CN108085423A - 一种利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法及试剂盒 - Google Patents

一种利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法及试剂盒，属于嗜水气单胞菌菌种鉴定技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；2)将嗜水气单胞菌噬菌体滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系在28～35℃下静置培养8～16h，如果有噬菌斑出现，则待检菌种为嗜水气单胞菌。本发明所述的方法能够快速准确的鉴定嗜水气单胞菌，具有效率高，成本低廉，省事省力的特点，准确率达到100％，适于大量嗜水气单胞菌的初步筛选和鉴定。

Description

一种利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法 及试剂盒
技术领域
本发明属于嗜水气单胞菌种鉴定技术领域，具体涉及一种用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法及试剂盒。
背景技术
嗜水气单胞菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。目前，在生产中发现由嗜水气单胞菌感染的暴发性出血病较多，因嗜水气单胞菌的自清型很多，况且感染的对象不同，所以症状也各异。如白鲢暴发性出血病、甲鱼败血病、黄鳝出血病、鳗鲡红鳍病等。该菌为条件致病菌，当环境骤变，水质恶化时，常会与其它菌(如温和产气单胞菌、弧菌等)混合感染使病情加重。由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛，多为恶性传染病，死亡率很高。因此，对嗜水气单胞菌的提前检测是防止养殖水产患病有效手段。
目前，对嗜水气单胞菌的鉴定主要依赖于菌落特征、菌体形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析方法对菌株进行鉴定。但是由于菌株在不同生长环境下进行生长，菌体形态及产生的菌落会有不同程度的差异，同时采用分子鉴定方法往往不能准确确定待检测的菌株的分类地位，因此，现有技术中往往将形态特征，生理生化特征与分子鉴定方法结合在一起对菌株进行鉴定。因此，目前对嗜水气单胞菌的鉴定方法较为复杂，并且依赖微生物形态学专家的长期工作经验才能得到正确结论，由此可见，该鉴定方法不利于快速检测，进而限制其广泛应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法及试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)将浓度为107～109CFU/mL待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；
2)将嗜水气单胞菌噬菌体液滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；所述嗜水气单胞菌噬菌体液中嗜水气单胞菌噬菌体的效价为108～1010PFU/mL；
3)将步骤2)中获得的鉴定体系置于28～35℃，静置培养8～16h，观察鉴定体系如果有噬菌斑出现，待检菌种鉴定为嗜水气单胞菌。
优选的，所述步骤1)中嗜水气单胞菌噬菌体液中包括15～30种嗜水气单胞菌噬菌体。
优选的，所述步骤1)待检菌种的涂布体积为100～200μl。
优选的，所述步骤2)中嗜水气单胞菌噬菌体液滴加体积为20～50μl。
优选的，所述嗜水气单胞菌噬菌体的获取方法包括以下步骤：1)将分离到的嗜水气单胞菌噬菌体与宿主菌嗜水气单胞菌混合培养获得培养液；2)将培养液固液分离，收集液相组分为嗜水气单胞菌噬菌体。
优选的，所述固液分离的方法为离心。
优选的，所述离心的转速为6000～12000rpm，所述离心的时间为5～20min。
优选的，所述离心的温度为2～10℃。
本发明还提供了一种快速鉴定嗜水气单胞菌的试剂盒，包括嗜水气单胞菌噬菌体液。
优选的，所述试剂盒还包括LB琼脂平板。
本发明的有益效果
本发明所述的嗜水气单胞菌的鉴定方法，利用噬菌体对宿主菌的特异性侵染和裂解原理，使用嗜水气单胞菌噬菌体来鉴定嗜水气单胞菌，成本低，省时省力，所需时间仅为8～16h，并且能够快速准确的鉴定嗜水气单胞菌，尤其适于大量嗜水气单胞菌的初步筛选。
附图说明
图1为实施例6中嗜水气单胞菌鉴定体系噬菌斑的照片。
具体实施方式
本发明提供了一种用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)将浓度为107～109CFU/mL待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；
2)将嗜水气单胞菌噬菌体液滴加至待检平板上，获得鉴定体系；所述嗜水气单胞菌噬菌体液中嗜水气单胞菌噬菌体的效价为108～1010PFU/mL；
3)将步骤2)中获得的鉴定体系置于28～35℃，静置培养8～16h，观察鉴定体系如果有噬菌斑出现，待检菌种鉴定为嗜水气单胞菌。
在本发明中，将浓度为107～109CFU/mL待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板。本发明对所述待检菌种的来源没有限定，在本发明具体实施过程中，所述待检菌种可从环境样品中分离，例如水样或者动物组织等。所述待检菌种优选的为分离纯化后的纯菌。所述待检菌种在鉴定前优选的进行培养，将得到的培养液用于鉴定；所述待检菌的培养时间优选为8～12h；所述培养的方法和条件采用本领域常规的菌种筛选过程中的培养方法和条件即可。
在本发明中，所述待检菌种的浓度优选为108CFU/mL。在本发明中，所述涂布优选在无菌环境中进行，具体的可在无菌操作台中进行。在本发明中，所述待检菌种的涂布体积为100～200μl，优选为120～180μl，更优选为150μl。所述待检菌涂布于LB琼脂平板后，静置15～20min，所述静置的时间优选为16～18min。本发明在所述静置后获得待检平板。
本发明在获得待检平板后，将嗜水气单胞菌噬菌体液滴加至待检平板上，获得鉴定体系。在本发明中，所述的嗜水气单胞菌噬菌体液的效价为108～1010PFU/mL，更优选为109PFU/mL；所述嗜水气单胞菌噬菌体液的体积优选为20～50μl，更优选为30～40μl。在本发明中，所述嗜水气单胞菌噬菌体液优选包括10种以上嗜水气单胞菌噬菌体，更优选包括15～25种。所述嗜水气单胞菌噬菌体优选分离自南美白对虾养殖池。
在本发明中，所述嗜水气单胞菌噬菌体液的获取方法包括以下步骤：A)将嗜水气单胞菌噬菌体与宿主菌嗜水气单胞菌混合培养获得培养液；B)将培养液固液分离，收集液相组分为嗜水气单胞菌噬菌体液。
在本发明中，所述宿主菌嗜水气单胞菌可以是市售的菌种也可以是自制分离纯化的菌种；具体的在本发明实施过程中所述宿主菌嗜水气单胞菌来源于南美白对虾的病虾肠道。本发明在嗜水气单胞菌噬菌体与宿主菌嗜水气单胞菌混合培养前优选对宿主菌嗜水气单胞菌进行培养。在本发明中所述宿主菌嗜水气单胞菌的培养为固体单菌落接种或者液体接种培养。当所述宿主菌嗜水气单胞菌为固体单菌落接种时，优选在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，培养温度优选的为28～35℃，更优选的为30～33℃；所述培养转速优选的为50～200rpm，更优选的为100～180rpm；培养时间14～18h。当所述宿主菌为液体接种培养时，优选的在无菌条件下将低温贮藏的液体菌液接种于液体培养基中进行培养；所述液体菌液的接种量优选的为10～20％(体积)，更优选的为12～18％；所述液体菌液的密度优选为106～108CFU/mL，更优选为107CFU/mL；所述培养时间优选为10～16h，更优选为12～14h；所述液体接种培养时的培养温度、转速与固体单菌落接种培养时一致，在此不再赘述。本发明对所述液体培养的培养基没有特殊限定，采用本领域常规的嗜水气单胞菌培养基即可。
本发明对所述嗜水气单胞菌噬菌体与宿主菌嗜水气单胞菌混合培养的培养条件没有特殊限定，采用本领域常规的嗜水气单胞菌的培养条件即可，具体实施过程中采用上述宿主菌嗜水气单胞菌的培养条件即可。
在本发明中，所述固液分离的方法优选的为离心；所述离心的转速优选为1000～8000rpm，更优选为3000～6000rpm；所述离心的时间优选为5～20min，更优选为10～15min；所述离心的温度优选为2～10℃，更优选为4～6℃。
本发明在获得鉴定体系后，将获得的鉴定体系置于28～35℃，静置培养8～16h，观察鉴定体系，如果有噬菌斑出现，待检菌种鉴定为嗜水气单胞菌。在本发明中，所述鉴定体系静置培养温度优选为30～33℃；所述静置培养的时间优选为10～14h，更优选为12h。本发明在静置培养结束后，观察鉴定体系，如果鉴定体系中有噬菌斑出现，则待检菌种鉴定为嗜水气单胞菌。
本发明还提供了一种快速鉴定嗜水气单胞菌的试剂盒，包括嗜水气单胞菌噬菌体液。所述嗜水气单胞菌噬菌体液优选包括10种以上嗜水气单胞菌噬菌体。所述嗜水气单胞菌噬菌体液优选包括15～20种；所述的嗜水气单胞菌噬菌体液的效价优选为108～1010PFU/mL，更优选为109PFU/mL。所述试剂盒还优选包括LB琼脂平板。本发明对所述LB琼脂平板的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的制备方案即可。
本发明中所述试剂盒的使用方法参照上述用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法包括如下步骤：步骤A：宿主菌的分离纯化，本发明从大量南美白对虾的病虾肠道中分离获得宿主菌。步骤B：宿主菌的扩大培养，在LB液体培养基中加入5％的NaCl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，培养温度为30℃，转速为180rpm，培养时间14h；步骤C：嗜水气单胞菌噬菌体分离，从南美白对虾养殖池中分离获得，烈性噬菌体种类为1种。步骤D：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培；步骤E：将噬菌体扩培所得的培养液，在4℃下8000rpm离心5min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，其效价为108PFU/mL。
采用点滴法，将42株过夜培养的浓度为107CFU/mL的各种嗜水气单胞菌类似菌，用移液枪吸取100μl滴在平板中央，再用涂布棒均匀涂布于LB琼脂平板，静置20分钟，滴加20μl的嗜水气单胞菌噬菌体混合液，保持环境温度30℃并静置培养12h，观察有无噬菌斑出现；如果有，即证明是嗜水气单胞菌。
结果发现：42株嗜水气单胞菌类似菌中，32株出现噬菌斑，鉴定为嗜水气单胞菌，准确率达到100％。
实施例2
本实施例利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法包括如下步骤：步骤A：宿主菌的分离纯化，本发明从大量南美白对虾的病虾肠道中分离获得宿主菌。步骤B：宿主菌的扩大培养，在LB液体培养基中加入5％的NaCl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，培养温度为30℃，转速为150rpm，培养时间16h；步骤C：烈性噬菌体分离，从不同南美白对虾养殖池水体的中获得，烈性噬菌体种类为1种。步骤D：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培；步骤E：将所得的培养液，在4℃下8000rpm离心5min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，其效价为108PFU/mL。采用点滴法，将50株过夜培养的浓度为107CFU/mL的各种嗜水气单胞菌类似菌，用移液枪吸取100μl滴在平板中央，再用涂布棒均匀涂布于LB琼脂平板，静置20分钟，滴加20μl的嗜水气单胞菌噬菌体混合液，保持环境温度30℃并静置培养12h，观察有无噬菌斑出现；如果有，即证明是嗜水气单胞菌。
结果发现：50株嗜水气单胞菌类似菌中，38株出现噬菌斑，鉴定为嗜水气单胞菌，采用16S rDNA对鉴定出的嗜水气单胞菌进行分子鉴定，结果表明采用噬菌斑鉴定的准确率达到100％。
实施例3
本实施例利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法包括如下步骤：步骤A：宿主菌的分离纯化，本发明的嗜水气单胞菌从大量南美白对虾的病虾肠道中分离获得宿主菌。步骤B：宿主菌的扩大培养，在LB液体培养基中加入5％的NaCl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，培养温度为30℃，转速为150rpm，培养时间16h；步骤C：烈性噬菌体分离，从不同南美白对虾养殖池的水体中获得，烈性噬菌体种类为18种。步骤D：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培；步骤E：将所得的培养液，在4℃下8000rpm离心5min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，其效价为108PFU/mL。采用点滴法，将50株过夜培养的浓度为107CFU/mL的各种嗜水气单胞菌类似菌，用移液枪吸取100μl滴在平板中央，再用涂布棒均匀涂布于LB琼脂平板，静置20分钟，滴加20μl的嗜水气单胞菌噬菌体混合液，保持环境温度30℃并静置培养12h，观察有无噬菌斑出现；如果有，即证明是嗜水气单胞菌。
结果发现：50株嗜水气单胞菌类似菌中，37株出现噬菌斑，鉴定为嗜水气单胞菌，采用16S rDNA对鉴定出的嗜水气单胞菌进行分子鉴定，结果表明采用噬菌斑鉴定的准确率达到100％。
实施例4
本实施例利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法包括如下步骤：步骤A：宿主菌的分离纯化，本发明的嗜水气单胞菌从不同养植区的南美白对虾肠道中分离获得。步骤B：宿主菌的扩大培养，在LB液体培养基中加入2％的NaCl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。液体菌液接种，在无菌条件，加入培养基体积15％的为106CFU/mL的嗜水气单胞菌液至LB液体培养基中进行培养培养温度为32℃，转速为200rpm，培养时间10h；步骤C：烈性噬菌体分离，从不同南美白对虾养殖池的水体中分离获得，烈性噬菌体种类为21种。步骤D：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培；步骤E：将所得的培养液，在6℃下6000rpm离心10min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，其效价为109PFU/mL。采用点滴法，将40株过夜培养的浓度为108CFU/mL的各种嗜水气单胞菌类似菌，用移液枪吸取150μl滴在平板中央，再用涂布棒均匀涂布于LB琼脂平板，静置15min，滴加20μl的嗜水气单胞菌噬菌体混合液，保持环境温度32℃并静置培养14h，观察有无噬菌斑出现；如果有，即证明是嗜水气单胞菌。
结果发现，40株嗜水气单胞菌类似菌中，32株出现噬菌斑，鉴定为嗜水气单胞菌，采用16S rDNA对鉴定出的嗜水气单胞菌进行分子鉴定，结果表明采用噬菌斑鉴定的准确率达到100％。
实施例5
本实施例利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法包括如下步骤：步骤A：宿主菌的分离纯化，本发明的嗜水气单胞菌从大量南美白对虾的病虾肠道中分离获得宿主菌。步骤B：宿主菌的扩大培养，在LB液体培养基中加入5％的NaCl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，培养温度为28℃，转速为120rpm，培养时间18h；步骤C：烈性噬菌体分离，从南美白对虾养殖池的水体中分离获得，烈性噬菌体种类为15种。步骤D：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培；步骤E：将所得的培养液，在5℃下1000rpm离心20min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，其效价为1010PFU/mL。采用点滴法，将22株过夜培养的浓度为107CFU/mL的各种嗜水气单胞菌类似菌，用移液枪吸取200μl滴在平板中央，再用涂布棒均匀涂布于LB琼脂平板，静置20min，滴加20μl的嗜水气单胞菌噬菌体混合液，保持环境温度28℃并静置培养12h，观察有无噬菌斑出现；如果有，即证明是嗜水气单胞菌。
结果发现，22株嗜水气单胞菌类似菌中，17种出现噬菌斑，鉴定为嗜水气单胞菌，采用16S rDNA对鉴定出的嗜水气单胞菌进行分子鉴定，结果表明采用噬菌斑鉴定的准确率达到100％。
实施例6
一种快速鉴定嗜水气单胞菌的试剂盒，包括20种嗜水气单胞菌噬菌体混合液和LB琼脂平板。所述嗜水气单胞菌噬菌体混合液的效价为109PFU/mL。
所述试剂盒的使用方法：
采用点滴法，将10株过夜培养的浓度为107CFU/mL的各种嗜水气单胞菌类似菌，用移液枪吸取200μl滴在试剂盒中的LB琼脂平板中央，再用涂布棒均匀涂布于LB琼脂平板，静置20min，滴加20μl试剂盒中的嗜水气单胞菌噬菌体混合液，保持环境温度28℃并静置培养12h，观察有无噬菌斑出现；如果有，即证明是嗜水气单胞菌。
结果发现，鉴定10株嗜水气单胞菌类似菌中，6种出现噬菌斑，鉴定为嗜水气单胞菌，采用16S rDNA对鉴定出的嗜水气单胞菌进行分子鉴定，结果表明采用噬菌斑鉴定的准确率达到100％(图1)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用嗜水气单胞菌噬菌体快速鉴定嗜水气单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)将浓度为107～109CFU/mL待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；
2)将嗜水气单胞菌噬菌体液滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；所述嗜水气单胞菌噬菌体液中嗜水气单胞菌噬菌体的效价为108～1014PFU/mL；
3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系置于28～35℃，静置培养8～16h，观察鉴定体系，如果有噬菌斑出现，则待检菌种鉴定为嗜水气单胞菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中嗜水气单胞菌噬菌体液中包括15～30种嗜水气单胞菌噬菌体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)待检菌种的涂布体积为100～200μl。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中嗜水气单胞菌噬菌体液的滴加体积为20～50μl。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述嗜水气单胞菌噬菌体液的获取方法包括以下步骤：
A)将嗜水气单胞菌噬菌体与宿主菌嗜水气单胞菌混合培养，获得培养液；
B)将所述培养液固液分离，收集液相组分为嗜水气单胞菌噬菌体液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固液分离的方法为离心。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为6000～12000rpm，所述离心的时间为5～20min。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述离心的温度为2～10℃。
9.一种快速鉴定嗜水气单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括嗜水气单胞菌噬菌体液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LB琼脂平板。
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