CN116656623B - 两株具有特征分子靶标的蜡样芽孢杆菌广谱肌尾噬菌体dc1、dc2及其应用 - Google Patents

两株具有特征分子靶标的蜡样芽孢杆菌广谱肌尾噬菌体dc1、dc2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两株具有特征分子靶标的蜡样芽孢杆菌广谱肌尾噬菌体DC1、DC2及其应用。噬菌体DC1保藏编号为：GDMCC No：62930‑B1，噬菌体DC2保藏编号为：GDMCC No：62931‑B1。本发明提供的烈性噬菌体DC1、DC2宿主谱广，以裂解致呕型蜡样芽孢杆菌为主，且具有特征分子靶标。同时，噬菌体DC1、DC2对高温和酸碱具有耐受性，不易在应用过程中失活，在生菜和牛奶中对目标菌有较好抑制效果。综上所述，噬菌体DC1、DC2具有防控食品中蜡样芽孢杆菌污染的潜质。

Description

两株具有特征分子靶标的蜡样芽孢杆菌广谱肌尾噬菌体DC1、 DC2及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及两株蜡样芽孢杆菌肌尾噬菌体DC1、DC2及其应用。
背景技术
食源性疾病是全球关注的首要食品安全问题。由受污染的食物引起的疾病和死亡对人类健康造成了持续性的威胁，也是全世界经济社会发展的重大障碍。据统计，从2003到2019年在我国由蜡样芽孢杆菌引起的食源性暴发事件有504起，死亡人数为6人，在食源性致病菌中排名第四。蜡样芽孢杆菌产生呕吐毒素和肠毒素，由蜡样芽孢杆菌污染引起的食物中毒分为两种类型，包括呕吐和腹泻症状。其中，由呕吐毒素(cereulide)引起的食物中毒严重时会导致死亡。芽孢的产生是蜡样芽孢杆菌容易污染食品的一个重要原因。芽孢抗逆性强，并且在适宜的条件下易转变成营养细胞，进一步生长繁殖。抗生素和其他抗菌类药物的滥用，导致细菌对抗生素的耐药性日益增强，从而加剧了致病菌的危害性。蜡样芽孢杆菌对β-内酰胺、红霉素、四环素和碳青霉烯等抗生素具有多重耐药性。为了人类的生命健康，迫切需要开发一种新型的有效杀菌技术。
噬菌体是一类特异性侵染细菌的病毒，干扰宿主菌正常的代谢过程，甚至导致宿主菌裂解死亡，不会破坏人体内有益的微生物。因此，噬菌体及其衍生物在病原体生物控制中具有很大的潜力。为了增强噬菌体裂解能力、扩大噬菌体制剂的裂解范围以为达到杀灭效果，通常商品化的噬菌体制剂由多种噬菌体组合而成。因此对新型噬菌体的分离和表征尤为重要。
虽然很多噬菌体制剂已被用于防控微生物的污染，但是目前用于防控蜡样芽孢杆菌污染的噬菌体报道较少，尤其是针对蜡样芽孢杆菌的主要危害型别——致呕型蜡样芽孢杆菌。因此亟需分离出更多能够感染蜡样芽孢杆菌并可进行实际应用，如食品安全保障、环境污染治理、临床感染治疗等的烈性噬菌体。
发明内容
本发明的第一个目的是提供蜡样芽孢杆菌的新型烈性肌尾噬菌体DC1，其保藏编号为：GDMCC No：62930-B1。
本发明的第二个目的是提供蜡样芽孢杆菌的新型烈性肌尾噬菌体DC2，其保藏编号为：GDMCC No：62931-B1。
本发明提供的烈性肌尾噬菌体DC1(Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC1)和DC2(Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC2)是以致呕型蜡样芽孢杆菌为宿主分离纯化所得。所述噬菌体DC1和DC2于2022年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号分别为：GDMCC No：62930-B1、GDMCC No：62931-B1。
本发明的噬菌体DC1、DC2均属于有尾噬菌体目Herelleviridae科，通过全基因组测序与比对，噬菌体DC1、DC2与已有噬菌体全基因组相似性低于95％，均属于新型噬菌体。
本发明的噬菌体DC1潜伏期为30min，裂解量39PFU/cell。而噬菌体DC2有较短的潜伏期为15min，更大的裂解量为124PFU/cell。
本发明的噬菌体DC1、DC2均具有良好的热稳定性和pH稳定性，在温度为4～45℃及pH为4～9之间可保持稳定效价。
本发明的噬菌体DC1、DC2均具有较宽的宿主范围，DC1可以裂解72株/139株蜡样芽孢杆菌菌株，DC2可以裂解81株/139株株蜡样芽孢杆菌菌株。
本发明的噬菌体DC1、DC2在牛奶和生菜中对蜡样芽孢杆菌具有良好抑菌效果，尤其是DC2抑菌能力突出。
本发明的第三个目的是提供上述噬菌体DC1的特征分子靶标hp18，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
本发明的第四个目的是提供上述噬菌体DC2的特征分子靶标hp206，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
本发明的第五个目的是提供上述噬菌体DC1或噬菌体DC2在抑制蜡样芽孢杆菌中的应用。
优选地，所述的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌892-1。
本发明的第六个目的是提供上述噬菌体DC1或噬菌体DC2在制备抑制蜡样芽孢杆菌的噬菌体制剂中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种抑制蜡样芽孢杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，含有上述噬菌体DC1或上述噬菌体DC2作为活性成分。
优选地，所述的噬菌体制剂是抑制人体、食品或环境中蜡样芽孢杆菌的制剂。
优选地，所述的食品是牛奶。
本发明的第八个目的是提供一种鉴定噬菌体DC1或噬菌体DC2的鉴定引物，当鉴定噬菌体DC1时，其鉴定引物为：TTCAAGTACTCGTCAAAGGTG和GTCTTCCCCTTTCATCCTAGC，当鉴定噬菌体DC2时，其鉴定引物为AGTACTAGCAGGATGTGCCG和ACAACCTTTCGGCTTTCCGT。
本发明的优点：
本发明提供的烈性噬菌体DC1、DC2能特异性裂解蜡样芽孢杆菌，且宿主范围广，尤其是能裂解56株致呕型蜡样芽孢杆菌。宽谱噬菌体覆盖的宿主广，应用范围更广。同时，噬菌体DC1、DC2具有良好的热稳定性，对酸碱具有耐受性，有较强的环境适应能力，不易在应用过程中失活，且在牛奶和生菜中对目标菌有较好抑制效果。综上所述，噬菌体DC1、DC2有望成为一种抑菌制剂用于防控食品中蜡样芽孢杆菌的污染及临床中蜡样芽孢杆菌的感染。
Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC1于2022年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号分别为：GDMCC No：62930-B1。
Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC2于2022年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号分别为：GDMCC No：62931-B1。
附图说明
图1为hp18与NCBI其他噬菌体基因的核酸相似性。
图2为hp206与NCBI其他噬菌体基因的核酸相似性。
图3为噬菌体DC1与DC2裂解宿主的平板示意图，A：DC1；B：DC2。
图4为噬菌体DC1与DC2的透射电镜图，A：DC1；B：DC2。
图5为噬菌体DC1与DC2的特征性分子靶标PCR鉴定的凝胶电泳胶图。
图6为噬菌体DC1与DC2的一步生长曲线示意图，A：DC1；B：DC2。
图7为噬菌体DC1与DC2的酸碱稳定性示意图，A：DC1；B：DC2。
图8为噬菌体DC1与DC2的热稳定性示意图，A：DC1；B：DC2
图9为噬菌体DC1与DC2的在巴氏杀菌条件下的热稳定性示意图。
图10为噬菌体DC1抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌生长的示意图。
图11为噬菌体DC2抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌生长的示意图。
具体实施方式
为了具体阐明本发明所采取的手段及实施效果，以下结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1：噬菌体的分离、纯化与制备
1、样品的来源及处理
用于分离噬菌体的样本来自于广东省广州市污水处理厂污水，污水在10000×g离心20min使大部分杂质沉于底部，取上清液用0.45μm的滤膜进行抽滤去除大部分环境细菌。加入终浓度为50mM硫酸镁至上清液，静置30min后用0.22μm亲水性滤膜抽滤，使噬菌体吸附至滤膜。随后用洗脱液(每100mL洗脱液含有3g牛肉膏、3mL Tween 80和0.2922gNaCl)浸泡滤膜并超声(功率为45KHz)5min后，将洗脱液用0.22μm滤膜过滤除去细菌，滤液保存在4℃备用。
2、噬菌体的分离、纯化
于无菌96深孔板(每孔加入1mL TSB培养基)中接种不同ST型蜡样芽孢杆菌(如表5)，37℃、200rpm，摇床过夜培养以活化菌株。然后在新的无菌96深孔板中每孔加入1mL TSB培养基(含1mM CaCl2)、30μL水样、10μL过夜菌液，37℃、200rpm，摇床过夜培养24h。接着在96孔板离心机中离心(4℃、1000g、30min)，上清用0.22μm滤膜过滤至无菌1.5mL EP管，即得到粗制噬菌体悬液，4℃冰箱保存待用。
采用双层琼脂平板法分离噬菌体。在TSB固体平板(1.5％琼脂、1mM CaCl2)一侧接入100μL过夜活化菌液，另一侧倒入TSB上层琼脂(含0.4％琼脂、1mM CaCl2)使其均匀铺满平板，待平板稍微晾干，吸取3μL粗制噬菌体悬液在平板上点样并晾干，然后在37℃倒置培养并观察有无噬菌斑的出现。
采用双层琼脂平板划线法纯化噬菌体。将100μL对数期的蜡样芽孢杆菌892-1与100μL粗制噬菌体悬液加至TSB上层琼脂中，混匀后倒入TSB固体平板。待上层琼脂凝固后，于37℃倒置培养8h。当噬菌斑出现后(图3)，用1μL接种环挑取单个噬菌斑并在TSB固体平板划“之”字线，取100μL对数期的宿主菌加入TSB上层琼脂中，轻轻混匀后从TSB固体平板一侧倒入并让琼脂铺满整个平板，待上层琼脂凝固后，于37℃倒置培养8h，即可获得分散的单个噬菌斑。重复以上操作4～5次，即获得纯化的噬菌体DC1、DC2。纯化的噬菌体DC1、DC2保存于4℃。
3、高效价噬菌体DC1、DC2的制备
通过三步扩增法制备了效价较高的噬菌体DC1、DC2。用接种环挑纯化的单个噬菌斑，分散于3mL TSB(含1mM CaCl2)中，接种30μL过夜宿主细胞(蜡样芽孢杆菌892-1)，培养8h(37℃，200rpm)。第一步上清液经离心(10,000g，1min)和0.22μm注射器过滤后得到。然后，向3mL TSB(含1mM CaCl2)中接种30μL过夜宿主细胞(蜡样芽孢杆菌892-1)，培养1h(37℃，200rpm)，然后加入100μL第一步上清液，并在相同条件下再摇动8h，第二步上清液分离如上。最后，向50mLTSB(含1mM CaCl2)中接种500μL过夜宿主细胞(蜡样芽孢杆菌892-1)，培养1h(37℃，200rpm)，然后加入1mL第二步上清液。并在相同的条件下，将混合物振荡培养12h。第三步培养物经离心(10,000g，4℃，20min)和0.22μm无菌注射器过滤后即可得到高效价的噬菌体DC1、DC2(滴度为3×109PFU/mL)。将噬菌体保存在4℃。
实施例2：噬菌体DC1、DC2的形态观察
在碳涂层铜膜上滴加10μL高滴度(≥1×108PFU/mL)的噬菌体，静置1min后，用滤纸吸干，再滴一滴3％的磷酸钨染色液，染色1min，用滤纸吸取多余液体，待自然干燥后，将制备好的染色片在透射电子显微镜下观察(图4)。噬菌体DC1、DC2头部均为二十面体，肌尾。
实施例3：噬菌体DC1、DC2基因组分析
提取噬菌体DC1、DC2的基因组DNA进行全基因组测序及分析。采用苯酚氯仿法提取噬菌体DNA，构建噬菌体基因组文库，通过Illumina Miseq进行测序并分析。通过NCBIBLASTn确定噬菌体DC1、DC2与已报道噬菌体基因组的相似性。
通过测序及分析可知，噬菌体DC1、DC2的基因组大小分别为156018bp、155908bp，且均为线性DNA。噬菌体DC1、DC2与NCBI比对结果如表1所示。通过表1可知，噬菌体DC1、DC2全基因组与已知的噬菌体全基因组相似性小于95％且彼此之间的相似度小于95％，表明噬菌体DC1、DC2属于新型噬菌体。对DC1和DC2基因组进行毒力基因和耐药基因的分析，未发现与毒力或耐药性相关的基因，表明将噬菌体DC1、DC2用于防控食源性致病菌时无潜在的安全风险。结合透射电子显微镜观察及国际病毒分类委员会最新分类可知，噬菌体DC1、DC2属于有尾噬菌体目Herelleviridae科。
表1噬菌体DC1、DC2与NCBI已有噬菌体基因组相似性比对
表1噬菌体DC1、DC2与NCBI已有噬菌体基因组相似性比对(续)
表2噬菌体DC1、DC2的全基因组基本信息
表2简要说明了噬菌体DC1、DC2的全基因组基本信息。噬菌体DC1共注释到245个ORF，其中28％的ORF(69/245)能注释到已知功能的蛋白；噬菌体DC2共注释到243个ORF，其中29％的ORF(71/243)能注释到已知功能的蛋白。这些ORF按功能可分为结构功能域、核酸代谢功能域、包装功能域、裂解功能域和其他功能域。
结构功能域包括：尾部纤维蛋白、主要衣壳蛋白、尾鞘蛋白、尾刺蛋白和噬菌体基板组装蛋白等。已经研究报道，噬菌体尾部纤维蛋白决定宿主范围，尾刺蛋白是一种抗菌物质。这表明噬菌体DC1与DC2的广谱性是由其尾部纤维基因所决定。
裂解功能域包括：裂解酶和穿孔素。根据作用于细胞壁肽聚糖的共价键位点和种类的不同可分为糖基水解酶、肽酶和酰胺酶。噬菌体DC1与DC2编码具有各种功能的裂解域，表明其具有很强的抑菌杀菌潜力。
噬菌体裂解域与尾部结构域基因功能分类如表3，其编码序列见序列表SEQ IDNO.1-20。
表3噬菌体DC1、DC2裂解域与尾部结构域基因功能分类
将噬菌体DC1命名为Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC1，其于2022年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号分别为：GDMCC No：62930-B1。
将噬菌体DC2命名为Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC2，其于2022年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号分别为：GDMCC No：62931-B1。
实施例4：噬菌体DC1、DC2基因组特征性分子靶标的挖掘与筛选
从NCBI核酸数据库中下载515株蜡样芽孢杆菌噬菌体的全基因组FASTA序列，用特征拆分指令拆分序列，使用Prokka对拆分得到的噬菌体基因组进行注释。接着使用Roaryv3.11.2进行泛基因组分析。
噬菌体DC1特有的差异分子靶标仅存在于噬菌体DC1中，噬菌体DC2特有的差异分子靶标仅存在于噬菌体DC2中。最终筛选到2个差异基因，与NCBI其他噬菌体基因进行比较发现，两个基因均为假定蛋白(如图1、图2)，1个噬菌体DC1特有的假定蛋白hp18，1个噬菌体DC2特有的假定蛋白hp206，其基因序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示。针对最终得到的靶标，设计引物通过PCR和凝胶电泳进一步验证，结果表明噬菌体DC1分子靶标hp18能特异性识别噬菌体DC1、噬菌体DC2分子靶标hp206能特异性识别噬菌体DC2(如图5)。引物序列如表4所示。
表4噬菌体DC1、DC2基因组特征性分子靶标PCR鉴定的引物序列
实施例5：噬菌体DC1、DC2宿主谱的测定
采用基于双层琼脂平板法的点滴试验测定噬菌体DC1、DC2的裂解范围。共测定了139株蜡样芽孢杆菌，其中包括66株致呕型蜡样芽孢杆菌(e-Bc)、73株巴氏奶和水产品不同ST型蜡样芽孢杆菌(Bc)，这些分离株分离自全国各地的食品样品。噬菌体DC1、DC2具有较宽的宿主范围，以裂解临床株在内的多种致呕型蜡样芽孢杆菌为主。DC1可以裂解72株/139株蜡样芽孢杆菌，DC2可以裂解81株/139株蜡样芽孢杆菌。结果如表5所示。
表5噬菌体DC1、DC2宿主谱
表5噬菌体DC1、DC2宿主谱(续)
表5噬菌体DC1、DC2宿主谱(续)
注：Bc为蜡样芽孢杆菌，e-Bc为致呕型蜡样芽孢杆菌。“++”表示清晰的噬菌斑，“+”表示模糊的噬菌斑，“-”表示噬菌体不能裂解。
实施例6：噬菌体DC1、DC2的保藏
上述分离的蜡样芽孢杆菌烈性噬菌体DC1(Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC 1)、DC2(Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC2)已送至广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，Bacillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC1保藏编号为：GDMCC No：62930-B1，Ba cillus cereus bacteriophage vB_BceM-DC2保藏编号为：GDMCC No：62931-B1，保藏日期为：2022年10月27日。
实施例7：噬菌体DC1、DC2的一步生长曲线
预先将TSB(1mM CaCl2)培养基及噬菌体在37℃保温。将过夜宿主菌蜡样芽孢杆菌892-1转接至3mL TSB中，振荡培养(37℃，200rpm)至对数期(2.5～3h)，取1mL宿主菌液离心(10,000g，1min)后重悬于1mLTSB中并测量OD600nm，根据细菌标准曲线计算菌液浓度，将宿主细胞稀释至1×108CFU/mL。然后将噬菌体(1×108PFU/mL)与宿主细胞在37℃预热5min，以感染复数(MOI)为0.1混匀，吸附5min后，离心(13,000g，4℃，1min)并用0.22μm滤头过滤上清液(未吸附噬菌体)，菌体重悬在1mL TSB(含1mM CaCl2)中，取50μL样品接入含50mL TSB(含1mM CaCl2)的锥形瓶中(稀释1000倍以防止随后的噬菌体吸附)。锥形瓶在37℃、120rpm下振荡培养，每隔5min取样一次(500μL)，通过0.22μm无菌注射器过滤。用双层琼脂平板法对样品中的噬菌体进行计数。实验一式三份独立进行，根据平均值绘制一步生长曲线。通过一步生长曲线(图6)可知，噬菌体DC1潜伏期为30min，裂解量39PFU/cell。而噬菌体DC2有较短的潜伏期为15min，更大的裂解量为124PFU/cell。
实施例8：噬菌体DC1、DC2的酸碱稳定性
用1M HCL和1M NaOH将TSB培养基调至不同pH(3～11)。取100μL噬菌体加入不同pH的TSB培养基中，使噬菌体终浓度为108PFU/mL。25℃孵育1h后，梯度稀释适当倍数，采用双层琼脂平板法测定不同pH下噬菌体的效价。通过实验可知，噬菌体DC1、DC2有着相似的稳定性，在pH为4～9之间稳定，在pH为10时活性下降，在pH为3和11时活性丧失(图7)
实施例9：噬菌体DC1、DC2的温度稳定性
取1mL效价为108PFU/mL的噬菌体分别置于4℃冰箱、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃恒温水浴锅中孵育1h，梯度稀释适当倍数，采用双层琼脂平板法测定不同温度下噬菌体的效价。通过实验可知，噬菌体DC1、DC2有着相似的温敏性，在温度为4～45℃稳定，55℃时活性下降，高于65℃后活性逐渐丧失(图8)。同时考虑到噬菌体在牛奶厂中的应用场景，测定了噬菌体DC1、DC2在3种商业化巴氏杀菌条件下的稳定性，噬菌体DCI、DC2在65℃恒温加热30min后失活，在72℃或85℃恒温保持15s后稳定(图9)。
实施例10：噬菌体DC1、DC2在牛奶中抑菌能力的测定
挑取蜡样芽孢杆菌892-1单菌落接种于3mL TSB试管中，并在37℃，200rpm下过夜培养12h，转接至新的3mL试管中培养3h(37℃，200rpm)，根据细菌标曲将菌液浓度调整到105CFU/mL。取500μL宿主菌(蜡样芽孢杆菌892-1)加入含有49mL UHT全脂牛奶的锥形瓶中(菌液最终浓度为103CFU/mL)，然后加入500μL噬菌体(MOI分别为1000和10000)混合。样品在25℃静置培养，分别于0h、3h、6h、12h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d取1mL样品，梯度稀释后用平板涂布法计数，测定噬菌体在牛奶中对蜡样芽孢杆菌892-1生长的抑制效果。
由图10可知，在培养6h后，与对照组比较，加入噬菌体DC1(MOI为1000和10000)的实验组中细菌数量显著降低，分别降低了0.87log10(CFU/mL)和4.31log10(CFU/mL)，特别是在MOI＝10000下，细菌数量降低至37CFU/mL。在12h，当MOI为100和1000时，实验组中细菌数量较对照组降低了4～5个log10。在24h，MOI＝1000的实验组中细菌数量增至7.55log10(CFU/mL)，与对照组无显著差异，但MOI＝10000的噬菌体DC1将细菌数量降低了2.18log10(CFU/mL)。培养48h后，实验组细菌数量与对照组无明显差异。总之，噬菌体DC1在前12h抑菌效果明显，有一定的潜力用于食品中蜡样芽孢杆菌污染的防控。
相比DC1，噬菌体DC2能持续抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌的生长，有较大的应用价值。由图11可知，培养3h后，实验组中细菌数量显著降低，分别降低了1.73log10(CFU/mL)和3.84log10(CFU/mL)；噬菌体处理6h后，细菌数量降低至不可计数水平(≤1CFU/mL)，在接下来的7天中无细菌生长。
SEQ ID NO.1(gp41-DC1 N-acetylmuramyls-L-alanine amidase核苷酸序列)
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atgcggtatatatgtgttacattagtagacatagaacaagaaaggaagttatgcatgaaacttaaatctatcatcacattaggtgcattgtcaacggggttcttcctatttggacaagacacagcttcagcaagtggtttcgacacagacaggagtattgtagactatctttaccacaatcaagaggatcacagctttggtcatcgtaaacaattgtcagaagcgtacggaatgtctaattacgtaggaacagaagctcagaacgtacaattacttaccatgcttaaagctgatagaggagtagctgctcctcagaaacaggtagcgcctgttcaacaaccaaaacaacaagctcaggttcaggttgaacctaagcaagaacaaccacaaggtaaaactttgatcgtggaagctactgcttacacaccacatccaagtgagaacggtggtacatacggtggacaagtattaacagctactggatttaacttaagtaagaatccaaacgcacgagttattgctgtagacccacgagtaattccattaggttctagagtatatgtagaaggctacggagaagcaatggctctagacactggcggagcaatcaaaggtaaccgtattgacgtacttttaccaacggattcccaggcaaatgcatggggacgtaagcaagttaagattacagtattaggtaaataaSEQ ID NO.3(gp90-DC1 tail lysin1核苷酸序列)
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atgactaccattgttaaaaggtatccgacattcgaaatcgaactcataacacaaaatacaccgtacttactaaagtacgatacacaaaaacaaatatcccaaaagtccttcgaagaagcattactttcttttagtgtgaagaactcgatgtcagatgacagtcctgcattctcatttgttatttctgctaaggaaaaatgggacaagattattaatgctaatgacctggtacgtattagagtgttccctgatgttacaaagggtgcccctgataatccgtacatcatggtaggtttagtttctgacattaagaaagaaggagaatatgctaacgggtctctactatatcgtgtaacgggacaagcgatgactaaagcattaatcaacttcgatgtcggggttattcaagaggtatcaacagttattgctagtactggttggttgcccgatgatccgcaaaaaggtctgaagttttctcagaacactgccgcaggtattggtaacgaactaatggaacgattcgtatacaaatacgctcaatacgatttcaacggtaaaggattaaaagactacttcgtacatagtttctcaagttggaaggaagacgaagccctagcagacgttactccattcattaactaccaaggtagtttacgccaattcttagatgatgtagtagctaaaccatttaacgagctattctttgagtttcaaaaggacggtaagtgtgcagcgttaatgagacctacaccttttgatcctgataaatggttcgcattacctacatatcgattcacaagtgacgtagtagtccaggaatcattcggtaagaacgataacgaaatgttctcaatcttcgttgtaggggcaccaaacttactagactataacagcgtagacttaggggtattcccgaaataccatcctgagctaatcaagaagtacggttacaaacgcctggatgcacagaaccgttacttgttatctaacagcggtacgatcgggcaaggcggaacaaatgctgcaacaccaggagcaggaaacggaacaggaacaccaccttcgggtaatgggacaggcggtatgccaacacctacacctgctacacaacctgcacctactgtgaaagaggaacctactaaaccacaagcaccgcagcagcctagctatgaggatgtactaactttcatcacagagaacaatttacaagaccctgaaacattgagacgtaaacgaaacgaagtgtacgcacagatcgtaggacagttctctacgatgcctgctagtatggttaacggaatcatagacgcattaaaagatggtaagttcggtcgtgaagtatacgcccaacttgttacatcggcaggatcaggcgcaggtggaggagcaactaaagagaagagtgttgacagtgagaagctaggtaagtacacacaaaagctattcaactggtactgtgagaacgctaacttctacagcggagacattcgtattctggggaaccctgcttacagattaggtgttcgtcttttatatgatgactttgaacaacagactacatgggagttctacttagaatcagtgcagcacgagttcagtttcacaggcggttacacgactgtattaggtgtaacacgaggtctaccgaacgaaggagctaaacgattcagtaacctatggggtaaatctgaagagttcaaaggtggatacttaggtgaggattcactagagaaactactagaaaatgctaaaaatgcgaacccaagtggaggtatgggtggcggaacaggctcaggaatgtggggcggaggagcaggcggaaacgtagcaatgaaggctctagctactgcacgagaaatgacaagcaaaccgtctatctatgtattcggtggagggcgttcaggtaacaacccgttcatgtcatctccaatccgtattgactgttcttcattcgtatggtggtgctataacgtacacggtgttcagcttaaaggtggagcaacgggtatgaccacagatacgattaaaaccgatcctcgactacaacagattagtgctcgtggctctaacaagagtatagcaatgagtcagattagggaaggggacattatctatttcgatacttataaacaggacgggcacgttggtatctattcaggtaatggtaaattcatcggttctcaaagtacaccaggtatccatgaagaagatttaagcacatcatactggcagaaagtgttcaacgggcacgttagacgctacgtagagggtgtcggaaacataatggtataaSEQ ID NO.5(gp98-DC1 peptidoglycanpeptidase核苷酸序列)
atggcgactgatctacaagcggcagatgtcatattctatagacctacgggcttcattggaagggtgattagttactttactaaatcaccctatagccatgttgctttagcgattaacgctaatacaataatcgaagcggatagatttacaaaaactaggatcgtacctatagagtatgataaaaatatcacacacatatatcgcttagagaacctaacgcaagaggaaagagaaaagattgtagagcttgcgactagtttagaaggtacggactatgactatgcacaaatacttgagatgtttgttcgaatagtattccgtattaaacgaactttattcaacaatcaaaagaaacttacatgctctgaagtcgtggacagatcattttatctagcgggagttatgcgaaaagatacggaatttctctatgatgtcactcctgaagaattaatacataaatatccactaactagagtgctttaaSEQ ID NO.6(gp143-DC1 SPP1 phage holin核苷酸序列)
atgatcgctgtggaagagaataaacaagtacagcaagaggagcaaacacacgttgagaaatctgtgtacgttcctgtagaggttccaaaagtagagccaatgatgattgttcgtttacttgtgttcttagttgctcttgttaacgcagtagcttctatgcttggttaccatcttgatttagcggtagaccaacaaaacgcatacgacatcatctcagcactattcttacttggttcaggtttctatgctacttggaagaataacaacatctcaaaacaatctcgtgtgcaagctcatgtagctaagcaagtacaggttgaagacaagaagggagaataaSEQ ID NO.7(gp216-DC1 Metal-dependent hydrolase核苷酸序列)
atgttaaactttatcggatgcgggagtgcatttaacacagctttaggtaacaacagtgctttcattaaggaaggtaacgtactattcatgattgactgtggtagtgctaacttcgacagaatcagacgtagcgacctgctagaaggtgtagaggaaattgtagtactaatgactcatacacaccccgaccatgtaggatcgcttggagaccttatcttcttcagtaaatataagatgggtaaaatgggagctatagcaaccactgtatatgctccatacgatatgaagattagtaaagtgttagaaggtatgggcgtaggtagagacgcttacagactaatccagtttgattcgtctaacgagtacccaccaggatttaaaaaaggtgacttccatattcaattctcagtggttcctacacgtcatgtgtcggcactacaatgttatgggtacctaatctcgtataaagaccaaacaatttactatagcggagactctaacttcatatctccatacattgctactatgcacgagcaaggtaaaatcgattacttctaccaagatacgtgtatagcagattacaaaggaaatgtacacctatctcttagagagcttagtgagcttatcaaggcgaatcgtggctcggtatactgtatgcacctggacgaaggttttgacgtagcagaagctaaaagactagggtttaacgttgtaaaacctattccacttaaggaggaaacaaattgaSEQ IDNO.8(gp70-DC1 tail spike protein核苷酸序列)
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SEQ ID NO.11(gp42-DC2 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase核苷酸序列)
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Claims (10)

1.噬菌体DC1，其保藏编号为：GDMCC No：62930-B1或噬菌体DC2，其保藏编号为：GDMCCNo：62931-B1。
2.权利要求1所述的噬菌体DC1或噬菌体DC2在非疾病诊断和治疗中抑制蜡样芽孢杆菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌892-1。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制蜡样芽孢杆菌是制成噬菌体制剂的形式使用，所述的噬菌体制剂是抑制食品或环境中蜡样芽孢杆菌的制剂。
5.一种抑制蜡样芽孢杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的噬菌体DC1或噬菌体DC2作为活性成分。
6.根据权利要求5所述的抑制蜡样芽孢杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，所述的噬菌体制剂是抑制人体、食品或环境中蜡样芽孢杆菌的制剂。
7.根据权利要求6所述的抑制蜡样芽孢杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，所述的食品是牛奶。
8.权利要求1中所述的噬菌体DC1的特征分子靶标hp18，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示或噬菌体DC2的特征分子靶标hp206，核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
9.一种鉴定权利要求1中所述的噬菌体DC1或噬菌体DC2的鉴定引物，其特征在于，当鉴定噬菌体DC1时，其鉴定引物为：TTCAAGTACTCGTCAAAGGTG和GTCTTCCCCTTTCATCCTAGC，当鉴定噬菌体DC2时，其鉴定引物为AGTACTAGCAGGATGTGCCG和ACAACCTTTCGGCTTTCCGT。
10.权利要求8中的特征分子靶标hp18、权利要求9中的鉴定噬菌体DC1的鉴定引物在鉴定权利要求1的噬菌体DC1中的应用或权利要求8中的特征分子靶标hp206、权利要求9中的鉴定噬菌体DC2的鉴定引物在鉴定权利要求1的噬菌体DC2中的应用。
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