CN108103029A - 一株可裂解牛源无乳链球菌的噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可裂解牛源无乳链球菌的链球菌噬菌体，申请人将该噬菌体自命名为vB_SagS_FSN1，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017670。该链球菌噬菌体属于长尾噬菌体科，在40‑60℃和pH为5‑10的条件下都能够稳定存活，亲水性好，在体内外对无乳链球菌尤其是牛源无乳链球菌流行株都具有很强的裂解能力，从而验证了该噬菌体在防治无乳链球菌引起的奶牛乳房炎中的可行性,为牛源无乳链球菌感染的治疗提供了新途径。

Description

一株可裂解牛源无乳链球菌的噬菌体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株链球菌噬菌体菌株及其应用，特别是一株可裂解中国奶牛场中无乳链球菌流行株的链球菌噬菌体及其在防治奶牛乳房炎中的应用。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最严重、最复杂的疾病之一，不仅严重威胁奶牛健康，而且影响牛奶产量及品质，给奶牛产业的健康发展造成严重威胁。目前全世界约有2.2亿头奶牛，每年因奶牛乳房炎造成的损失高达350亿美元，我国每年因奶牛乳房炎造成的损失亦有135亿人民币之巨。无乳链球菌是导致奶牛乳房炎发生的主要病原之一，被认为是一种接触传染性病原菌，在饲养管理不当、卫生条件差等条件下，常常会造成该菌的快速传播和流行。在我国，无乳链球菌引起的奶牛乳房炎发病率占总发病率的20-40％。目前，通过多位点序列分型技术已经明确我国奶牛场中无乳链球菌的主要流行株的序列型为ST(sequencetype)67、ST103及ST568型(Yongchun Yang,Yinglong Liu,Yunlei Ding,Li Yi,Zhe Ma,Hongjie Fan,Chengping Lu.Molecular characterization of Streptococcusagalactiae isolated from bovine mastitis in Eastern China[J].PLoS One,2013,8:e67755；Maoda Pang,Lichang Sun,Tao He,,Hongdu Bao,Lili Zhang,Yan Zhou,HuiZhang,Ruicheng Wei,Yongjie Liu and Ran Wang,Molecular and virulencecharacterization of highly prevalent Streptococcus agalactiae circulated inbovine dairy herds[J].Veterinary Research,2017,48:65)，杨永春等的流行病学研究表明这三种序列型的菌株在其所分离到的牛源无乳链球菌中所占比例达93％。很多奶牛场中乳房炎往往由其中一种或两种流行株引起，其引起的乳房炎一般为隐性乳房炎，往往因为患牛不表现临床症状而不能被及时发现以隔离和治疗，进而导致其他健康奶牛也被感染，一般降低产奶量10-15％，给每头奶牛造成的损失约1200-1800元，其对牛群的危害已超过临床型乳房炎。因此，如何防治这些流行株在奶牛场中的感染是解决乳房炎频发的关键所在。
目前，针对无乳链球菌感染所采取的治疗方式主要是抗生素治疗，这不仅导致了耐药菌的出现，还容易导致治疗的失败以及奶牛乳房炎的反复发作。随着国家对兽用抗生素的限制使用，一些中草药复方制剂也被用来治疗奶牛乳房炎，但是由于中草药成分复杂、作用机理不明且疗效不确切，所以在实际使用中效果并不理想。另外，市场上也未有针对牛源无乳链球菌的有效疫苗。所以，寻找针对牛源无乳链球菌的新型杀菌剂已成为兽医界的重要课题。
噬菌体是一类依赖细菌生长的病毒，具有天然的杀菌特性。如果将抗感染的广谱抗生素治疗看成是"密集轰炸"，噬菌体抗感染疗法则可以被视为"精准制导"。噬菌体的宿主特异性强，只裂解相应的宿主菌，不会破坏正常菌群，另外噬菌体的增值速度快、治疗效率高，并且不会产生药物残留。在细菌对抗生素耐药越来越严重的情况下，噬菌体抗感染治疗的研究和应用显得尤为迫切，具有极大的医疗和商业前景。2011年，美国FDA批准了第1种由噬菌体构成的人类食品添加剂，将该添加剂喷洒于猪肉表面可预防O157：H7大肠杆菌感染。截至目前，美国FDA已经批准了3种由噬菌体组成的人类食品添加剂。2014年，美国过敏与传染病研究所将噬菌体疗法确定为治疗耐药菌的措施之一。针对无乳链球菌噬菌体的研究也已取得一定进展，柏琴琴等分离并鉴定出4株牛源无乳链球菌的噬菌体(柏琴琴,杨永春,陆承平.牛源无乳链球菌长尾噬菌体的特性[J].微生物学报,2016,56(2):317-326)，并对其中1株噬菌体的基因组特征进行了分析(Qinqin Bai，Wei Zhang，Yongchun Yang，FangTang，Xuanhoa Nguyen，Guangjin Liu，Chengping Lu.Characterization and genomesequencing of a novel bacteriophage infecting Streptococcus agalactiae withhigh similarity to a phage from Streptococcus pyogenes[J].Archives ofVirology,2013,158:1733-1741)，但是其所分离的噬菌体对无乳链球菌的裂解谱过窄，对ST67型菌株不起裂解作用，仅对部分ST568和ST103型菌株起裂解作用，且其最高裂解率仅为54.8％(23/42)。包红朵等也曾经分离出一株链球菌噬菌体(包红朵,王冉,周艳,张辉,张莉莉.一种链球菌噬菌体及其应用[P].中国专利:CN104845943A,2015-08-19)，该噬菌体的特点是具有较广的裂解谱，针对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和草绿色链球菌等均具有裂解作用，但是该噬菌体对无乳链球菌的裂解谱也较窄，裂解率为52.4％(11/21)，且其所使用的无乳链球菌菌株的序列型并不清楚。
目前，尚未有针对ST67、ST103及ST568等牛源无乳链球菌流行株均起裂解作用的噬菌体被报道，
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种针对奶牛场中无乳链球菌流行株的宽裂解谱、强裂解性的链球菌噬菌体，该噬菌体可以单独或与其他物质复配使用，既可以作为乳房灌注剂、乳头药浴液直接防治奶牛乳房炎的感染，也可以作为环境消毒剂清除奶牛养殖环境中的无乳链球菌。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株链球菌噬菌体vB_SagS_FSN1，该噬菌体属于长尾噬菌体科，具有正多面体的头部以及无伸缩性的尾部；申请人将该噬菌体命名为vB_SagS_FSN1，并于2017年11月10日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏号为CCTCC NO：M 2017670，其分类学名称为链球菌噬菌体vB_SagS_FSN1(Streptococcusphage vB_SagS_FSN1)；该噬菌体对无乳链球菌流行株的裂解率能够达到87.5％，裂解效果好，可形成圆形、透明、边缘整齐的噬菌斑；该噬菌体在30-60℃环境中放置60min，活性稳定，处于pH 5.0-9.0时，其效价与初始效价无显著性差异；且该噬菌体不携带耐药基因和毒力基因。
本申请中所述”无乳链球菌流行株”包括牛源无乳链球菌ST67、ST103及ST568型中的至少一种。
该噬菌体是2016年5月从扬州市实验农牧场的乳房炎奶样中分离得到的，分离者为庞茂达，分离者的联系电话是025-84391627。
上述的链球菌噬菌体在制备防治奶牛乳房炎试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种药物组合物，该药物组合物包含上述链球菌噬菌体。
其中，利用所述的药物组合物对感染无乳链球菌的奶牛进行乳房灌注，治疗奶牛乳房炎。
其中，利用所述的药物组合物对感染无乳链球菌的奶牛进行乳头药浴，预防奶牛乳房炎的发生。
其中，将所述的药物组合物制成环境消毒剂喷洒在牛舍中，控制无乳链球菌的污染，包括将所述的药物组合物喷施在奶牛的体表、奶牛养殖器具、奶牛的养殖环境。
本发明所提供的链球菌噬菌体，对以上牛源无乳链球菌流行株均能够起到裂解作用，裂解率达到87.5％，该噬菌体的发现将为牛源无乳链球菌感染的防治提供一条新的途径，既可以作为乳房灌注剂、乳头药浴液直接防治奶牛乳房炎的感染，也可以作为环境消毒剂清除奶牛养殖环境中的无乳链球菌，具有较高的应用价值和商业价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的链球菌噬菌体能够特异性杀灭牛源无乳链球菌，尤其是对牛源无乳链球菌流行株均具有良好的杀灭效果。
(2)本发明提供的链球菌噬菌体是一种防治无乳链球菌引起的奶牛乳房炎的新型组分；
(3)本发明提供的链球菌噬菌体不携带耐药基因和毒力基因，在基因水平上保证了噬菌体的安全性；
(4)经过细胞毒性试验和小鼠攻毒试验验证，本发明提供的链球菌噬菌体无毒副作用，安全性高；
(5)本发明提供的链球菌噬菌体，增殖速度快、效价高且能够以不具有致病力的无乳链球菌为宿主，便于发酵和规模化生产；
(6)本发明提供的链球菌噬菌体具有较好的亲水性，容易配制成乳房灌注剂、药浴液或环境消毒剂，便于该噬菌体的应用，且应用效果良好。
附图说明
图1噬菌体的噬菌斑形态照片。
图2噬菌体的透射电镜照片。
图3温度对噬菌体活性的影响示意图。
图4pH值对噬菌体活性的影响示意图。
图5噬菌体的全基因组图谱。
图6噬菌体在培养基中的杀菌效果示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中涉及的菌株及培养基:
ST67、ST103及ST568这三种序列型的牛源无乳链球菌流行株参见文献MaodaPang,Lichang Sun,Tao He,,Hongdu Bao,Lili Zhang,Yan Zhou,Hui Zhang,RuichengWei,Yongjie Liu and Ran Wang,Molecular and virulence characterization ofhighly prevalent Streptococcus agalactiae circulated in bovine dairy herds[J].Veterinary Research,2017,48:65。
无乳链球菌临床分离株HZJG1201为申请人实验室分离并保存，其GenBank登录号为MF037749，该菌株已经由文献：“Molecular and virulence characterization ofhighly prevalent Streptococcus agalactiae circulated in bovine dairy herds”，Maoda Pang et.veterinary reserch)公开。
THB培养基购自美国BD公司。
MEM培养基购自Gibco公司。
实施例1噬菌体的分离及制备
本发明试验用噬菌体的宿主菌为无乳链球菌临床分离株HZJG1201。
本发明样品采自江苏省扬州市实验农牧场的乳房炎奶样，将奶样12000rpm离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取10mL过滤上清，加入0.5mL宿主菌过夜培养物，再加入无菌CaCl2母液至终浓度为1.25mM后混匀，加入20mL THB培养基，放置于37℃培养箱中培养6-8h后，取上述培养物以12000rpm，离心30min，取上清；再取此上清10mL，加入0.5mL宿主菌过夜培养物，加入无菌CaCl2母液至终浓度为1.25mM后混匀，加入20mL THB培养基，按上述培养方法培养离心，获得富集的上清；按照以上的试验方法再富集一次，将富集三次的上清用0.22μm滤膜过滤，形成噬菌体原液。
将THB培养基平板(THB培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂)分为9个区域：吸取宿主菌液200μl滴于平板正中央，用涂棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取每种噬菌体原液10μl滴于其中3个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱中培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。
取噬菌体原液100μL，进行一系列的10倍比稀释，取10-2、10-4和10-6稀释液各100μL与过夜培养的宿主菌液100μl混匀，室温作用15min后，加入约4mL 0.6％THB培养基，混匀后迅速倾倒入THB培养基平板(琼脂浓度为1.5％)上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
实施例2噬菌体的扩增和纯化
在实施例1形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种于3-5mL THB培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，37℃培养10-14h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，加入0.3％氯仿。如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，直至将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.3mL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mL THB液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度为1.25mM，37℃摇振培养12-16h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，得到大量噬菌体。随后进行以下操作：
CsCl等密度梯度离心纯化:离心管底部先缓慢加入1.6gm/cc CsCl 10mL，再依次加入1.4gm/cc CsCl 10mL，25％蔗糖5mL，噬菌体裂解液10mL，平衡；加入离心管套中，缓慢悬挂于转子中；打开超速离心机(Optima L-80XP Ultracentrifuge,Beckman)开关，设置转速30000rpm，时间120min，温度18℃；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层白色带，即1.4gm/cc与1.6gm/cc间，用细针头从带侧面插入，小心吸取，20mL样品最终获得约5-8mL；将样品置于透析袋中，用10mM Tris-HCl，PH为7.4，100mMMgCl2缓冲液进行透析；最终将样品吸出，体积约为10mL，测定噬菌体效价。
采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍比梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1mL与宿主菌液0.1mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在1.2％的THB固体培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-1mm。
申请人将纯化的噬菌体自命名为vB_SagS_FSN1，并保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017670，分类命名：链球菌噬菌体vB_SagS_FSN1(Streptococcusphage vB_SagS_FSN1)，保藏日期为2017年11月10日。保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072。
实施例3噬菌体的透射电镜检测
取纯化的噬菌体颗粒(实施例2提供)做电镜观察，加10μL样本滴在铜网上，待其沉淀15min,用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸(PTA)染色1-2min，干燥后进行透射电镜(日立H-7650)观察。
观察如图2所示，该噬菌体头部呈正多面体，头部直径约为50nm，尾长约为200nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2011年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第九次报告》，vB_SagS_FSN1属于长尾噬菌体科(Siphoviridae)。
实施例4温度及酸碱度对噬菌体的影响
取0.1mL 1×109pfu/mL纯化的噬菌体(实施例2提供)于30℃-90℃水浴分别作用30min或60min，将样品冷却后测其效价；分别取pH 3.0-12.0的蛋白胨水和1×108pfu/mL纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。
温度对噬菌体存活的影响如图3所示，噬菌体在30-60℃分别作用30min或60min后，其活性无显著变化；80℃作用1h后，无噬菌体存活。
pH对噬菌体存活的影响如图4所示，在pH为3.0时，检测不到存活的噬菌体；pH为5.0-9.0时，其效价与初始效价无显著性差异；而当pH为12.0时，检测不到存活的噬菌体。
实施例5噬菌体全基因组的测序及耐药基因、毒力基因的分布
将实施例2提供的噬菌体按噬菌体DNA试剂盒(北京艾比根生物科技有限公司)的说明进行基因组的提取。将提取的基因组送至广州基迪奥生物科技有限公司进行全基因组测序。将所获得全基因组序列在耐药基因数据库ARDB(http://ardb.cbcb.umd.edu/),Arg-annot(http://www.mediterranee-infection.com/article.php？laref＝282&titer＝arg-annot),CARD(http://arpcard.mcmaster.ca/download)等数据库中依次进行注释，确定噬菌体vB_SagS_FSN1是否携带耐药基因；将噬菌体的全基因组序列在毒力基因数据库VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)中进行注释，确定噬菌体vB_SagS_FSN1是否携带毒力基因。
噬菌体vB_SagS_FSN1的全基因组序列如图5所示，对其全基因组序列的分析表明，该噬菌体不携带耐药基因及毒力基因，在基因水平上是安全的。
实施例6噬菌体对奶牛乳腺上皮细胞的毒性试验
试验参考CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒的说明书(Proomega公司)，通过测定噬菌体与奶牛乳腺上皮细胞(美国佛蒙特州立大学赵凤启博士馈赠)共培养后，细胞乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase，LDH)的释放量来确定不同剂量噬菌体(实施例2提供)对细胞的毒性。
试验在96孔细胞培养板中进行，共设置以下4组试验孔：
(1)噬菌体感染试验孔：每孔细胞中加入50μL噬菌体悬液；
(2)靶细胞自发LDH释放孔：向每孔细胞中加入50μL MEM培养基；
(3)靶细胞最大LDH释放孔(后期加入裂解液)：向每孔细胞中加入50μL MEM培养基；
(4)培养基背景对照孔：向空白孔中加入100μL MEM培养基；
上述每组设置4个重复孔。在试验中，50μL噬菌体悬液所含有噬菌体的浓度设置为1×109pfu/mL、1×1010pfu/mL及1×1011pfu/mL。
将所有试验组处理完后，800g离心细胞培养板10min，将细胞培养板置于37℃，5％CO2环境中培养3h，在培养结束前45min，将10μL试剂盒中的细胞裂解液(试剂盒中提供)加入到靶细胞最大LDH释放孔和体积校正孔中。培养3h后，800g离心细胞培养板10min，然后每孔取出50μL培养上清液转移至新的96孔细胞板中，随后向含有上清液的细胞培养板中每孔加入50μL配置好的底物(试剂盒中提供)，室温避光作用30min。最后向每孔中加入50μL终止液(试剂盒中提供)，用注射器针头刺破气泡，在1h内测定每孔液体的OD490。
结果显示，在噬菌体vB_SagS_FSN1浓度为1×109pfu/mL、1×1010pfu/mL及1×1011pfu/mL的情况下，对奶牛乳房上皮细胞均无细胞毒性。
实施例7噬菌体对BALB/c小鼠的毒性试验
6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，平均体重25±2g，共24只，购自扬州大学比较医学中心。
将小鼠随机分为4组，每组6只；其中三组分别口服噬菌体vB_SagS_FSN1(实施例2提供)1×109pfu/0.2mL/只、1×1010pfu/0.2mL/只及1×1011pfu/0.2mL/只；对照组口服等体积的PBS。连续口服14天后，每组脱颈致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况，并对各脏器制作病理切片后进行观察。
结果显示，三种剂量的噬菌体对小鼠健康及日常行为没有影响，解剖检查未见任何异常，病理切片观察结果亦表明各组小鼠的脏器均属正常，与PBS组小鼠没有差异。
实施例8噬菌体的裂解谱分析
以实施例2的提供的噬菌体vB_SagS_FSN1进行此实验，将其效价调整为1×108pfu/mL备用。
试验选择ST67、ST103及ST568等3种序列型的牛源无乳链球菌流行株进行，每种序列型选择16株临床分离株，通过对48株无乳链球菌进行裂解实验确定噬菌体vB_SagS_FSN13的裂解谱，具体操作如下：分别取无乳链球菌的过夜培养物100μL，滴加在1.2％THB培养基平板中央，用涂布棒将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成6个区域，其中3个区域，取10μL噬菌体滴加在菌苔表面，另3个区域滴加10μL生理盐水作为对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12h，观察结果。
结果如表1所示，噬菌体vB_SagS_FSN1对48株无链球菌中的42株有裂解作用，可形成透明、圆形、无晕斑的噬菌斑，裂解率为87.5％，说明该噬菌体对牛源无乳链球菌流行株具有良好的裂解效果。
表1噬菌体vB_SagS_FSN1的裂解谱
注：“+”表示可形成透亮的噬菌斑；“-”表示不能形成透亮的噬菌斑。
实施例9噬菌体在培养基中的杀菌效果
取1.0mL过夜培养的无乳链球菌菌液HZJG1201，用THB培养基将其OD600值调整为1.0(约为5.0×108CFU/mL)，分别加入实施例2提供的噬菌体vB_SagS_FSN15×105PFU/mL(MOI＝0.001)、5×106PFU/mL(MOI＝0.01)、5×107PFU/mL(MOI＝0.1)和5×108PFU/mL(MOI＝1)，5×109PFU/mL(MOI＝10)和5×1010PFU/mL(MOI＝100)于37℃静置培养，同时以加入等体积PBS作为对照组。在培养0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h和5h后分别检测OD600值的变化。
结果如图6所示，与PBS对照组(MOI＝0)相比，噬菌体vB_SagS_FSN1处理组的细菌增长速度显著较低，并且在处理1.5h后，细菌总量出现下降，且感染比越高，细菌数量下降越明显，当MOI>0.1时，3h无乳链球菌的数量已控制到较低值，且5h时OD600值接近于0，说明噬菌体vB_SagS_FSN1在培养基中杀菌迅速且彻底。
实施例10噬菌体治疗奶牛乳房炎
该试验在扬州市实验农牧场进行，选取场内24头患隐性乳房炎的奶牛(通过16SrDNA测序鉴定奶牛乳房炎由无乳链球菌引起)。随机分为2组，噬菌体治疗组及PBS对照组，每组12头奶牛。将两组奶牛饲养在同一个牛舍中，噬菌体治疗组用实施例2提供的纯化噬菌体(终效价为1×109pfu/mL)，在每次挤奶后对乳房炎奶头灌注5mL噬菌体液体，PBS对照组对乳房炎奶头灌注5mL PBS，连续处理1周后，观察乳房炎奶头的表观症状，并测定其分泌乳汁中的体细胞数量，对治疗效果进行评价。
结果表明，噬菌体治疗组中有8头奶牛的隐性乳房炎症状消失，治愈率达到了75％，而PBS对照组中仅有1头奶牛的隐性乳房炎症状出现了缓解，其他11头奶牛的乳房炎症状没有减轻，说明噬菌体vB_SagS_FSN1以灌注剂的方式能够治疗无乳链球菌引起的奶牛乳房炎。
实施例11噬菌体预防奶牛乳房炎发生
该试验在扬州市实验农牧场进行，选取3个牛舍的120头奶牛进行试验，每个牛舍选取40头无乳房炎症状的奶牛进行试验，将每个牛舍中的奶牛随机分成两组(每组20头奶牛)，实验组使用实施例2提供的噬菌体(终效价为1×108pfu/mL)在挤奶前和挤奶后进行药浴，对照组使用PBS在挤奶前和挤奶后进行药浴。乳头药浴每天2次，每次5s，持续使用30天。30天后通过测定奶样中的体细胞数量，判定乳房炎是否发生，统计两组奶牛的乳房炎发生率。
结果表明，使用噬菌体进行药浴的奶牛，其乳房炎发生率仅为5％(3/60)，而以PBS进行处理的奶牛，其乳房炎发生率为11.6％(7/60)，说明噬菌体vB_SagS_FSN1以药浴的方式可以有效预防奶牛乳房炎的发生。
实施例12噬菌体清除奶牛养殖环境中的无乳链球菌
该试验在扬州市实验农牧场进行，试验预先将浓度为105cfu/mL的无乳链球菌HZJG1201喷洒在奶牛料槽表面，然后以实施例2提供的噬菌体稀释液(终效价为1×107pfu/mL)对料槽表面进行喷洒，喷洒3h和5h后，使用平板计数法对料槽表面的无乳链球菌数量进行统计，同时以PBS喷洒组作为对照。
结果表明，使用噬菌体稀释液喷洒3h后，料槽表面的无乳链球菌的数量降到500CFU以下，喷洒5h后，料槽表面无乳链球菌的数量下降到10CFU以下，基本将无乳链球菌消灭干净，说明噬菌体vB_SagS_FSN1以环境消毒剂的方式可以有效清除掉奶牛养殖环境中的无乳链球菌。

Claims (8)

1.一株链球菌噬菌体vB_SagS_FSN1（Streptococcus phage vB_SagS_FSN1），其保藏号为CCTCC NO：M 2017670。
2.如权利要求1所述链球菌噬菌体在杀灭环境中无乳链球菌中的应用。
3.如权利要求1所述的链球菌噬菌体在制备防治奶牛乳房炎药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含权利要求1所述的链球菌噬菌体。
5.如权利要求4所述的药物组合物在制备防治奶牛乳房炎药物中的应用。
6.一种权利要求4所述的药物组合物的使用方法，其特征在于，利用该药物组合物对奶牛乳房进行灌注。
7.权利要求4所述的药物组合物的使用方法，其特征在于，将药物组合物对奶牛乳头进行药浴。
8.权利要求4所述的药物组合物的使用方法，其特征在于，将该药物组合物制成环境消毒剂喷洒在奶牛养殖环境中。
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