CN112391355B - 哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS-yong3及其应用 - Google Patents

哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS-yong3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS‑yong 3及其应用，涉及哈维氏弧菌污染和感染的生物处理。vB_VhaS‑yong 3保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18195。vB_VhaS‑yong 3具有呈现二十面体近似球形的结构的头部，直径约为65nm，具有非常长的尾部，约为1.1um。vB_VhaS‑yong 3在哈维氏弧菌SZT平板上形成透明噬菌斑，可使其菌液澄清化，能显著降低生鱼片中哈维氏弧菌数量。vB_VhaS‑yong 3的应用，用于特异性地抑制、杀死哈维氏弧菌。

Description

哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS-yong3及其应用
技术领域
本发明涉及一种病原菌的噬菌体，尤其是涉及一种哈维氏弧菌高效烈性噬菌体vB_VhaS-yong 3及其应用。
背景技术
为了防控疾病，抗生素和消毒剂被广泛使用。然而，滥用抗生素使细菌产生耐药性，超级细菌不断产生，严重威胁人类和动物健康；抗生素和消毒剂没有专一性，破坏我们依赖的正常菌群，损害健康并危害环境的微生态平衡；养殖产品中残留的抗生素等残留药物一旦被人体摄入，会影响肠道细菌群落、抑制免疫系统，危害人类健康。
噬菌体(phage)是感染细菌、真菌的病毒。根据生命周期的不同，噬菌体可以分为裂解性噬菌体(lytic phage)和温和性噬菌体(temperate phage)。裂解性噬菌体又可以称为烈性噬菌体或者毒性噬菌体(virulent phage)。裂解性噬菌体进入宿主菌体内后，开始了自己的生命循环，进行不断地复制、增殖得到大量的子代噬菌体，宿主菌被裂解；温和性噬菌体进入宿主菌后，将自身的基因组整合于宿主菌的基因组中，并随着宿主菌的不断分裂传递给子代。噬菌体安全性较高，是最具潜力的抗生素替代品。烈性噬菌体在抗菌药物研发方面具有巨大的潜力和优势。烈性噬菌体特异性侵染目标细菌，将其裂解，并且不感染人和动、植物，也不会对正常微生物群落和环境造成污染，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内。
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)属于弧菌科，弧菌属。哈维氏弧菌广泛分布于养殖海水、浮游动植物体表、海底沉积物以及水产动物体内外。因宿主种类和自身健康状况差异的原因，感染哈维氏弧菌而呈现不同症状，如大黄鱼的“烂尾病”、花鲈的“体表溃烂病”和遮目鱼的“眼病”等。在海水鱼的病害中，细菌性疾病以弧菌病(vibriosis)的危害最为严重，在世界范围内流行，并造成巨大的经济损失。其中哈维氏弧菌是海水水产养殖中主要病原菌之一，它不但能引起海水鱼、虾、贝如大黄鱼、石斑鱼、绸、鲈鱼、文蛤、对虾、蟹等多种水产动物的疾病，面且还能通过食物链进而引起食物中毒，是人、鱼、虾、蟹、贝共患病病原。所以研发能够高效裂解哈维氏弧菌的噬菌体具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效、快速地裂解哈维氏弧菌的噬菌体及其应用。该噬菌体特异性感染、裂解哈维氏弧菌。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以致病性哈维氏弧菌SZT株为靶标分离获得的特异侵染哈维氏弧菌的裂解性噬菌体，依据噬菌体命名原则命名为vB_VhaS-yong 3(即Virus of bacteria，Vibrio harveyi，Siphoviridae的缩写)，分类上属于长尾科Siphoviridae。vB_VhaS-yong 3于2019年7月10日保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18195，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
该噬菌体的生物学特征如下：噬菌体vB_VhaS-yong 3是一株新的具有极长尾的未被报道过的噬菌体，具有呈现二十面体近似球形的头部，直径约65nm，尾部长度约1.1um；噬菌体vB_VhaS-yong 3在哈维氏弧菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑；噬菌体vB_VhaS-yong 3可裂解哈维氏弧菌，使菌液澄清化；噬菌体vB_VhaS-yong 3的宿主范围具有株特异性；BLAST显示，在genbank与vB_yhaS-yong 3的Phage tail length tape-measureprotein氨基酸序列同源性最高的为Vibrio phage pVp-1的tail protein，同源性为84.69％。
上述噬菌体vB_VhaS-yong 3的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)哈维氏弧菌SZT株的活化、培养
取SZT菌种划线接种于含2％(W/V)琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水液体培养基的试管内，摇床(29℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(29℃、180rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.6(约3h)，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集、分离
自浙江省宁波市鼓楼中心菜场购买活贻贝，实验室解剖，取消化囊，在冰水浴中匀浆，加入5倍体积的LB海水液体培养基混匀后，离心(4℃，10000g，10min)。取60mL上清液于锥形瓶中，在瓶中加入1mL对数期SZT菌液(OD600≈0.6)，混匀后放置于摇床(29℃、220rpm)上培养3小时进行噬菌体初步富集。将培养液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤。取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL3×LB海水液体培养基、100μL对数期SZT菌液混匀，作为实验组。另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期SZT菌液混匀，作为对照组。将实验组、对照组试管放置于摇床(29℃、220rpm)上培养，至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片，取实验组培养液继续下一步实验或者4℃避光暂存。
(3)噬菌体的纯化
将步骤(2)获得的噬菌体培养液离心(4℃，10000g，10min)取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期SZT菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份4mL分装的含0.7％(W/V)琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于37℃预热30min以上的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平。待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期SZT菌液中，摇床(29℃、220rpm)上培养至宿主菌裂解澄清。将培养液离心(4℃，10000g，10min)后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液。取新噬菌体原液继续使用上述双层平板法，重复进行三代噬菌体纯化实验，即得到纯化培养的噬菌体vB_VhaS-yong 3原液。
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的噬菌体vB_VhaS-yong 3原液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，将过滤液与对数期SZT菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期SZT菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，220rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养。将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存。
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-yong 3悬液。
上述裂解性噬菌体vB_VhaS-yong 3的应用，用于抑制哈维氏弧菌生长并杀死哈维氏弧菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种新的哈维氏弧菌裂解性噬菌体vB_VhaS-yong 3及其分离方法和应用，此裂解病毒vB_VhaS-yong 3具有高复制率、高感染率的特点，可高效裂解哈维氏弧菌；该病毒具有高特异性，专一性感染、裂解哈维氏弧菌，这是保证生态安全的重要前提；经增殖后的噬菌体原液效价高，在本发明中，噬菌体vB_VhaS-yong 3的效价≥108pfu/mL，培养大量vB_VhaS-yong 3较为容易；操作简单，且不会造成环境污染；vB_VhaS-yong 3可显著降低生鱼片中哈维氏弧菌的数量，添加vB_VhaS-yong 3六小时后，噬菌体添加组的生鱼片中的菌量是未添加的对照组的0.1％；是一种新型的控制哈维氏弧菌的技术，具有良好的发展前景。
vB_VhaS-yong 3形态新奇，尾部长度超过了迄今为止各文库、网站中经分离鉴定的所有弧菌噬菌体。
综上所述，本发明提供一种新的哈维氏弧菌裂解性噬菌体vB_VhaS-yong 3及其分离方法和应用，该噬菌体可高效、快速、专一地感染、杀死哈维氏弧菌。
附图说明
图1为噬菌体vB_VhaS-yong 3在哈维氏弧菌SZT双层平板上的噬菌斑形态
图2左侧试管为哈维氏弧菌SZT对照菌液，右侧试管中的SZT菌液因添加了噬菌体vB_VhaS-yong 3而变澄清。
图3为负染的噬菌体vB_VhaS-yong 3的透射电镜图
图4为噬菌体vB_VhaS-Yong 3的Phage tail length tape-measure protein的氨基酸序列在Genbank中进行Blastp比对的结果
图5为噬菌体vB_VhaS-yong 3在鱼片中使用时鱼片菌量检测结果折线图
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述
实施例1
噬菌体vB_VhaS-yong 3的分离纯化
噬菌体vB_VhaS-yong 3分离自贻贝消化囊，其中贻贝购自浙江省宁波市鼓楼中心菜场，噬菌体vB_VhaS-yong 3的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)哈维氏弧菌SZT株的活化、培养
取SZT菌种划线接种于含2％(W/V)琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水液体培养基的试管内，摇床(29℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(29℃、180rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.6(约3h)，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集、分离
自浙江省宁波市鼓楼中心菜场购买活贻贝，实验室解剖，取消化囊，在冰水浴中匀浆，加入5倍体积的LB海水液体培养基混匀后，离心(4℃，10000g，10min)。取60mL上清液于锥形瓶中，在瓶中加入1mL对数期SZT菌液(OD600≈0.6)，混匀后放置于摇床(29℃、220rpm)上培养3小时进行噬菌体初步富集。将培养液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤。取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL3×LB海水液体培养基、100μL对数期SZT菌液混匀，作为实验组。另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期SZT菌液混匀，作为对照组。将实验组、对照组试管放置于摇床(29℃、220rpm)上培养，至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片，取实验组培养液继续下一步实验或者4℃避光暂存。
(3)噬菌体的纯化
将步骤(2)获得的噬菌体培养液离心(4℃，10000g，10min)取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期SZT菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份4mL分装的含0.7％(W/V)琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于37℃预热30min以上的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平。待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期SZT菌液中，摇床(29℃、220rpm)上培养至宿主菌裂解澄清。将培养液离心(4℃，10000g，10min)后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液。取新噬菌体原液继续使用上述双层平板法，重复进行三代噬菌体纯化实验，即得到纯化培养的噬菌体vB_VhaS-yong 3原液。
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的噬菌体vB_VhaS-yong 3原液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，将过滤液与对数期SZT菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期SZT菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，220rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养。将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存。
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-yong 3悬液。
将纯化的噬菌体vB_VhaS-yong 3与对数生长期的哈维氏弧菌SZT感染混合，进行噬菌斑实验，可以得到透明的圆形噬菌斑，(图1)。将噬菌体vB_VhaS-yong 3添加至哈维氏弧菌SZT菌液后，菌体裂解菌液变得澄清(图2)。
其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用过滤海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min。3×LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用过滤海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min。
该纯化的噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.18195，保藏日期2019年7月10日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2
噬菌体vB_VhaS-yong 3的形态观察
取实施例1新鲜感染(三天内)分离纯化的噬菌体-菌培养裂解液先低速离心(4℃，12000g，15min)弃沉淀，取上清再次离心(4℃，18000g，10min)弃沉淀，然后取1mL第二次离心的上清液做高速离心(4℃，58000g，1h)，充分弃上清，在离心管中轻轻加满经过棉花过滤并高温灭菌且冷却的海水，倒掉海水后，加入200μL的上述灭菌海水，4℃放置，等沉淀泡松后，低速漩涡震荡充分混匀，得到观察用的噬菌体悬液。电镜观察前用纯水将噬菌体悬液稀释10-100倍，用移液枪取一滴稀释噬菌体悬液至铜网上，静置10min后用中性滤纸从侧面轻轻吸去多余水分。在铜网上滴一滴3％乙酸双氧铀，染色30s后，迅速用中性滤纸从侧面吸去染色剂。静置10min晾干后使用透射电镜(日立H-7650)观察噬菌体形态。
该噬菌体vB_VhaS-yong 3具有呈现二十面体近似球形的结构的头部(图3)，直径约为65nm，具有非常长的尾部，约为1.1um。vB_VhaS-yong 3尾部长度超过了迄今为止各文库、网站中经分离鉴定的所有弧菌噬菌体。
实施例3
噬菌体vB_VhaS-yong 3的序列分析包括如下步骤：
基因组提取：在噬菌体vB_VhaS-yong 3悬液中加入DNase I和RNase A至终浓度1μg/mL，37℃过夜消化，80℃灭活15min。体系中加入裂解液(0.5％SDS，50μg/mL蛋白酶K，20nMEDTA，均为终浓度)，56℃孵育1h。加入等体积平衡酚，温和振荡后4℃下10000g离心5min。收集上层液体，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，温和振荡后4℃下10000g离心5min。收集上层液体，加入等体积氯仿，充分混匀后10000g离心5min，收集上层液体，重复2次。加入等体积异丙醇，-20℃放置至少30min，4℃下10000g离心20min，沉淀用75％乙醇洗2次。将核酸沉淀用去离子水重悬，-20℃保存。
基因组文库构建：使用试剂盒NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit forIllumina(#E7645)构建基因组文库。步骤包括1、基因组片段化：将提取的噬菌体基因组用Covaris超声波破碎仪(30s，90s，11min，L)随机打断，得到的DNA片段长度主要集中在500bp。2、末端修复：取50μL打断后的DNA片段到无核酸酶的1.5ml EP管中，分别加入3μLNEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix和7μL NEBNext Ultra II End Prep ReactionB uffer后混匀。20℃孵育30min，65℃孵育30min，4℃保存。3、添加测序接头：在上步体系中加入30μL NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、1μL NEBNext Ligation Enhancer、2.5μL NEBNext Adaptor，混匀。20℃下孵育15min。加入3μLEnzyme，充分混匀，37℃孵育15min。4、磁珠片段筛选：在上步体系中加入20μL重悬的AMPure XP磁珠，充分混匀，室温下孵育5min。将EP管置于磁力架上，轻轻旋转分开溶液与磁珠，溶液澄清后，将上清液转移到新EP管中。在上清液中加入10μL重悬的AMPure XP磁珠，充分混匀，在室温下孵育5min。将EP管置于磁力架上，轻轻旋转分开溶液与磁珠，溶液澄清后，弃上清液，保留含有所需DNA的磁珠。加入200μL新鲜制备的80％乙醇，室温下孵育30s，弃上清液，重复2次。将EP管置于磁力架上，打开盖子将磁珠干燥5min。取下EP管，加入17μL无核酸酶水将DNA洗脱，在漩涡振荡器上充分混匀，室温下孵育2min。将EP管放在磁力架上，静置3min后，吸出15μL上清液到PCR管中备用。5、添加Index、PCR扩增：在上一步获得的15μL核酸中，加入25μL NEBNextUltra II Q5 Master Mix、5μL Index Primer/i7 Primer、5μL Universal PCR Primer/i5Primer，充分混匀。进行PCR扩增，反应条件如下：98℃30秒；98℃10秒，65℃70秒，10个循环；最后65℃延伸5min。6、PCR产物纯化：将PCR产物转移至无核酸酶的1.5mL EP管中，加入45μL重悬的AMPure XP磁珠，充分混匀，室温下孵育5min。将EP管置于磁力架上，溶液澄清后，弃去上清液，保留含有所需DNA的磁珠。加入200μL新鲜制备的80％乙醇，室温下孵育30s，弃上清液，重复2次。将EP管置于磁力架上，打开盖子将磁珠干燥5min。取下EP管，加入33μL无核酸酶水洗脱DNA，充分混匀，室温下孵育2min。将EP管放在磁力架上，取30μL溶液移到新的EP管中。使用Qubit测定DNA含量。
上机测序：照Agilent High sensitivity DNA kit 2100说明书鉴定纯化后PCR产物的片段分布。通过实时荧光定量PCR进行定量，根据上机需求量将DNA样品进行混合，最后加入NaOH使DNA变性为单链。使用Illumina PE300试剂盒进行Illumina MiSeq测序。
序列拼接与注释：通过FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对测序数据进行质量评估，然后用Trimmomatic v0.36软件去除低质量值的测序数据，最后使用SPAdes v3.13.0软件对过滤后的数据进行拼接。用RAST(RapidAnnotation using Subsystem Technology，http：//rast.nmpdr.org)和tRNAscan-SE(http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE)对vB_VhaS-yong 3基因组进行功能注释。
序列比对：用NCBI提供的BLASTP工具，将vB_VhaS-yong 3的Phage tail lengthtape-measure protein的氨基酸序列与genbank中的所有序列比对。
vB_VhaS-yong 3的Phage tail length tape-measure protein序列见序列表SEQID NO.1。BLAST显示，在genbank中与其氨基酸序列同源性最高的为Vibrio phage pVp-1的蛋白，同源性为84.69％(图4)。
实施例4
噬菌体vB_VhaS-yong 3的宿主范围检定
将哈维氏弧菌SZT株、哈维氏弧菌LDF株及待试菌株(详见表1)分别培养至对数期(OD600≈0.6)。将这些对数期菌液与噬菌体vB_VhaS-yong 3悬液分别按按体积100∶1混合作为实验组，对照组用LB海水培养基代替噬菌体，各组均置摇床上培养(29℃，180rpm)。翌日用酶标仪测定各组的OD600。取平行组平均值，计算对照组与实验组平均值的比值。若比值大于1.2认为噬菌体可感染该菌，为阳性结果；反之则认为噬菌体不能感染该菌，为阴性结果；肉眼、显微镜观察感染、裂解情况，确认OD600法判定的结果。结果vB_VhaS-yong3对宿主感染有株特异性，只感染、裂解哈维氏弧菌SZT株(表1)。
表1噬菌体vB_VhaS-yong 3的宿主范围检定结果
“+”代表感染，“-”代表不感染
实施例5
噬菌体vB_VhaS-yong 3在食品中的杀菌作用
取整条新鲜青占鱼，75％酒精浸泡5min，超净台中晾干后，用无菌剪刀、镊子操作：去皮，取脊侧肌肉，切成大小均匀的生鱼片(1.5cm×1.5cm)。在25℃条件下，将1.5cm2的方形生鱼片置于带盖无菌培养皿中，取108cfu/mL的哈维氏SZT菌液均匀滴加在生鱼片的表面，滴加量为20μL/生鱼片。放置10至20min后，再均匀滴加滴度为108pfu/mL噬菌体液，滴加量为20μL/生鱼片。对照组在滴加哈维氏SZT菌液后，不加噬菌体液，而是滴加相同体积的LB海水液体培养基，将培养皿盖好，贴上封口膜防止杂菌污染，放入25℃恒温箱中进行。分别于1h、2h、3h、4h、6h后，取样，每次取2片/组。对每片生鱼片样品做细菌计数：加入1mL的LB海水液体培养基，将样品用无菌研磨棒充分研磨，涡旋震荡，然后用常规的稀释涂布法进行菌落数量检测。
在25℃下，在1小时后，实验组中菌数下降至5.49Log 10cfu/ml，第六个小时后，实验组菌数持续下降至2.17Log 10cfu/ml；同期对照组的菌量分别为为7.12Log 10cfu/ml和5.17Log 10cfu/ml，实验组生鱼片中菌数明显低于同期对照组(图5)，六小时后实验组菌量是对照组的0.1％。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (3)

1.哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 3，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18195。
2.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 3的应用，其特征在于所述烈性噬菌体用于裂解致病性哈维氏弧菌。
3.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 3的应用，其特征在于所述烈性噬菌体用于制备生物制剂，这些生物制剂可用于病害防控和食品包括水产品、生产环境或生产器具的消毒。
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应用噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的可行性研究;陈月忠;黄万红;;集美大学学报(自然科学版)(第04期);全文 *

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