaa aaaggtttag caaatttggc 180
tgattatcat gaaaaaaaag accaaggaaa actaactgtg gaagagataa aggtatggga 240
tgcgatggga gaactcttga tgattcacaa tacgattgtg aagaatgatc ggcatgaatt 300
ggataacgct gattcaggtg tgaaaaaaat agcgaatgct tatctgtcga aaaaaaatga 360
gatacctgcg ttagagaaaa gcattgaaga catgttgaag ctgccgaaat ccaaaacagc 420
aaaagaaacg tctttatcgt ctaaggaaga agtgaaggat acaaaagata aaaaggacac 480
agaggggact acgaattctg cagagtttcc aactgctgaa aactgcccaa agccatatac 540
aaaagaagat tgtgaaaaat tcacggagta ctatacaaac ggcgagggga aacaagaacc 600
agaaaaaaat gatgtacaag catcgggagc taatgcgttt tcc 643
<210> 6
<211> 764
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 6
acttgccggt ccaattgtct ttagagaaag atctacctgg aaaaatcaat agtgagctaa 60
caacaagaac ttcttctctt aagggatttg atatcaaagc gaaaggtaat gcattaaaca 120
aaacgaaggt acaactagat tttgtatttg atgtatcgtc attaggatta acgacggaag 180
atattttttc attccaagca gatgtaagtt caacggattc aaatgtaatc caattagaaa 240
gtcagtactt ttttaataat ggggcagcgc caggagattc cagtggtaca caattacctc 300
ctagtggagt taaatcatat aaaactcctc gaatgaatta tatgtatata gataatgtta 360
gagcggcaca acaaaaatat atacattgtt tccttaatgt gattttaagt gacggtacta 420
cgttaactaa ttttaaagta aacaatgtaa gtattacaat ccgaggaaat acttatgtgt 480
actccaaagt agaaaataat attttgtata gagctaaccc tgaagactat atagcttata 540
aagaatttcc tgatgaaaat ttagttacat ttggagaatt gccatcttat gttgttataa 600
acaatctagt agggaaaaaa atcaatttac taggagattc aataacagct ggacatacgc 660
ttgggttttc aaacacttgg gggtatgcaa ttgcaaaacg taacaaaatg aatgtacgaa 720
actatggtat taacgggacg tgtttagccg gaacatcaaa cgct 764
<210> 7
<211> 220
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 7
aacctgcgcc acttgttact tttcctgtga atggatatcg tggtttagat acaaatccag 60
acgggttggc tatttgtcat gttaagaagg acggaaatcc caaatcattt gaatggttag 120
gagaaggtgg attacaagac tatccatctg acaaacgaga aaatttaatt tatgaacttt 180
gccataagtt agtgagaaaa tgtgtggaag acggtacagg 220
<210> 8
<211> 365
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 8
agaaagagat gccacattga gagtagaagt aacagagaag attgaagaaa ttgaaaatat 60
cgtaaataag gtagttgagc agaaaaaaga attattaact tccaaagaaa aacaaaaaga 120
agttagtgat acatatggag aaataaatga acagttgatg acgttagagg atgaaaaatc 180
tcaattaatt caaagaaaga aagaactttt attttcgaaa agtagtcata cgattttgtt 240
agaacgatat aaaaaagaaa aagaatcata ttgtgcaaca caagaagtat tatataaatt 300
agaaatttca aatcatgaaa aagtctgtcc tctgtgtaat tctcacgttc aatgcgatgg 360
ggtag 365
<210> 9
<211> 694
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 9
atgaatgctt ttggttttag tgggtggcaa ttagttttag ggggcgttca ggcagggatt 60
cataatttat ctattcgcat gaaagcacca tttagaaaag tattatgtga taaatataag 120
aataaattca atgatgaatc aattttcatg gatttttcga ggggtatgaa ggatatctat 180
atatggaaca aattttataa ccatgcaatc tgtgggcaag gtttattcct gcatcactta 240
cttcgtgcat ttcaagaaca aggtgttcct gttaaattaa tcacgacaac gcaacaaata 300
gcagattatc tatcatatca tcatggttat acagcaatga atgttgatgc tgaaacaaca 360
gatggcattg aagaaaaaat gaatgcattc aacaaaagtg atattaatgt tttaagtttg 420
gataactctt cattaacagg gtggaaatta agtcaaaaaa aactgtattt acggaatatg 480
ttaaaaaaaa taacaactat accaacaaga gaaaatgtga tgtacatagt ttgtttatta 540
tacgtagata aagaagagaa agcattgttg gaaaataaag agaatattag attgattcac 600
tttaagcctg aaacccaaag gaagacaatg gattcaacag cagttaacat ttatattcct 660
catattgata agtcagataa aaaatcatgc gttg 694
<210> 10
<211> 583
<212> DNA
<213> 细菌
<400> 10
gacaaaatca tagtctccgc tactcaaatg gagaaaatcg agaaatggta cgaggcaaat 60
tataatattg aaaatggtgg tttcccatta gaaaaaggag taattgaact ggaagtgaaa 120
atgaatcgat tatcgcagga aacttatctt cagtttgaat tacatgaaaa agatattcat 180
gttactcttt atgatgcata tggtgatata atcatagaat ttcactctta tatatataaa 240
gggaaaatca gaaataagat tgtaaatact tatgatttaa agaaatataa gttagaaaaa 300
gagtttgcgt tagcgaaaga caagctaatg ctatattcct taaatatctt tatgcaagta 360
agttacttta tgataaattt tatggaagat aaggaaattg ttcaaataaa agaaagtaat 420
tatggtaata caataacaaa gggaacagag caggatggaa aaaatagtag aaaaataggg 480
agaaagacat ataaattccg aattcgtgaa aaactcccta aaagggaata tcatgcaaag 540
accatggctt ggacaagaag aggtcattgg cgatatttaa aag 583
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成
<400> 11
tgctaatcaa gaaaagatag cgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成
<400> 12
agattcattt tccgtctatc cca 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 13
tcttcggttt agcggagagg a 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成
<400> 14
tcatccgtaa caataagacg ttga 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 15
ttttcagggc atgagccatt 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 16
aacgctctga agataggctc g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 17
atgagaagga aaacacgacc t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 18
tcgcgtcacg gaatctatcc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成
<400> 19
tcgttggtta tggttactct gt 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 20
ggaaaacgca ttagctcccg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 21
acttgccggt ccaattgtct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 22
agcgtttgat gttccggcta 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 23
aacctgcgcc acttgttact 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 24
cctgtaccgt cttccacaca 20
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成
<400> 25
agaaagagat gccacattga gagt 24
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 26
ctaccccatc gcattgaacg 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成
<400> 27
atgaatgctt ttggttttag tg 22
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成
<400> 28
caacgcatga ttttttatct gac 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成
<400> 29
gacaaaatca tagtctccgc tac 23
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成
<400> 30
cttttaaata tcgccaatga cctc 24
Claims (2)
1.检测特异性分子靶标的引物在制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株检测试剂中的用途，其特征在于，所述特异性分子靶标为：
如SEQ ID NO:1~10所示的任意一种或几种核苷酸序列；
其中，检测SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株2801，保藏编号为GDMCC 60865的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株2801，保藏编号为GDMCC 60865的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:3所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株2801，保藏编号为GDMCC 60865的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:4所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株260-1B，保藏编号为GDMCC 60867的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:5所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株1761-2A，保藏编号为GDMCC 60868的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:6所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株Y1712，保藏编号为GDMCC 60869的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:7所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株Y1712，保藏编号为GDMCC 60869的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:8所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株Y1712，保藏编号为GDMCC 60869的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:9所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株2841-1B，保藏编号为GDMCC 60866的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:10所示的特异性分子靶标的引物用于制备蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株2841-1B，保藏编号为GDMCC 60866的检测试剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
针对检测如SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:11所示的上游引物和如SEQ ID NO:12所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:13所示的上游引物和如SEQ ID NO:14所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:3所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:15所示的上游引物和如SEQ ID NO:16所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:4所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:17所示的上游引物和如SEQ ID NO:18所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:5所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:19所示的上游引物和如SEQ ID NO:20所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:6所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:21所示的上游引物和如SEQ ID NO:22所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:7所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:23所示的上游引物和如SEQ ID NO:24所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:8所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:25所示的上游引物和如SEQ ID NO:26所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:9所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:27所示的上游引物和如SEQ ID NO:28所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:10所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:29所示的上游引物和如SEQ ID NO:30所示的下游引物。
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