CN114703148B - 一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体stp55及应用 - Google Patents

一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体stp55及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体STP55及应用，该噬菌体STP55为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体，其保藏编号：CCTCC NO：M 2022085；其具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围。基因组分析其不含任何与抗生素耐药性、毒素、溶原性和毒力因子相关的基因，从遗传背景上证实了该噬菌体的安全性。噬菌体STP55不仅能够抑制沙门氏菌和大肠杆菌产生的单双物种生物被膜的形成，还能够清除在生菜上已建立的生物被膜，因此该噬菌体可作为生物杀菌剂清除食品上形成的生物被膜，有效降低沙门氏菌和大肠杆菌的污染和传播。本发明提供的噬菌体为开发新型抗菌制剂提供了优良菌种资源，具有良好的应用开发前景。

Description

一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体STP55及应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体涉及一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体STP55及应用。
背景技术
沙门氏菌和致病性大肠杆菌是重要的食源性病原菌，在世界范围内经常被报道。沙门氏菌是一种人畜共患病病原体，是食源性疾病的主要原因之一，可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发烧和头痛等各种症状。大肠杆菌是肠杆菌科细菌家族的一员，是人类和温血动物胃肠道中最常见的共生菌体，也是引起肠炎、尿路感染、败血症和其他临床感染的主要原因。根据美国疾病控制和预防中心(CDC)的数据，仅在美国，这两种物种每年就分别导致数百万人患病，2000人和23000人住院，以及60人和450人死亡。此外，沙门氏菌和大肠杆菌还能够在各种食品设备表面和新鲜农产品上附着、定殖和形成生物膜，进一步加剧了它们的危险。
生物膜是嵌入在自身的细胞外基质中的多细胞群落，它们附着在非生物或生物表面上并生长。这些物种分泌胞外聚合物质(EPS)，维持细胞共同形成复杂的三维结构，并作为屏障。因此，生物被膜中的生物比浮游细胞更能耐受环境压力，这使得生物被膜难以抑制或根除。在自然界中，细菌可以形成单一物种的生物膜，也可以共存于多物种群落中，形成混合生物膜。一些研究表明，多物种生物膜由于其复杂的结构以及物种间和物种内的相互作用，对抗菌药物的敏感性更低。虽然提出了多种物理、化学和生物策略来控制生物膜，如天然物质、超声波、UV-C辐照、冷氧等离子体等。然而，这些方法的有效性有限，而且大多数技术实际上并不适合在食品工业中实施控制生物膜。因此，需要更好的方法来控制它们的污染。
近年来，噬菌体的应用被认为是控制细菌生物膜的一种新的生物方法，因为它允许通过噬菌体解聚酶的酶活性降解EPS。噬菌体处理被证明对减少由沙门氏菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌和副溶血性弧菌形成的生物膜有很高的效率。噬菌体依靠其细菌宿主进行繁殖，是地球上最丰富的生物实体，可以在任何可能的栖息地找到。它只感染细菌，不伤害人类，使其在食品和临床环境中使用是安全的。然而，噬菌体通常具有物种特异性甚至菌株特异性，这限制了噬菌体作为食品行业细菌污染生物控制的广泛应用。因此，在噬菌体对多物种生物膜处理的研究中，通过噬菌体鸡尾酒疗法进行。
为了达到这些目的，首先需要分离每个目标菌株的噬菌体，这可能会增加分离和验证这些噬菌体的劳动需求。最近，一些噬菌体被观察到感染不同属或种的菌株，称为多价噬菌体。例如，噬菌体EcS1能够感染志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌；噬菌体S144能够感染沙门氏菌、阪崎肠杆菌。这些噬菌体可能为多物种生物膜的控制提供新的策略。但是，很少有报道使用单一噬菌体控制由沙门氏菌和大肠杆菌形成的双物种生物膜。
发明内容
本发明的第一目的在于提供了一种能够同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体STP55，以此来丰富噬菌体种库，并进一步发展一种新型的生物防治手段。
为实现上述目的，本发明所设计一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体STP55，所述噬菌体STP55为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimuriumbacteriophage)STP55，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022085。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)STP55保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022085，保藏日期为2022年1月18日，地址：中国武汉武汉大学。
上述鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium bacteriophage)STP55为实验室分离纯化得到，其宿主为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028，该噬菌体在双层平板上能产生透亮、边缘清晰，直径为1mm的噬菌斑。透射电镜显示噬菌体STP55有一个二十面体头部约为74.51±4nm和一条长度为114.66±1nm的尾巴，还观察到尾巴底部有特殊的结构被称为“星”、“叉”或“尾刺”。进一步研究发现该噬菌体能够裂解不同血清型的沙门氏菌(S.Enteritidis、S.Typhimurium、S.Agora、S.Indiana、S.Paratyphi B、S.Pullorum、S.Dublin)和部分大肠杆菌；并且具有快速吸附沙门氏菌的特点(15min可达到最大吸附速率)；在pH为3-12，温度为30℃-80℃条件下具有良好的耐受性；MOI＝0.1条件下培养6h，其效价高达3.15×1010PFU/mL(具有较强的裂解活性，具有良好的应用前景)。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)STP55通过第二代基因组测序法得到其基因组，采用生物信息学方法分析其基因组。噬菌体STP55的全基因组大小为157,708bp，GC含量为44.57％，预测有207个开放阅读框和5个tRNA，其中102个开放阅读框被注释为已知功能，并在40,203bp到50,610bp之间编码4个尾纤维/尾刺蛋白。通过进化树分析结合其透射电镜结果，所述噬菌体STP55属于Caudovirales目，Ackermannvirida科，Cvivirinae亚科，Kuttervirus属噬菌体的新成员。
本发明的第二个目的在于提供一种噬菌体STP55的应用，具体为：
本发明提供了一种上述噬菌体STP55在制备生物杀菌剂中的应用。
进一步地，所述生物杀菌剂用于抑制或清除沙门氏菌或大肠杆菌及其它们二者的混合菌。
再进一步地，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028，所述大肠杆菌为大肠杆菌O157:H7。
再进一步地，所述生物杀菌剂用于抑制鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或大肠杆菌O157:H7或及其它们二者的混合菌的生物被膜形成。
再进一步地，所述生物杀菌剂用于清除鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或大肠杆菌O157:H7或及其它们二者的混合菌的生物被膜。
再进一步地，所述生物杀菌剂用于清除鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或大肠杆菌O157:H7或及其它们二者的混合菌在生菜上建立的生物被膜。
本发明还提供了一种生物杀菌剂，所述生物杀菌剂含有上述噬菌体STP55。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028，大肠杆菌O157:H7及其二者的混合菌形成的生物膜的抑制率分别为51.0％、47.8％和52.8％。此外，由鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和大肠杆菌O157:H7所建立的单菌种和双菌种生物膜在STP55作用8h后分别被清除了65.0％、72.9％和46.2％。并且在生菜上建立的由鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和E.coil O157:H7组成的双物种生物膜，通过扫描电镜(SEM)观察到噬菌体STP55破坏了其生物膜结构。本发明的有益效果：
1.本发明的噬菌体STP55具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围。基因组分析其不含任何与抗生素耐药性、毒素、溶原性和毒力因子相关的基因。
2.本发明将噬菌体STP55制备形成的生物杀菌剂能够在培养基中有效控制沙门氏菌和大肠杆菌的生长，同时可以高效抑制和清除鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028，大肠杆菌O157：H7及其二者的混合菌产生的单双物种生物膜。并且容易制备成喷洒液或淋洗液，对生菜中的生物膜进行清除。本发明的噬菌体属于天然生物材料，基因组中不含任何毒力基因，没有毒副作用，可以作为食品的抑菌剂，降低沙门氏菌和大肠杆菌的传播和引发食源性疾病的风险。
附图说明
图1为噬菌体STP55双层平板中的噬菌斑的图片，
图2为噬菌体STP55透射电镜照片，
图3为噬菌体STP55生物学特性图，
图中，A为噬菌体STP55的最佳感染复数图；
B为噬菌体STP55一步生长曲线图；
C为噬菌体STP55吸附速率曲线图；
D为噬菌体STP55的温度稳定性图；
E为噬菌体STP55的pH稳定性图；
F为噬菌体STP55的裂解曲线图，
图4为噬菌体STP55结构蛋白图，
图5为噬菌体STP55的进化树分析图，
图6为噬菌体STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和大肠杆菌O157：H7产生的单物种生物膜的抑制和清除作用图，
图中，A为噬菌体STP55对鼠伤寒杆菌ATCC 14028形成的生物膜抑制作用；
B为噬菌体STP55对大肠杆菌O157:H7形成的生物膜抑制作用；
C为噬菌体STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028形成的生物膜的清除作用；
D为噬菌体STP55对大肠杆菌O157:H7形成的生物膜的清除作用。
图7为噬菌体STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和大肠杆菌O157：H7产生的双物种生物膜的抑制和清除作用图，
图中，A为噬菌体STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和大肠杆菌O157:H7形成的双物种生物膜的抑制作用；
B为噬菌体STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和大肠杆菌O157:H7形成的双物种生物膜的清除作用，
图8为噬菌体STP55对生菜表面产生的双物种生物膜清除效果的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1噬菌体分离纯化及形态学分析
1.噬菌体分离纯化
污水样品采自湖北省武汉市某下水道。取污水样品(10mL)以10000×g离心10min，并将上清液通过0.22-μm无菌过滤器过滤。当鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028达到指数生长期时，将噬菌体滤液用LB培养基稀释，并与细菌悬浮液以1:5(v/v)的比例在37℃温育12-18h。然后在10000×g离心10min后收集噬菌体上清液，并接种到双层琼脂平板上，在37℃下分离噬菌体6-8h。挑选单个噬菌斑并再连续纯化5-10次。直到双层平板出现的噬菌斑大小、透明度一致，即为纯化好的噬菌体(图1)。短期保存将噬菌体悬液存放于4℃；长期保存将噬菌体悬液于甘油中(终浓度20％)存放于-80℃。
2.噬菌体形态学分析
将噬菌体采用磷钨酸负染色后，置于透射电子显微镜下观察噬菌体形态，具体操作步骤如下：铜网浸没于噬菌体液中10min之后用滤纸吸去多余液体，再将铜网置于磷钨酸染料中染色自然晾干至完全干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件Digital Micrograph Demo 3.9.1测量其大小(图2)。
结果显示：噬菌体STP55具有二十面体头部，头部直径为74.51±4nm，尾长为114.66±1nm，尾巴底部有特殊的结构被称为“星”、“叉”或“尾刺”，为Ackermannviridae病毒科成员的典型特征。
噬菌体STP55形成的噬菌斑呈圆形透明状，直径1mm左右，边界清楚无晕环，头部呈二十面结构，头部直径长74.51±4nm，尾长为114.66±1nm，尾巴底部有特殊的结构，属于Ackermannviridae病毒科；该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimuriumbacteriophage)STP55保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2022085，保藏日期为2022年1月18日，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2噬菌体STP55生物学特性分析
1.噬菌体STP55宿主谱的测定
噬菌体宿主谱的测定采用点样法。取100μL培养至对数期的待测定菌液加入到温热的半固体培养基中，混匀后倒入预先制备好的LA平板上，待凝固后，取5μL效价109PFU/mL的噬菌体滴加至上层平板表面，干燥后倒置于37℃培养箱培养4h～6h，观察裂解情况，结果如表1。
结果所示，噬菌体STP55不仅对40株沙门氏菌中的31株具有一定的裂解能力(77.5％)，而且对11株大肠杆菌中的3株具有一定的裂解能力(27.3％)，并且能够裂解大多数的耐药菌。表明噬菌体STP55可能是开发同时抑制沙门氏菌和大肠杆菌菌株的新型生防剂的一个很好的候选者。
表1噬菌体STP55宿主谱的测定
注：a R,Drug-resistant organism strain；S,Sensitive organism strain.
b++strong intensity(Clear plaque)；+weak intensity(Opaque plaque)；-nolytic activity(No plaque).c ATCC,American Type Culture Collection.CMCC,Centerfor Medical Culture Collections.CVCC,China Veterinary Culture CollectionCenter.CICC,China Center of Industrial Culture Collection.SJTU,Shanghai JiaoTong University.
2.噬菌体最佳感染复数(MOI)
感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)是指初始感染时噬菌体的数量与宿主菌数量的比值。按一定的MOI值(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000)将噬菌体与宿主菌混合，37℃培养3.5h，8000r/min离心10min，用双层平板法测定不同MOI值样品中上清液的噬菌体效价。试验设3个平行。结果见图3A，噬菌体在MOI＝0.1时，噬菌体效价达到最大，即噬菌体的最佳感染复数为0.1，表明在噬菌体效价与宿主菌菌量以0.1比例混合感染时，可增殖出更多的噬菌体。
3.一步生长曲线
噬菌体的一步生长曲线可直观的反应其生长规律。将噬菌体和宿主菌按最适MOI值混合，37℃温育10min左右，使噬菌体吸附于细菌上，于4℃、8000r/min离心2min，弃上清，用等体积LB重悬，重复2次，以除去未吸附的噬菌体。将上述液体加入到9mL LB液体培养基中，每隔10min取样300μL，8000r/min离心2min，采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。结果见图3B，从一步生长曲线可以看出噬菌体的潜伏期、裂解期。噬菌体STP55的潜伏期为10min、裂解期10-90min。通过实验结果得到噬菌体STP55的裂解量为46.67PFU/cell。
4.吸附速率
按最适MOI值将新鲜噬菌体液与宿主菌悬液混合于离心管中，置于37℃摇床培养。从0min开始，每隔3min采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。吸附速率＝1－(每个时间点未吸附的噬菌体效价/0min时噬菌体效价)×100％，噬菌体对宿主菌的吸附速率结果如图3C所示。由图3C可以看出，噬菌体STP55的最佳吸附速率为87.76％达到最佳吸附速率的时间为15min，此时噬菌体以最大量吸附于宿主菌上。
5.噬菌体稳定性分析
将噬菌体原液稀释至106PFU/mL，并分装于1mL无菌离心管中，将离心管分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中，0min、30min和60min时测定各管中噬菌体的效价。试验设3个平行。由图3D可知，噬菌体STP55在30℃温育30min效价基本维持稳定，30min后活性略微下降；在40℃、50℃和60℃温育1h内，效价持续下降，但没有完全失活；在70℃和80℃作用下，30min后噬菌体就完全失活。说明噬菌体STP55在过高温度的处理下会影响活性。
取已知效价的噬菌体悬液(107PFU/mL)100μL加入到900μL不同pH值(2～13)的PBS缓冲液中，将其置于37℃水浴锅2h后测定各离心管中噬菌体的效价。试验设3个平行。由图3E可知，噬菌体在pH 4～12时均保持稳定的滴度即高活性，而在pH 3和pH 13时，效价基本降为0，说明强酸强碱直接破坏噬菌体的活性。
6.噬菌体的裂解能力
噬菌体分别按照MOI＝1000、100、10、1、0.1、0.01、0.01，各取100μL加入96孔板中，并加入100μL的107CFU/mL宿主菌菌液。另设空白对照加入200μL LB培养基；阳性对照加入100μL 107CFU/mL的宿主菌菌液和100μL LB培养基。每隔1h测定600nm处的吸光值OD600，总共测定10h。结果如图3F所示，在3h以内实验组的吸光值都呈现上升的趋势，但相比于阴性对照，上升的速率较缓，说明噬菌体STP55对宿主菌是有一定的抑制作用。3h后，MOI为0.1、0.01、0.001的实验组吸光值明显下降，说明对宿主菌生长的抑制能力更强。但是噬菌体STP55的最佳MOI为0.1，可能是因为测量体积小(200μL)，且培养条件是静态的。
实施例3噬菌体STP55结构蛋白分析
为了分析噬菌体STP55结构蛋白，使用12％的丙烯酰胺对高度纯化的噬菌体样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。银染溶液用于染色样品。然后用凝胶扫描仪(Biorad Gel Doc XR+，中国上海)拍摄图像。结果如图4所示，在凝胶中发现了11条主要的蛋白条带，表明噬菌体STP55颗粒包含至少11种结构蛋白，相对分子量为15-170kDa。最终确定每个结构蛋白还需要通过质谱法或完整的基因组注释来鉴定。
实施例4噬菌体STP55基因组的提取与全基因组denovo测序
1.噬菌体STP55基因组的提取
(1)取1mL高效价的噬菌体悬液，加入20μL的1mg/mL脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ和20μL的10mg/mL核糖核酸酶RNase A，涡旋混匀，于37℃温育40min。
(2)加入20μL 2mol/L ZnCl2，37℃温育7min。
(3)于10000r/min离心1min，弃上清，加入500μL TES buffer，吹吸至澄清透明的状态，于65℃水浴15min。
(4)加入10μL的20mg/mL蛋白酶k，用枪头轻轻吹吸，上下颠倒，50℃温育1h，每隔10min上下颠倒一下。
(5)温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L醋酸钾(用醋酸调pH至5.2)，冰上放置15min。
(6)于4℃、12000r/min离心10min，取上清，加入600μL苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，上下轻柔反复颠倒。
(7)于常温下12000r/min离心10min，取上层液体加入1倍体积的异丙醇在-20℃沉淀DNA。
(8)于4℃、12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇洗一次，于12000r/min离心10min，弃上清，再离心1min，小心吸去剩余乙醇，放在37℃培养箱至少40min风干。
(9)加20μL TE在常温下溶解DNA，获得基因组DNA样品于-20℃保存。
2.噬菌体STP55全基因组测序及分析
采用全基因组鸟枪法(Whole Genome Shotgun，WGS)策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illumina HiSeq测序平台，对这些文库进行双末端(Paired-end，PE)测序。采用A5-miseq v20150522对去除接头序列的测序数据进行从头拼装。利用DNAStar和Bioedit分析STP55基因组序列的基本特征。使用RAST(http://rast.nmpdr.org/rast.cgi)、ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和GeneMark(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/gmhmmp.cgi)注释服务器来预测假定的ORF。使用NCBI在线工具BLASTp结合保守结构域对假定的ORF进行功能注释。使用tRNAScan-SE(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAScan-SE/)筛选编码tRNA的基因。通过抗生素耐药基因数据库(ARDB，https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)和毒力因子数据库(VFDB，http://www.mgc.ac.cn/VFs/)对可能的耐药基因和毒力因子基因进行鉴定。使用默认参数通过ClustriW算法进行终止酶大亚基的多个序列比对，并使用MEGA7程序通过邻接法构建和显示相关的系统发育树。
全基因分析显示，噬菌体STP55的基因组全长157，708bp，碱基分布情况为A(28.18％)、T(27.25％)、C(22.02％)、G(22.55％)，GC平均含量为44.57％。使用RAST、GeneMarkS和ORF Finder三种预测工具进行基因预测共得到207个开放阅读框(OpenReading Frame,ORF)和5个tRNA，其中102个开放阅读框被注释为已知功能(如表2所示)。编码假定功能蛋白的基因可分为五类:核酸代谢及DNA包装(RIIA噬菌体蛋白、RIIB噬菌体蛋白、DNA聚合酶、核酸内切酶、DNA结合酶、DNA解旋酶、胸腺苷酸合成酶、dUTP二磷酸酶)、除尾部相关蛋白外的结构蛋白(颈蛋白、门脉蛋白、头部完成蛋白、膜蛋白、衣壳蛋白)、与宿主裂解相关的(内溶酶、LysM肽聚糖结合结构域蛋白、尾溶菌酶)、尾部相相关蛋白(基板楔形亚基、尾纤维/尾穗蛋白、尾鞘稳定蛋白、尾鞘蛋白、尾管蛋白)和未分类的。此外，在噬菌体STP55的基因组中没有检测到任何毒力和抗生素耐药性基因。噬菌体STP55在40,203bp到50,610bp之间编码4个尾纤维/尾刺蛋白(ORF 54，55，56和57)(如表3所示)，进一步分析发现ORF55与沙门氏菌噬菌体SFP10的gp162高度一致，SFP10在沙门氏菌中的受体是O1抗原，推测O1抗原可能是沙门氏菌感染时STP55噬菌体的特异性受体。此外，ORF55具有特有的尾刺蛋白结构域，包括P22尾穗(cl07762)结构域(表3)。有报道称，沙门氏菌噬菌体P22的尾刺蛋白是一种病毒粘附蛋白，具有受体结合和破坏活性，因此推测ORF55可能对宿主细胞具有结合活性，可能作为分子识别元件用于沙门氏菌的检测；而ORF56的整个氨基酸序列与CBA120的ORF211具有高度同一性，CBA 120的ORF 211编码一种推定的纤维，以识别和结合E.coil O157：H7的O-抗原，可能是STP55能够感染大肠杆菌的原因。
表2噬菌体STP55开放阅读框的注释
表3.噬菌体STP55尾纤维/尾刺蛋白的特征
实施例5噬菌体STP55对沙门氏菌、大肠杆菌及混合菌生物被膜的影响
1.噬菌体STP55处理对沙门氏菌、大肠杆菌及混合菌生物被膜的抑制作用
采用结晶紫染色法和活细胞计数法检测噬菌体STP55对鼠伤寒杆菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7及混合菌生物被膜形成的抑制能力。将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7培养至对数增长期后，调整菌液浓度为1.0×109CFU/mL。取100μL的噬菌体STP55(1.0×108PFU/mL)与100μL的细菌培养物(1.0×109CFU/mL)混合在96孔板上(混合菌液：鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7按1:1比例混合)；阴性对照组，在孔中加入100μL LB液体培养基；37℃培养箱静置培养6、12和24h。
活细胞计数法：
(1)培养完成后，吸出悬浮菌液，用PBS缓冲液(200μL)清洗生物膜3次，去除多余的培养基和浮游细胞。
(2)加入100μL PBS缓冲液机械刮片重悬生物膜，稀释后涂于琼脂平板上，进行菌落计数。实验重复三次。
结晶紫染色步骤：
(1)培养完成后，吸出悬浮菌液，200μL PBS缓冲液冲洗孔3次，将96孔板置于50℃烘箱中烘干1h；
(2)每孔加入200μL 0.1％结晶紫溶液，室温染色30min；吸出染色液，用PBS轻柔洗涤后，烘干；
(3)每孔加入200μL 95％乙醇，直至完全溶解。利用酶标仪在595nm下测定吸光度。实验重复三次。
根据比色法观察，对照组在培养过程中，生物膜的质量不断增加。而经噬菌体STP55处理后，对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028生物膜形成的最大抑制率达到51.0％。对大肠杆菌O157:H7的生物膜形成抑制作用是在6h后达到最大抑制，最大抑制率为47.8％。对于混合菌培养6h后，生物被膜量增加到1.4，比对照降低48.6％，24h后抑制率最大达到52.8％。通过活细胞计数法对生物被膜抑制的进一步分析，在对照组的整个孵育期内，鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7及混合菌细胞的活菌数没有显著变化。而当噬菌体STP55存在的情况下，鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7及混合菌活菌数最低分别比对照低1.8、1.6、1.7log10CFU/well。
2.噬菌体STP55处理对沙门氏菌、大肠杆菌及混合菌生物被膜的清除作用
将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7培养至对数增长期后，调整菌液浓度为109CFU/mL。取100μL的细菌培养物(1.0×109CFU/mL)与100μL LB液体培养基混合在96孔板上(混合菌液：鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7各取50μL)；将96孔板置于37℃培养箱静置培养24h。吸出悬浮菌液，200μL PBS缓冲液冲洗孔3次；实验组加入200μL噬菌体STP55(1.0×108PFU/mL)，阴性对照组加入200μL LB液体培养基；37℃分别处理2、6和8h；然后采用结晶紫染色和活细胞计数法(具体方法见1)检测噬菌体STP55对鼠伤寒杆菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7及混合菌形成的生物被膜的去除能力。
噬菌体STP55应用于由鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、大肠杆菌O157:H7和混合菌已建立的生物膜，根据比色法观察，在无噬菌体的情况下，生物被膜的质量不断增加。与对照组相比，建立的生物膜经噬菌体STP55处理后迅速减少。当处理8h后鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、大肠杆菌O157:H7和混合菌的生物膜分别减少了65.0％、72.9％和46.2％。同样，经噬菌体STP55处理后，生物膜的活细胞数也都明显低于对照组，都＞1log10CFU/well。
实施例6噬菌体STP55处理在生菜中形成的生物被膜的影响
将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7培养至对数增长期后，调整菌液浓度为109CFU/mL。从当地超市买的新鲜生菜用蒸馏水冲洗2min后用无菌剪刀切成3×3cm小块，并置于无菌培养皿中，紫外照射生菜样品正反面各半小时后确保无菌，备用；将生菜片在细菌悬浮液中浸泡2min，然后取出无菌培养皿，在无菌操作台中风干20min,置于无菌水浸过的滤纸上，37℃培养24h，密封于培养皿中形成生物膜；孵育后，将生菜片从培养皿中取出，用无菌蒸馏水洗涤两次，去除未附着的细胞，然后将生菜片在噬菌体STP55悬液(108PFU/mL)中浸泡10min，然后转移到无菌培养皿中，风干20min。对照组用LB代替噬菌体悬液。37℃孵育2h后，将每个样品浸泡在1mL PBS缓冲液中，充分研磨、稀释后涂于琼脂平板上进行菌落计数。其他样品用PBS洗涤2次，用2.5％预冷戊二醛在室温黑暗中固定2h。PBS缓冲液洗涤细胞2次，然后以不断增加的乙醇梯度(15％、30％、40％、50％、70％、100％v/v)脱水15min。然后将细胞干燥过夜，在20kV加速电压下扫描电镜观察结果。
用活菌计数法评价噬菌体STP55对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7和混合菌在生菜上形成的生物膜的清除作用。与对照组相比，噬菌体STP55能够更有效地去除生菜上产生的生物膜。采用扫描电子显微镜(SEM)观察噬菌体STP55处理2h后对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌O157:H7在生菜表面形成双物种生物膜的物理形态和效果。
扫描电镜(SEM)分析表明：未处理的样品形成了典型的生物膜，生物膜结构致密，细胞混合。经噬菌体处理后，混合生物膜的结构发生了明显的变化：网状基质的结构比未经处理的生物膜更扁平、更松散。细胞的密集结构出现分散，混合细胞的丰富度基质减少。多数细胞为游离漂浮的单细胞，表明生物膜被破坏。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一株能同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体STP55，其特征在于，所述噬菌体STP55为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体（Salmonella Typhimuriumbacteriophage）STP55，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022085。
2.根据权利要求1所述噬菌体STP55，其特征在于，所述噬菌体STP55在pH为3-12，温度为30℃-80℃条件下具有良好的耐受性；其15 min达到最大吸附速率；MOI = 0.1条件下培养6 h，其效价高达3.15×1010 PFU/mL。
3.一种权利要求1所述噬菌体STP55在制备生物杀菌剂中的应用，其特征在于：所述生物杀菌剂用于抑制或清除沙门氏菌或大肠杆菌或它们二者的混合菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，所述大肠杆菌为大肠杆菌O157: H7。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生物杀菌剂用于抑制鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或大肠杆菌O157: H7或它们二者的混合菌的生物被膜形成。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生物杀菌剂用于清除鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或大肠杆菌O157: H7或它们二者的混合菌的生物被膜。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述生物杀菌剂用于清除鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或大肠杆菌O157: H7或它们二者的混合菌在生菜上建立的生物被膜。
8.一种生物杀菌剂，其特征在于，所述生物杀菌剂含有权利要求1所述噬菌体STP55。
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Genomic characterization of a novel bacteriophage STP55 revealed its prominent capacity in disrupting the dual-species biofilm formed by Salmonella Typhimurium and Escherichia coli O157: H7 strains;Wenjuan Zhu et al;Archives of Microbiology;第204卷(第10期);文献号：597 *

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