CN108118033A - 一株裂解性沙门氏菌噬菌体及其分离方法 - Google Patents

一株裂解性沙门氏菌噬菌体及其分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株裂解性沙门氏菌噬菌体及其分离方法，所述噬菌体的形态为蝌蚪状，头部为二十面体的立体对称，有可伸缩的尾部；并对该噬菌体进行了生物学特性研究，由本发明分离得到的噬菌体，经增殖后，噬菌体原液效价高，在本发明中噬菌体的效价≥109pfu/mL，并发现在不同的感染复数条件下均具有一定的活性，噬菌体在30‑60℃效价基本不变；通过对本发明分离得到的噬菌体的生物学特性研究，为下一步研发新的抑菌药物提供理论指导意义。

Description

一株裂解性沙门氏菌噬菌体及其分离方法
技术领域
本发明属于微生物领域，特别是涉及一株裂解性沙门氏菌噬菌体及其分离方法。
背景技术
沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性菌，具有2500多个血清型，我国已有292个血清型的报道。沙门氏菌感染动物后临床上常表现为败血症、胃肠炎及其它组织局部炎症。鸡源沙门氏菌可引起鸡白痢、鸡伤寒和禽副伤寒，具有垂直传播和水平传播的特点，是严重危害家禽业的重要致病菌，而且地域、时间和环境等因素不同，不同地区或同一地区不同时间致病性沙门氏菌的流行优势菌株有所不同[3]。目前，为了降低鸡源沙门氏菌病发病率，促进鸡的生长发育，提高产蛋率，养殖场常用抗微生物药物作为促生长剂、预防剂和临床药。由于药物作用压力和耐药基因的传递，导致沙门氏菌产生耐药性和多重耐药性，耐药范围逐渐扩大，耐药程度逐渐增加。
噬菌体作为一种可以杀死细菌的病毒，在发现初期就被应用于临床感染的治疗，但随着抗生素的发现和普及，噬菌体治疗被逐渐忽视。但是随着细菌耐药性问题的日益严重，人们已经面临无药可用的危险处境。因此，噬菌体治疗的临床应用前景在近年来又受到了重视。越来越多的研究已经开始探索噬菌体治疗的效果。但是，要将噬菌体治疗最终用于临床，噬菌体-宿主的相互作用机制必须先期的深入研究，才能为今后的临床研究打下坚实的基础并为设计出更好的噬菌体治疗策略提供理论指导。为此，本发明是从禽粪便中分离纯化出一株裂解性沙门氏菌噬菌体，并测定其生物学特性，为以后研发新的抑菌药物提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一株裂解性沙门氏菌噬菌体及其分离方法，并测定了该噬菌体的生物学特性，为研发新的抑菌药物提供理论指导意义。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一株裂解性沙门氏菌噬菌体，通过电镜观察，所述噬菌体的形态为蝌蚪状，头部为二十面体的立体对称，有可伸缩的尾部。
上述一株裂解性沙门氏菌噬菌体的分离方法，步骤如下：
（1）宿主菌的准备：在无菌的条件下，用接种针在病死禽的内脏器官取样，在SS琼脂培养基上划线，筛选出透明中心有黑点或无黑点的菌落，然后将分离出的菌落纯化和鉴定；
（2）噬菌体的分离：先将禽粪便于无菌的生理盐水中浸泡过夜，然后离心取上清过0.22nm的无菌滤膜，取1mL上清液和0.2mL菌悬液加入5mL LB肉汤中，在37℃的条件下，200r/min震荡过夜培养。将过夜培养后的悬液离心后取0.1mL上清液和0.2mL宿主菌混合后，于37℃的条件下，静置10min，然后加入40℃的LB营养琼脂中混匀后立即导入已凝固的LB培养琼脂平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后37℃倒置培养4-6 h，观察有无噬菌斑；
（3）噬菌体的纯化：待噬菌斑长出后，选取直径较大，透明度较高的噬菌斑。用镊子扣取噬菌斑放于1mL生理盐水中，于37℃的条件下，浸泡30min，然后于12000r/mim下离心5min，再按照步骤（2）所述方法铺双平板，培养后挑取单噬菌斑，反复纯化三次，直到噬菌斑大小一致。
还包括制备噬菌体增殖液，对噬菌体进行效价测定；用电子显微镜观察噬菌体形态；测定噬菌体的最佳感染复数；测定噬菌体的一步生长曲线；测定所述噬菌体的理化特性，所述理化特性包括酸碱耐受性和热稳定性。
优选地，所述噬菌体增殖液的制备方法是：从噬菌斑大小基本一致的双平板上，扣取单个噬菌斑于1mL生理盐水中，于37℃下浸泡30min，离心后取0.2mL上清液和0.1mL宿主加入5mL LB肉汤中，在37℃的条件下，200r/min振荡培养，将混合液摇清，然后再离心取上清液，即是噬菌体增殖液。
优选地，所述噬菌体效价的测定方法为：将增殖后的噬菌体原液用无菌生理盐水做10倍比稀释，取10-5、10-6、10-7铺双平板，于37℃的条件下倒置培养4-6h，待噬菌斑长出后计数。
优选地，噬菌体的电镜观察实验具体为：取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2%的磷钨酸（PTA）于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。
优选地，最佳感染复数的测定实验具体为：取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照感染复数分别为0.01、0.1、1、10、100加入噬菌体，在37℃的条件下，200r/min振荡培养6h，取离心后的上清夜铺双平板测滴度，得出最佳感染复数。
优选地，一步生长曲线的测定实验具体为：取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌和噬菌体，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次；再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时，每隔10min取样计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。
优选地，酸碱耐受性实验具体为：用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再将配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×1010pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板，37℃倒置培养4-6h后计数。
优选地，热稳定性实验具体为：将噬菌体原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板计数。
本发明的有益效果体现在：
与现有技术相比，本发明具有以下有优点：
（1）由本发明分离得到的噬菌体，经增殖后，噬菌体原液效价高，在本发明中噬菌体的效价≥109pfu/mL。
（2）在本发明中，分别比较了噬菌体在感染复数为0.01、0.1、1、10、100的条件下对沙门氏菌的抑菌作用，并发现在不同的感染复数条件下均具有一定的活性。
（3）热稳定性好：本发明得到的噬菌体在30-60℃效价基本不变。
（4）通过对本发明分离得到的噬菌体的生物学特性研究，为下一步研发新的抑菌药物提供理论指导意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更加明显：
图1为观察本发明分离得到的噬菌斑的示意图。
图2为本发明噬菌体一步生长曲线实验的示意图。
图3为本发明噬菌体酸碱耐受性实验的示意图。
图4为本发明噬菌体热稳定性实验的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例中，宿主取自病死禽的内脏器官；禽粪便取自山东和河北多个大型养殖场；主要试剂 LB肉汤、营养琼脂、SS琼脂培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
实施例1 裂解性沙门氏菌噬菌体的分离方法，步骤如下：
（1）宿主菌的准备：在无菌的条件下，用接种针在病死禽的内脏器官取样，在SS琼脂培养基上划线，筛选出透明中心有黑点或无黑点的菌落，然后将分离出的菌落纯化和鉴定；
（2）噬菌体的分离：先将禽粪便于无菌的生理盐水中浸泡过夜，然后离心取上清过0.22nm的无菌滤膜，取1mL上清液和0.2mL菌悬液加入5mL LB肉汤中，在37℃的条件下，200r/min震荡过夜培养。将过夜培养后的悬液离心后取0.1mL上清液和0.2mL宿主菌混合后，于37℃的条件下，静置10min，然后加入40℃的LB营养琼脂中混匀后立即导入已凝固的LB培养琼脂平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后37℃倒置培养4-6 h，观察有无噬菌斑；
（3）噬菌体的纯化：待噬菌斑长出后，选取直径较大，透明度较高的噬菌斑。用镊子扣取噬菌斑放于1mL生理盐水中，于37℃的条件下，浸泡30min，然后于12000r/mim下离心5min，再按照步骤（2）所述方法铺双平板，培养后挑取单噬菌斑，反复纯化三次，直到噬菌斑大小一致，得到形态单一、边缘光滑、清晰透明的圆形噬菌斑，直径大小为2-2.5mm（如图1所示）。
噬菌体增殖液的制备方法：从噬菌斑大小基本一致的双平板上，扣取单个噬菌斑于1mL生理盐水中，于37℃下浸泡30min，离心后取0.2mL上清液和0.1mL宿主加入5mL LB肉汤中，在37℃的条件下，200r/min振荡培养，将混合液摇清，然后再离心取上清液，即是噬菌体增殖液。
实施例2 噬菌体效价的测定方法：将增殖后的噬菌体原液用无菌生理盐水做10倍比稀释，取10-5、10-6、10-7铺双平板，于37℃的条件下倒置培养4-6h，待噬菌斑长出后计数。经测定噬菌体的效价≥109pfu/mL。
实施例3 噬菌体的电镜观察实验：具体为：取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2%的磷钨酸（PTA）于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，通过透射电镜观察，噬菌体的形态为蝌蚪状，头部为二十面体的立体对称，有可伸缩的尾部。
实施例4 最佳感染复数的测定实验：具体为：取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照感染复数分别为0.01、0.1、1、10、100加入噬菌体，在37℃的条件下，200r/min振荡培养6h，取离心后的上清夜铺双平板测滴度，得出最佳感染复数。结果如表1所示。
表1 最佳感染复数试验结果
由表1数据可知，当感染复数为0.01时，子代噬菌体的效价为2.7*1010 pfu/mL，在5个感染复数中产量最高，因此最佳感染复数为0.01。
实施例5 一步生长曲线的测定实验：具体为：取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌和噬菌体，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次；再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时，每隔10min取样计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量；其中平均裂解量 = 暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图2所示，噬菌体的潜伏期约为20min，爆发期约为80min，平均爆发量为100。
实施例6 酸碱耐受性实验具体为：用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再将配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×1010pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板，37℃倒置培养4-6h后计数。结果如图3所示，不同pH下，噬菌体的效价不同。在pH2-13的范围内作用后均有活性，其中在5-8的范围内效价对数值在9以上，在pH为7时作用后效价基本保持原活性，稳定性最好。
实施例7 热稳定性实验：具体为：将噬菌体原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板计数。结果如图4所示，随着温度的变化，噬菌体的效价不同。随着温度的升高，噬菌体的效价慢慢下降，加热时间越长，噬菌体的存活率就越低。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims (10)

1.一株裂解性沙门氏菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体的形态为蝌蚪状，头部为二十面体的立体对称，有可伸缩的尾部。
2.一种如权利要求1所述的噬菌体的分离方法，其特征在于，步骤如下：
（1）宿主菌的准备：在无菌的条件下，用接种针在病死禽的内脏器官取样，在SS琼脂培养基上划线，筛选出透明中心有黑点或无黑点的菌落，然后将分离出的菌落纯化和鉴定；
（2）噬菌体的分离：先将禽粪便于无菌的生理盐水中浸泡过夜，然后离心取上清过0.22nm的无菌滤膜，取1mL上清液和0.2mL菌悬液加入5mL LB肉汤中，在37℃的条件下，200r/min震荡过夜培养，将过夜培养后的悬液离心后取0.1mL上清液和0.2mL宿主菌混合后，于37℃的条件下，静置10min，然后加入40℃的LB营养琼脂中混匀后立即导入已凝固的LB培养琼脂平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后37℃倒置培养4-6 h，观察有无噬菌斑；
（3）噬菌体的纯化：待噬菌斑长出后，选取直径较大，透明度较高的噬菌斑，用镊子扣取噬菌斑放于1mL生理盐水中，于37℃的条件下，浸泡30min，然后于12000r/mim下离心5min，再按照步骤（2）所述方法铺双平板，培养后挑取单噬菌斑，反复纯化三次，直到噬菌斑大小一致。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，还包括制备噬菌体增殖液，对噬菌体进行效价测定；用电子显微镜观察噬菌体形态；测定噬菌体的最佳感染复数；测定噬菌体的一步生长曲线；测定所述噬菌体的理化特性，所述理化特性包括酸碱耐受性和热稳定性。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述噬菌体增殖液的制备方法是：从噬菌斑大小基本一致的双平板上，扣取单个噬菌斑于1mL生理盐水中，于37℃下浸泡30min，离心后取0.2mL上清液和0.1mL宿主加入5mL LB肉汤中，在37℃的条件下，200r/min振荡培养，将混合液摇清，然后再离心取上清液，即是噬菌体增殖液。
5.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述噬菌体效价的测定方法为：将增殖后的噬菌体原液用无菌生理盐水做10倍比稀释，取10-5、10-6、10-7铺双平板，于37℃的条件下倒置培养4-6h，待噬菌斑长出后计数。
6.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，噬菌体的电镜观察实验具体为：取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2%的磷钨酸（PTA）于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。
7.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，最佳感染复数的测定实验具体为：取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照感染复数分别为0.01、0.1、1、10、100加入噬菌体，在37℃的条件下，200r/min振荡培养6h，取离心后的上清夜铺双平板测滴度，得出最佳感染复数。
8.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，一步生长曲线的测定实验具体为：取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌和噬菌体，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次；再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时，每隔10min取样计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。
9.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，酸碱耐受性实验具体为：用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再将配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×1010pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板，37℃倒置培养4-6h后计数。
10.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，热稳定性实验具体为：将噬菌体原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板计数。
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