CN103893760A - 抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物及其制备方法及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物、其制备方法、以及其制剂。该方法包括以下步骤：1)筛选引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌作为病原体；2)培养有代表性的牛乳房炎耐药致病菌；3)应用抗体技术制备高活性抗牛乳房炎耐药菌IgY；4)制备牛乳房炎有代表性耐药致病宿主细菌的复合噬菌体；5)制备抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体的组合物；6)制备含抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的针剂和乳房灌注剂以及膏剂等制剂。本发明结合了抗牛乳房炎耐药菌IgY和噬菌体各自的优势，克服了IgY不能直接杀灭致病菌的不足，同时充分发挥噬菌体小剂量给药可达到大剂量效果的增效作用；从而提升了产品对顽固性牛乳房炎和隐性乳房炎的疗效。

Description

抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物及其制备方法及制剂

技术领域

本发明涉及牛乳房炎的治疗药物，尤其涉及到一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物、其制备方法、以及这种组合物制剂。 

背景技术

奶牛乳房炎是世界范围内最常见而又最难防治的奶牛疾病之一。目前全世界约有2.2亿头奶牛，其中1/3患有各种类型的乳房炎。据统计，临床型乳房炎占奶牛总发病的2成多，一般造成产奶量下降，乳液废弃，严重时，患牛乳区肿胀硬化、化脓、坏疽甚至萎缩，失去泌乳能力，被迫淘汰，每年因乳房炎而最终淘汰的病牛约占总淘汰率的30%。而在所有的牛乳房炎中，隐性乳房炎在奶牛群中最普遍，在一个牛群中，大多数乳房炎（大约90%）是隐性型，给奶农造成的经济损失也最大。残酷的现实是，即使在饲养水平较高的发达国家，隐性乳房炎的发病率也在50%以上，而且至今仍无真正有效的防治手段和方法；因此，严重阻碍了世界各国以及我国的乳牛业的发展。 

目前，全球对奶牛乳房炎普遍采用抗生素进行治疗。但是，使用抗生素治疗一方面会造成牛乳中抗生素残留，另一方面会诱发细菌产生耐药性，使抗生素失效，造成慢性乳房炎特别是隐性乳房炎比例越来越来大。特别是大量使用抗生素之后形成的L-型变种耐药致病菌，目前所有抗生素对它都无效；既使施用再多抗生素，它仍会隐藏在乳房内生存和繁殖，慢性感染乳腺，使乳房炎反复发作。另外，抗生素会杀灭有益菌，从而影响乳房内正常菌群平衡，破坏机体天然免疫屏障，给有害菌大开方便之门。这些都是造成牛乳房炎无法根治，并且不断蔓延的根本原因。 

因此，研发一种既能有效防治临床型牛乳房炎，又能防治迄今仍束手无策的隐性牛乳房炎的新方法，解决严重影响乳业发展的最大难题，以达到提 高乳制品质量和增加养殖经济效益的双重目的，是目前全球奶牛饲养业的迫切需求。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有牛乳房炎的治疗药物无法有效杀死病菌的缺陷，提供一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物及其制备方法以其制剂。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，包括以下步骤： 

S1、筛选引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌作为病原体，所述耐药致病菌为耐药金黄色葡萄球菌、耐药停乳链球菌、耐药无乳链球菌以及耐药大肠杆菌中的一种或多种； 

S2、将所述耐药致病菌粉碎处理后，加入福氏佐剂，再高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药致病菌复合抗原； 

S3、采用所述耐药致病菌复合抗原对具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类进行免疫，再拣取所产的免疫蛋； 

S4、对所述免疫蛋进行消毒，取蛋黄，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY； 

S5、制备引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌的复合噬菌体，包括耐药致病菌为耐药金黄色葡萄球菌噬菌体、耐药停乳链球菌噬菌体、耐药无乳链球菌噬菌体以及耐药大肠杆菌噬菌体； 

S6、将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体混合，制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY与复合噬菌体组合物。 

在根据本发明所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法中，所述步骤S5进一步包括： 

1）分别取耐药金黄色葡萄球菌菌株、耐药无乳链球菌菌株、耐药停乳链球菌菌株、耐药大肠杆菌菌株各一批，加入无菌水制成四种菌悬液； 

2）分别在三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的发酵罐中，加入预处理的 污水溶液与耐药金黄色葡萄球菌、耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药大肠杆菌菌悬液中的其中一种菌悬液，37℃培养12～24小时； 

3）将以上四种混合培养液高速离心，将离心所得上清液进行真空过滤除菌，并将滤液在37℃培养过夜； 

4）分别在肉膏蛋白胨琼脂平板上加入四种菌悬液中一种，将菌悬液涂布成均匀的薄层，待平板上的菌悬液干后得到平板菌层，分散滴加数滴滤液于平板菌层上面，37℃培养过夜，分别得到无菌生长的耐药金黄色葡萄球菌噬菌斑、耐药无乳链球菌噬菌斑、耐药停乳链球菌噬菌斑和耐药大肠杆菌噬菌斑； 

5）分别取步骤1）中四种菌悬液接种于液体培养基内，混合均匀；再取上层琼脂培养基，溶化并冷却,分别加入步骤4）中对应的噬菌斑的噬菌体混匀；再注入底层培养基上混匀，置37℃培养后过滤除菌，即得到纯化的噬菌体； 

6）分别将步骤3）制得的四种耐药菌的过夜培养液按照1﹕100加入到LB液体培养基中，振荡培养至菌液对数生长前期；以感染复数0.1～1加入对应的步骤5）中制得的四种噬菌体中一种，混合均匀并静置，随后振荡培养至宿主菌完全裂解，噬菌体裂解液离心取上清过滤除菌，制得四种噬菌体中之一种的扩充滤液； 

7）将步骤6）制得的四种噬菌体扩充滤液按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，得到引复合噬菌体。 

在根据本发明所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法中，所述步骤6）中将噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。 

在根据本发明所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法中，所述步骤S6中将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体按照(1-10):(1-10)比例混合，置入搅拌机中充分混合均匀，制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY与复合噬菌体组合物。 

本发明还提供了一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物，采用如上所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法制得。 

本发明还提供了一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其中包括如上所述方法制备的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物，还包括针剂辅料和乳房灌注剂辅料或乳膏辅料。 

在根据本发明所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂中，所述制剂为针剂，所述针剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。 

在根据本发明所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂中，所述制剂为乳房灌注剂，所述乳房灌注剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。 

在根据本发明所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂中，所述制剂为乳膏，所述乳膏辅料包括油、钛白粉、以及微粉硅胶。 

实施本发明的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法和制剂，具有以下有益效果：本发明通过将IgY技术和噬菌体技术相结合制得用于预防和治疗牛乳房炎的药物，噬菌体能在致病菌细胞内生成毒蛋白，快速杀死致病菌，可协同IgY直接杀死致病菌包括对所有抗生素都耐药的超级细菌；因此，可弥补IgY只能抑制病菌而不能直接杀死病菌的不足，能够有效地治疗牛乳房炎。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。 

本发明是通过以下技术措施实现的，一种抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的制备方法，包括以下步骤： 

一、制取抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY 

1、根据流行病学，筛选有代表性牛乳房耐药致病菌 

乳房炎的耐药致病细菌有几十种，根据流行病学调查，首先在各地奶牛场现场收集不同种类的耐不同抗生素的致病菌，经过分离、纯化，再用PCR方法筛选和鉴定。选择以下四种有代表性的耐药致病菌： 

(1)耐药金黄色葡萄球菌； 

(2)耐药停乳链球菌； 

(3)耐药无乳链球菌； 

(4)耐药大肠杆菌。 

2、制备有代表性牛乳房耐药致病菌复合抗原 

将以上有代表性的牛乳房耐药致病菌中的任意一种或任意几种进行培养并纯化，然后将任意几种按任意比例混合均匀，再加以超声粉碎；最后把超声粉碎后的一种或任意几种的混合物按重量1-10:10-1的重量比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，分别制得多种耐药致病菌复合抗原； 

3、制取免疫蛋：采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类，再分别采用上一步骤制备不同的耐药致病菌复合抗原对高免疫应答能力的选择产蛋禽类进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记； 

4、制取抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY粗提物：根据免疫所用不同的耐药致病菌复合抗原，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用苏打水消毒，打蛋机打碎免疫蛋，筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-60℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0%海藻酸钠水溶液，稀释至0.1%的浓度，搅拌至出现浑浊；再加入2.0%CaCl2液，稀释至0.1%的浓度，搅拌均匀，40℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清液；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；使用除病毒过滤器除去病毒；即分别制得不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物；最后，将所制备的对应不同耐药致病菌复合抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记； 

5、制取抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY纯品：将同类的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY粗提物分别经过蛋白层析装置进行纯化处理，制得不同的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY纯品； 

二、制备牛乳房炎有代表性耐药致病宿主细菌的复合噬菌体并纯化： 

1、制备菌悬液：分别取耐药金黄色葡萄球菌菌株、耐药无乳链球菌菌株、耐药停乳链球菌菌株、耐药大肠杆菌菌株各一批，加入无菌水制成四种宿主耐药菌菌悬液。 

2、增殖培养：分别在三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的发酵罐中，加入预处理的污水溶液与耐药金黄色葡萄球菌、耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药大肠杆菌菌悬液中的其中一种菌悬液，37℃培养12～24小时 

3、制备裂解液：将以上混合培养液高速离心。将已灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，将离心上清液倒入滤器，真空过滤除菌。所得滤液倒入灭菌容器内，37℃培养过夜。 

4、制备噬菌斑：分别在肉膏蛋白胨琼脂平板上加入四种菌悬液中一种，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，37℃培养过夜。分别得到无菌生长的透明耐药金黄色葡萄球菌噬菌斑、耐药无乳链球菌噬菌斑、耐药停乳链球菌噬菌斑、耐药大肠杆菌噬菌斑。 

5、噬菌体的纯化：取四种耐药菌菌悬液之一种接种于液体培养基内，使混合均匀；再取上层琼脂培养基，溶化并冷却,加入以上四种噬菌体之一种，混匀；再注人底层培养基上，再混匀，置37℃培养12小时。最后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。 

6、噬菌体的大量扩增：分别将四种宿主耐药菌的过夜培养物按照1﹕100加入到LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养至菌液对数生长前期（D600nm≈0.2）。以感染复数0.1～1加入对应的四种噬菌体中一种，混合均匀，室温静置15min，37℃、160r/min振荡培养至宿主菌完全裂解，噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，就得到四种噬菌体中之一种的扩充滤液。 

7、复合噬菌体的制备：将四种噬菌体扩充滤液按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，即得到牛乳房炎致病宿主菌复合噬菌体溶液。 

三、制备抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物 

将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体按(1-10):(1-10)比例混合，置入搅拌机中充分混合均匀，即制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物。 

四、制备含抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物制剂 

将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物配以不同的辅料制成针剂和乳膏等多种剂型用于预防和治疗顽固性牛乳房炎和隐性牛乳房炎。本发明可以制成针剂，针剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。本发明也可以制成乳房灌注剂，乳房灌注剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。本发明还可以制成乳膏，乳膏辅料包括油、钛白粉、以及微粉硅胶。 

下面对上述抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物的治疗原理进行说明。 

目前普遍采用的抗生素等传统治疗方法除了存在着如前所叙的耐药性和药物残留以及破坏乳池菌群平冲等弊病之外，这些传统疗法还不能用于预防，也不能用于治疗隐性乳房炎。而隐性牛乳房炎又是造成奶牛“体细胞数”居高不下的根本原因。要降低奶牛体细胞数，提高乳产品的质量，就必须采取有效措施预防牛乳房炎并减少隐性牛乳房炎的发病率。因此，寻找一种更有效和更好的防治牛乳房炎的方法和手段，成为摆在世界各国医药界和奶牛养殖业面前的重大课题。 

鸡卵黄免疫球蛋白IgY能定向杀灭引起牛乳房炎的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌；特别是还能有效杀灭抗生素对其无能为力的抗药性耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌。而且，由于这种特异性IgY只杀灭病原体，对牛乳房内的乳酸杆菌等有益菌郝秋毫无犯；因此，不会象抗生素那样杀灭乳房内乳酸杆菌等有益菌，破坏乳房内正常的酸性环境和菌群平衡，造成二次感染或反复复发。更重要的是，使用这种特异性IgY还会恢复有益菌良好的生长微环境，构建有益菌群，从而形成无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及真菌无法再生存的新的菌群生态平衡，达到牛乳房炎不再复发的长效抑菌 效果。 

而噬菌体是一类能侵入细菌体内、在其中大量繁殖并使细菌裂解的微生物。噬菌体具有与IgY类似的特异性，对细菌具有高度专一性，体内外均可作用于寄主细胞快速裂解死亡，而对其它细胞无任何毒副作用。噬菌体治疗是根据噬菌体的专一性，分离病原菌的噬菌体，通过扩增繁殖，然后用它来杀死感染组织中致病性细菌。 

本发明采用IgY技术和噬菌体技术相结合用于预防和治疗牛乳房炎，具有以下创新点： 

1、噬菌体与IgY一样具有特异性，一种噬菌体只能杀灭特定种类的病菌，对其它细菌无伤害，不象普通抗生素那样会破坏动物体内正常的微生物平衡；IgY与噬菌体协同作用，会使IgY功效倍增。 

2、噬菌体能在致病菌细胞内生成毒蛋白，快速杀死致病菌，可协同IgY直接杀死致病菌包括对所有抗生素都耐药的超级细菌；因此，可弥补IgY只能抑制病菌而不能直接杀死病菌的不足。同时，噬菌体是“活药”，在靶细菌群扩散时其数量会迅速增加，具有特殊的增效功能，往往小剂量给药就可达到大剂量的效果。本发明充分发挥了噬菌体所特有的协同和增效的生物特性，把噬菌体和IgY组合在一起，达到显著提高产品显效性的目的。这一点对于攻克顽固性牛乳房炎和隐性牛乳房炎防治方面的世界难关，具有特别的意义。 

3、噬菌体与IgY一样具备使用安全、没有毒性的生物特性，它们同样都只侵犯细菌而不侵犯体细胞，不会感染人类和动物。 

因此，IgY和噬菌体二者协同作用，可达到最佳效果。 

另外，由于采用抗生素治疗牛乳房炎存在药残问题，奶场不得不停挤奶或弃乳，这方面的的损失十分可观。一般施用抗生素或化学药后起码需要停止挤奶五天以上；因此，奶农每施一次药，每头牛至少损失125～210公斤牛乳，按一个牧场有100多头乳牛计算，一个牧场每次施药就要损失10吨以上牛奶。本发明的组合物之一的免疫球蛋白IgY是一种天然安全的物质，美国食品医药管理局(FDA)己将其列入“一般公认安全物质(Generally Regarded as Safe,GRAS)”范畴，是人类和奶牛可天天食用的蛋制品成份的提取物，没有任何毒 副作用，既使长期给奶牛使用也不会产生残留；而组合物之一的噬菌体也是一种安全无毒的微生物，鉴于噬菌体的安全性，美国食品医药管理局（FDA）已批准噬菌体用作食品添加剂。因此，本发明的组合物制剂不必像抗生素药物那样需要停挤乳或弃乳期。这样，这种新制剂不但可用于治疗临床型牛乳房炎，还可用于预防牛乳房炎和治疗隐性牛乳房炎；从而，一方面可大幅度减少奶牛场的损失，提高经济效益；另一方面还可降低鲜奶的体细胞数，提升奶制品的质量，增进食品安全。 

下面结合具体的实施例以及检验实例和对本发明进行进一步详细说明。 

实施例1 

制备抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY 

1.制备牛乳房炎耐药菌复合抗原 

1.1向中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所购买以下有代表性的耐药致病菌： 

(1)耐药金黄色葡萄球菌（包括但不限于耐头孢他啶、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、四环素、阿莫西林）。采用02161（北京-2#）或91545（西安-1#）或2691（兰州-3#）。 

(2)耐药停乳链球菌（包括但不限于耐青霉素G、羧芐青霉素、先锋V、菌必治、凯福隆、复达欣、丁胺卡那、链霉素、卡那霉素、红霉素、复方新诺明、奥复星、氯洁霉素、舒巴坦、多粘菌素B、恩诺沙星、阿莫西林、）。采用江苏-1#或新疆伊犁-2006#。 

(3)耐药无乳链球菌（包括但不限于耐青霉素G、羧芐青霉素、先锋V、菌必治、丁胺卡那、链霉素、阿奇霉素、卡那霉素、、庆大霉素、恩诺沙星、复方新诺明、丁胺卡那）。采用1427-1#（山西）或（宁夏-M17)或600060-2#（兰州）。 

(4)耐药大肠杆菌（包括但不限于耐青霉素G、氨芐青霉素、羧芐青霉素、链霉素、庆大霉素、新生霉素、麦迪霉素、万古霉素、罗红霉素、四环素、、洁霉素、氯洁霉素、乙酰螺旋霉素、强力霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、 复方新诺明、尤立新）；采用于88018-#（兰州）或92014-2#（青岛）。 

1.2采用常规方法培养和纯化这些耐菌致病菌，然后按(10-1):(10-1):(1-10):(1-10)比例混合均匀，得耐药致病菌混合物。 

1.3超声处理耐药致病菌混合物，得到菌株和菌体成份混合物。 

1.4把超声处理后的耐药致病菌菌株和菌体成份混合物按(1-10):(10-1)的比例（通常为1:1）加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得耐药致病菌复合抗原。 

2.制备含高活性抗体的免疫蛋 

可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。 

2.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡 

2.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的（SPF）健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上述制得的耐药致病菌复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫，每只鸡肌内注射耐药致病菌复合抗原1ml。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。 

2.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到10只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5%新洁而灭溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0,4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY浓缩液体。 

2.1.3分别以耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药金黄色葡萄球菌、耐药大肠杆菌作为抗原，采用酶联免疫法（ELISA）检测所制得的200批抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY浓缩液体中每批对耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药金黄色葡萄球菌、耐药大肠杆菌的抗体结合效价。 

2.1.4将凡是对耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药金黄色葡萄球菌、耐药大肠杆菌的抗体结合效价达到1：1024以上的该批抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。结果选出100只“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”。 

采用这100只“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”免疫，每只鸡肌内注射耐药致病菌复合抗原1ml，每隔二周注射一次，共计三次。 

第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第7个月检得的15,500只免疫蛋。 

3.制备抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY粗品 

将所获得的15,500只高免疫蛋分别用0.5%新洁而灭溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0,4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。 

然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。 

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。 

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY粗品1520克。 

4.制备抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY纯品 

将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得高活性的抗牛乳房炎耐药菌特异性 IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求。 

可将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY纯品干粉110克。 

实施例2 

制备牛乳房炎耐药无乳链球菌噬菌体 

1.采集奶样：生产所用奶样采自广州市奶牛研究所良种牛繁育基地，所选10头奶牛均具有明显的乳房炎症状，常规挤奶消毒后，用酒精棉球消毒乳头和采样者手指。每个乳头无菌取20mL奶样，进行实验分析。 

2.收集污水样：将奶牛场挤奶之前擦洗奶牛乳房时洗刷下来的污水收集装入灭菌的100mL离心管中。 

3.处理污水样：将200mL污水样于4℃，10000r/min离心10min，除去细菌及其他杂质碎片，再采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，过滤除菌后的滤液倒入灭菌瓶内，37℃培养过夜。将经无菌检查确认无菌的滤液置入4℃冰箱保存。 

4.制备含有耐药无乳链球菌噬菌体的原液：取过滤除菌的污水样200mL、LB液体培养基200mL和噬菌体标准宿主菌耐药无乳链球菌增菌液(D600nm≈0.6)200.0mL混匀，37℃、160r/min振荡培养过夜；次日8000r/min离心10min，取上清200mL，加入LB液体培养基200mL及宿主菌耐药无乳链球菌增菌液5.0mL，静置30min，37℃，160r/min振荡培养10h；混合培养物8000r/min离心10min，取上清100mL，加入LB液体培养基100mL及宿主菌耐药无乳链球菌增菌液3.0mL，室温放置30min，37℃、160r/min振荡培养3.5h，10000r/min离心30min，上清用美国鲍尔超细过滤公司（Pall Ultrafine Filtration Company）制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得含有耐药无乳链球菌噬菌体的原液。 

5.制备耐药无乳链球菌噬菌体：3.0mL耐药无乳链球菌增菌液(D600 nm≈0.6)中加入1.0mL耐药无乳链球菌噬菌体原液，轻轻涡旋振荡混匀后，室温放置15min，加入45℃，0.4%半固体软琼脂培养基（水浴中保温）35mL，轻轻涡旋混匀，倒至1.5%固体琼脂平板上制成双层平板，室温静置约10min，待上层培养基完全凝固后，37℃培养过夜。即得到无菌生长的以耐药无乳链球菌为宿主菌的噬菌体。 

6.纯化耐药无乳链球菌噬菌体：从长出耐药无乳链球菌噬菌斑的平板中挑取1个较大的、边缘光滑的噬菌斑于20mL过夜培养的耐药无乳链球菌菌悬液中(D600nm≈0.6)，37℃、220r/min振荡培养6h，8000r/min离心10min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双层琼脂平板培养。重复多次即制成纯化的耐药无乳链球菌噬菌体。 

7.制备高活性耐药无乳链球菌噬菌体：将纯化的耐药无乳链球菌噬菌体滤液与LB液体培养基按l﹕10混合，加入等量耐药无乳链球菌菌悬液培养增殖，重复多次，再过滤，即制成高活性耐药无乳链球菌噬菌体液体。最终得到的噬菌体加20%甘油保存于-20℃。 

8.扩增耐药无乳链球菌噬菌体：将耐药无乳链球菌的过夜培养物按照1﹕100加入到LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养至菌液对数生长前期（D600nm≈0.2）。以感染复数0.1～1加入耐药无乳链球菌噬菌体，混合均匀，室温静置15min，37℃、160r/min振荡培养至宿主菌耐药无乳链球菌完全裂解，耐药无乳链球菌噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清液用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即制得耐药无乳链球菌噬菌体溶液。 

9.制备耐药无乳链球菌噬菌体干粉：可将所制得耐药无乳链球菌噬菌体溶液应用冷冻干燥机干燥，即制得耐药无乳链球菌噬菌体干粉13克。 

实施例3 

制备牛乳房炎耐药停乳链球菌噬菌体 

1.采集奶样：生产所用奶样采自广州市奶牛研究所良种牛繁育基地，所选10头奶牛均具有明显的乳房炎症状，常规挤奶消毒后，用酒精棉球消毒乳头 和采样者手指。每个乳头无菌取20mL奶样，进行实验分析。 

2.收集污水样：将奶牛场挤奶之前擦洗奶牛乳房时洗刷下来的污水收集装入灭菌的100mL离心管中。 

3.处理污水样：将200mL污水样于4℃，10000r/min离心10min，除去细菌及其他杂质碎片，再采用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，过滤除菌后的滤液倒入灭菌瓶内，37℃培养过夜。将经无菌检查确认无菌的滤液置入4℃冰箱保存。 

4.制备含有耐药停乳链球菌噬菌体的原液：取过滤除菌的污水样200mL、LB液体培养基200mL和噬菌体标准宿主菌耐药停乳链球菌增菌液(D600nm≈0.6)200.0mL混匀，37℃、160r/min振荡培养过夜；次日8000r/min离心10min，取上清200mL，加入LB液体培养基200mL及宿主菌耐药停乳链球菌增菌液5.0mL，静置30min，37℃，160r/min振荡培养10h；混合培养物8000r/min离心10min，取上清100mL，加入LB液体培养基100mL及宿主菌耐药停乳链球菌增菌液3.0mL，室温放置30min，37℃、160r/min振荡培养3.5h，10000r/min离心30min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得含有耐药停乳链球菌噬菌体的原液。 

5.制备耐药停乳链球菌噬菌体：3.0mL耐药停乳链球菌增菌液(D600nm≈0.6)中加入1.0mL耐药停乳链球菌噬菌体原液，轻轻涡旋振荡混匀后，室温放置15min，加入45℃，0.4%半固体软琼脂培养基（水浴中保温）35mL，轻轻涡旋混匀，倒至1.5%固体琼脂平板上制成双层平板，室温静置约10min，待上层培养基完全凝固后，37℃培养过夜。即得到无菌生长的以耐药停乳链球菌为宿主菌的噬菌体。 

6.纯化耐药停乳链球菌噬菌体：从长出耐药停乳链球菌噬菌斑的平板中挑取1个较大的、边缘光滑的噬菌斑于20mL过夜培养的耐药停乳链球菌菌悬液中(D600nm≈0.6)，37℃、220r/min振荡培养6h，8000r/min离心10min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双层琼脂平板培养。重复多次即制成纯化的耐药停乳链球菌噬菌体。 

7.制备高活性耐药停乳链球菌噬菌体：将纯化的耐药停乳链球菌噬菌体 滤液与LB液体培养基按l﹕10混合，加入等量耐药停乳链球菌菌悬液培养增殖，重复多次，再过滤，即制成高活性耐药停乳链球菌噬菌体液体。最终得到的噬菌体加20%甘油保存于-20℃。 

8.扩增耐药停乳链球菌噬菌体：将耐药停乳链球菌的过夜培养物按照1﹕100加入到LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养至菌液对数生长前期（D600nm≈0.2）。以感染复数0.1～1加入耐药停乳链球菌噬菌体，混合均匀，室温静置15min，37℃、160r/min振荡培养至宿主菌耐药无乳链球菌完全裂解，耐药停乳链球菌噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清液用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即制得耐药停乳链球菌噬菌体溶液。 

9.制备耐药停乳链球菌噬菌体干粉：可将所制得耐药停乳链球菌噬菌体溶液应用冷冻干燥机干燥，即制得耐药停乳链球菌噬菌体干粉13克。 

实施例4 

制备牛乳房炎耐药金黄色葡萄球菌噬菌体 

1.采集奶样：生产所用奶样采自广州市奶牛研究所良种牛繁育基地，所选10头奶牛均具有明显的乳房炎症状，常规挤奶消毒后，用酒精棉球消毒乳头和采样者手指。每个乳头无菌取20mL奶样，进行实验分析。 

2.收集污水样：将奶牛场挤奶之前擦洗奶牛乳房时洗刷下来的污水收集装入灭菌的100mL离心管中。 

3.处理污水样：将200mL污水样于4℃，10000r/min离心10min，除去细菌及其他杂质碎片，再采用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，过滤除菌后的滤液倒入灭菌瓶内，37℃培养过夜。将经无菌检查确认无菌的滤液置入4℃冰箱保存。 

4.制备含有耐药金黄色葡萄球菌噬菌体的原液：取过滤除菌的污水样200mL、LB液体培养基200mL和噬菌体标准宿主菌耐药金黄色葡萄球菌增菌液(D600nm≈0.6)200.0mL混匀，37℃、160r/min振荡培养过夜；次日8000r/min离心10min，取上清200mL，加入LB液体培养基200mL及宿主菌耐药金黄 色葡萄球菌增菌液5.0mL，静置30min，37℃，160r/min振荡培养10h；混合培养物8000r/min离心10min，取上清100mL，加入LB液体培养基100mL及宿主菌耐药金黄色葡萄球菌增菌液3.0mL，室温放置30min，37℃、160r/min振荡培养3.5h，10000r/min离心30min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得含有耐药金黄色葡萄球菌噬菌体的原液。 

5.制备耐药金黄色葡萄球菌噬菌体：3.0mL耐药金黄色葡萄球菌增菌液(D600nm≈0.6)中加入1.0mL耐药金黄色葡萄球菌噬菌体原液，轻轻涡旋振荡混匀后，室温放置15min，加入45℃，0.4%半固体软琼脂培养基（水浴中保温）35mL，轻轻涡旋混匀，倒至1.5%固体琼脂平板上制成双层平板，室温静置约10min，待上层培养基完全凝固后，37℃培养过夜。即得到无菌生长的以耐药金黄色葡萄球菌为宿主菌的噬菌体。 

6.纯化耐药金黄色葡萄球菌噬菌体：从长出耐药金黄色葡萄球菌噬菌斑的平板中挑取1个较大的、边缘光滑的噬菌斑于20mL过夜培养的耐药金黄色葡萄球菌菌悬液中(D600nm≈0.6)，37℃、220r/min振荡培养6h，8000r/min离心10min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双层琼脂平板培养。重复多次即制成纯化的耐药金黄色葡萄球菌噬菌体。 

7.制备高活性耐药金黄色葡萄球菌噬菌体：将纯化的耐药金黄色葡萄球菌噬菌体滤液与LB液体培养基按l﹕10混合，加入等量耐药金黄色葡萄球菌菌悬液培养增殖，重复多次，再过滤，即制成高活性耐药金黄色葡萄球菌噬菌体液体。最终得到的噬菌体加20%甘油保存于-20℃。 

8.扩增耐药金黄色葡萄球菌噬菌体：将耐药金黄色葡萄球菌的过夜培养物按照1﹕100加入到LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养至菌液对数生长前期（D600nm≈0.2）。以感染复数0.1～1加入耐药金黄色葡萄球菌噬菌体，混合均匀，室温静置15min，37℃、160r/min振荡培养至宿主菌耐药金黄色葡萄球菌完全裂解，耐药金黄色葡萄球菌噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清液用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即制得耐药金黄色葡萄球菌噬菌体溶液。 

9.制备耐药金黄色葡萄球菌噬菌体干粉：可将所制得耐药金黄色葡萄球菌噬菌体溶液应用冷冻干燥机干燥，即制得耐药金黄色葡萄球菌噬菌体干粉16克。 

实施例5 

制备牛乳房炎耐药大肠杆菌噬菌体 

1.采集奶样：生产所用奶样采自广州市奶牛研究所良种牛繁育基地，所选10头奶牛均具有明显的乳房炎症状，常规挤奶消毒后，用酒精棉球消毒乳头和采样者手指。每个乳头无菌取20mL奶样，进行实验分析。 

2.收集污水样：将奶牛场挤奶之前擦洗奶牛乳房时洗刷下来的污水收集装入灭菌的100mL离心管中。 

3.处理污水样：将200mL污水样于4℃，10000r/min离心10min，除去细菌及其他杂质碎片，再采用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，过滤除菌后的滤液倒入灭菌瓶内，37℃培养过夜。将经无菌检查确认无菌的滤液置入4℃冰箱保存。 

4.制备含有耐药大肠杆菌噬菌体的原液：取过滤除菌的污水样200mL、LB液体培养基200mL和噬菌体标准宿主菌耐药大肠杆菌增菌液(D600nm≈0.6)200.0mL混匀，37℃、160r/min振荡培养过夜；次日8000r/min离心10min，取上清200mL，加入LB液体培养基200mL及宿主菌耐药大肠杆菌增菌液5.0mL，静置30min，37℃，160r/min振荡培养10h；混合培养物8000r/min离心10min，取上清100mL，加入LB液体培养基100mL及宿主菌耐药大肠杆菌增菌液3.0mL，室温放置30min，37℃、160r/min振荡培养3.5h，10000r/min离心30min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得含有耐药大肠杆菌噬菌体的原液。 

5.制备耐药大肠杆菌噬菌体：3.0mL耐药大肠杆菌增菌液(D600nm≈0.6)中加入1.0mL耐药大肠杆菌噬菌体原液，轻轻涡旋振荡混匀后，室温放置15min，加入45℃，0.4%半固体软琼脂培养基（水浴中保温）35mL，轻轻涡旋混匀，倒至1.5%固体琼脂平板上制成双层平板，室温静置约10min，待上层 培养基完全凝固后，37℃培养过夜。即得到无菌生长的以耐药大肠杆菌为宿主菌的噬菌体。 

6.纯化耐药大肠杆菌噬菌体：从长出耐药大肠杆菌噬菌斑的平板中挑取1个较大的、边缘光滑的噬菌斑于20mL过夜培养的耐药大肠杆菌菌悬液中(D600nm≈0.6)，37℃、220r/min振荡培养6h，8000r/min离心10min，上清用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双层琼脂平板培养。重复多次即制成纯化的耐药大肠杆菌噬菌体。 

7.制备高活性耐药大肠杆菌噬菌体：将纯化的耐药大肠杆菌菌噬菌体滤液与LB液体培养基按l﹕10混合，加入等量耐药大肠杆菌菌悬液培养增殖，重复多次，再过滤，即制成高活性耐药大肠杆菌噬菌体液体。最终得到的噬菌体加20%甘油保存于-20℃。 

8.扩增耐药大肠杆菌噬菌体：将耐药大肠杆菌的过夜培养物按照1﹕100加入到LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养至菌液对数生长前期（D600nm≈0.2）。以感染复数0.1～1加入耐药大肠杆菌噬菌体，混合均匀，室温静置15min，37℃、160r/min振荡培养至宿主菌耐药大肠杆菌完全裂解，耐药大肠杆菌噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清液用美国鲍尔超细过滤公司制造的0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即制得耐药大肠杆菌噬菌体溶液。 

9.制备耐药大肠杆菌噬菌体干粉：可将所制得耐药大肠杆菌噬菌体溶液应用冷冻干燥机干燥，即制得耐药大肠杆菌噬菌体干粉13克。 

实施例6 

制备牛乳房炎复合噬菌体溶液或干粉 

1.把所制得的耐药无乳链球菌噬菌体溶液和耐药停乳链球菌噬菌体溶液以及耐药金黄色葡萄球菌噬菌体溶液和耐药大肠杆菌噬菌体溶液按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，即制成牛乳房炎复合噬菌体溶液。 

2.把所制得的耐药无乳链球菌噬菌体干粉和耐药停乳链球菌噬菌体干粉以及耐药金黄色葡萄球菌噬菌体干粉和耐药大肠杆菌噬菌体干粉按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，即制成牛乳房炎复合噬菌体干粉。 本实施例是按照耐药无乳链球菌噬菌体干粉占总量23.6%，耐药停乳链球菌噬菌体干粉占总量23.6%，耐药金黄色葡萄球菌噬菌体干粉占总量29.2%，耐药大肠杆菌噬菌体干粉占总量23.6%，23.%，混合均匀；制成牛乳房炎复合噬菌体干粉55克。 

实施例7 

制备抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物 

把所制得的抗牛乳房炎耐药菌IgY溶液或干粉与复合噬菌体溶液或干粉按(1-10):(1-10)比例混合均匀，即制得抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物。本实施例把所制得的抗牛乳房炎耐药菌IgY110克和复合噬菌体55克按2:1混合均匀，即制得抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物165克。 

实施例8 

含抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的注射剂生产。实施方案如下： 

配方：（质量分数） 

表格1 

工艺： 

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。 

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物，搅拌完全溶解得溶液B。 

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。 

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。 

5.采用0.22的微孔滤膜将溶液B过滤除菌。 

6.采用无菌灌封机灌装于20ml无菌塑料注射针筒中。 

7.检漏、印字、微生物检测、效价检测，全部检验合格后包装出厂。 

实施例9 

含抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的乳膏生产。实施方案如下： 

配方： 

表格2 

工艺： 

1.将配方量棉籽油加热至100℃，然后冷却至30～45℃成溶液A。 

2.将配方量抗牛乳房炎IgY抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体组合物加入溶液A，充分搅拌均匀，制成溶液B。 

3.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B，充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。 

4.将成品分装，检验出厂。 

实施例10 

含抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的注射剂治疗牛乳房炎的疗效试验 

(1)试验地点：深圳市光明牛奶公司凤凰奶牛场。 

(2)治疗对象：该牛场2011年11月8日至16日发病的临床型乳房炎病例。（见下表） 

(3)治疗方法：每头牛每天一次通过乳头灌注一支深圳雅臣公司生产的【免力宝IgY乳炎清】（规格：20ml）。 

(4)试验结果：共治疗14头，治愈10头，治愈率71.4%。 

表格3 

牛舍	牛号	治疗日期	治疗次数	结果	备注
						三	06077	2011-11-16	5	治愈
三	04119	2011-11-12	4	治愈
						三	05105	2011-11-11	4	治愈
三	04082	2011-11-9	4	治愈
						三	07156	2011-11-8	3	治愈
四	06246	2011-11-11	4	未愈
						四	05159	2011-11-10	3	治愈
四	04059	2011-11-10	3	治愈
						四	02174	2011-11-10	4	治愈
四	03158	2011-11-10	3	治愈
						五	06249	2011-11-11	4	治愈
五	06267	2011-11-8	4	未愈
						五	07120	2011-11-8	4	未愈
五	04042	2011-11-8	5	未愈

注：根据《奶牛常见炎症防治技术要领》（现代生物技术与医药科技出版中心赵宏坤李国升李庆剧编著）一书指出： 

“对奶牛乳房炎，一般常用药物的治愈率不到40%。其原因包括：选药错误，用药量及时间不足，出现抗药株L-型变种菌；乳腺周围环境降低药力（包括pH值、炎性细胞碎片、体细胞数高），多数药物不能进入细胞、脓肿和纤维性病变中。” 

因此，本试验的治疗率达到71.4%，是相当理想的结果。证明雅臣所研制 的抗牛乳房炎IgY针剂对常见的牛乳房炎具有确切的疗效。 

实施例11 

含抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的注射剂治疗隐性乳房炎降体细胞数的实施验证 

(1)试验地点：广州市奶牛研究所良种牛繁育基地。该基地由奶牛研究所每月抽检体细胞数。 

(2)试验对象：该牛场2011年9月至11月份体细胞超标的隐性乳房炎病例。（见下表） 

(3)试验时间：2011年12月15日至2011年12月17日 

(4)试验人员：技术员赵干乐、林建华 

(5)试验方法：每头牛每天上午和晚上各一次通过乳头灌注一支深圳雅臣公司生产的“免力宝”（规格：20ml），连续注射三天。 

(6)试验结果（见下表） 

表格4 

结果显示，采用含抗牛乳房炎耐药菌IgY和复合噬菌体组合物的注射剂治疗隐性乳房炎和降低体细胞数的效果显著。 

实验例1 

抗牛乳房炎耐药菌IgY中的IgY含量检测 

应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，对按以上方法第4点所制取的抗牛乳房炎耐药菌IgY粗品进行检测，结果含IgY45～52%。将这种IgY粗品经二次过柱纯化后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示： 

表格5 

IgY纯品	纯IgY含量
		抗牛乳房炎耐药菌IgY纯品	99.99%

实验例2 

检测抗牛乳房炎耐药菌IgY对有代表性的四种抗原的抗体结合效价。具体是，分别采用耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药金黄色葡萄球菌、耐药大肠杆菌作为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药菌IgY的抗体效价。结果如下表 

表格6 

从以上检测结果可看出，所制备的抗牛乳房炎耐药菌IgY对作为抗原免疫的四种耐药致病菌都有很高的抗体结合效价。 

实验例3 

检测含抗牛乳房炎耐药菌Ig和复合噬菌体组合物的注射剂对有代表性的四种牛乳房炎耐药致病菌的抑菌和杀菌效果。 

（一）试验材料、设备 

(1)抑菌、杀菌实验材料：纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY注射剂，耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，营养琼脂，营养肉汤，5%羊血营养肉汤。 

(2)实验仪器、设备：培养箱，721分光光度计，生理盐水，吸管，天平等。 

（二）试验方法 

(1)抑菌（MIC）实验方法：取9支无菌试管，每支试管中加入1ml营养肉汤或1ml5%牛血清营养肉汤和1ml已调整好浓度的细菌液（耐药大肠杆菌OD600=0.3；耐药金黄色葡萄球菌OD600=0.2；耐药无乳链球菌OD600=0.2；耐药停乳链球菌OD600=0.2。然后第一支试管加入1mL含抗牛乳房炎耐药菌Ig和复合噬菌体组合物的注射剂悬浮液，待充分混匀后吸出1ml液体加入第二管，充分混匀后吸出1ml液体加入第三管……，依次倍比稀释，稀释比为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32……。第十管不加本悬浮液，作为阳性对照。将试 管放置培养箱，35℃培养过夜。第二天观察试管培养液澄清度，最高稀释度的澄清管为抑菌管，计算抑菌浓度（MIC）。 

(2)杀菌（MBC）实验方法：将上述培养过夜的试管中液体摇匀，从试管中取一接种环液体接种于血营养琼脂平板上作次代培养。将血营养琼脂平板放置培养箱，35℃培养过夜，第二天观察结果，杀菌（MBC）的培养皿无菌落生长。 

（三）结果 

(1)抑菌（MIC）观察：培养24小时后最高稀释度的澄清管为抑菌管，此管的稀释度为抑菌的稀释比。 

(2)杀菌（MBC）观察：血营养琼脂平板培养24小时后观察菌落，最高稀释度的无细菌生长的培养皿为杀菌稀释比。 

抑菌（MIC）表： 

表格7 

实验结果： 

(1)对耐药金黄色葡萄球菌，抑菌浓度为1/23328，杀菌浓度为1/160。 

(2)对耐药停乳链球菌，抑菌浓度为1/23328，杀菌浓度为1/160。 

(3)对耐药无乳链球菌，抑菌浓度为1/23328，杀菌浓度为1/160。 

(4)对耐药大肠杆菌，抑菌浓度为1/23328，杀菌浓度为1/160。 

结论：试验结果证实了IgY与噬菌体组合后，二者协同作用，组合物的 抑菌和杀菌能力都有很大提高。 

本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。 

Claims (9)

1.一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、筛选引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌作为病原体，所述耐药致病菌为耐药金黄色葡萄球菌、耐药停乳链球菌、耐药无乳链球菌以及耐药大肠杆菌中的一种或多种；

S2、将所述耐药致病菌粉碎处理后，加入福氏佐剂，再高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药致病菌复合抗原；

S3、采用所述耐药致病菌复合抗原对具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类进行免疫，再拣取所产的免疫蛋；

S4、对所述免疫蛋进行消毒，取蛋黄，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY；

S5、制备引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌的复合噬菌体，包括耐药致病菌为耐药金黄色葡萄球菌噬菌体、耐药停乳链球菌噬菌体、耐药无乳链球菌噬菌体以及耐药大肠杆菌噬菌体；

S6、将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体混合，制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY与复合噬菌体组合物。

2.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S5进一步包括：

1）分别取耐药金黄色葡萄球菌菌株、耐药无乳链球菌菌株、耐药停乳链球菌菌株、耐药大肠杆菌菌株各一批，加入无菌水制成四种菌悬液；

2）分别在三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的发酵罐中，加入预处理的污水溶液与耐药金黄色葡萄球菌、耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药大肠杆菌菌悬液中的其中一种菌悬液，37℃培养12～24 小时；

3）将以上四种混合培养液高速离心，将离心所得上清液进行真空过滤除菌，并将滤液在37℃培养过夜；

4）分别在肉膏蛋白胨琼脂平板上加入四种菌悬液中一种，将菌悬液涂布成均匀的薄层，待平板上的菌悬液干后得到平板菌层，分散滴加数滴滤液于平板菌层上面， 37℃ 培养过夜，分别得到无菌生长的耐药金黄色葡萄球菌噬菌斑、耐药无乳链球菌噬菌斑、耐药停乳链球菌噬菌斑和耐药大肠杆菌噬菌斑；

5）分别取步骤1）中四种菌悬液接种于液体培养基内，混合均匀；再取上层琼脂培养基，溶化并冷却, 分别加入步骤4）中对应的噬菌斑的噬菌体混匀；再注入底层培养基上混匀，置37℃ 培养后过滤除菌，即得到纯化的噬菌体；

6）分别将步骤3）制得的四种耐药菌的过夜培养液按照1﹕100加入到LB液体培养基中，振荡培养至菌液对数生长前期；以感染复数0.1～1加入对应的步骤5）中制得的四种噬菌体中一种，混合均匀并静置，随后振荡培养至宿主菌完全裂解，噬菌体裂解液离心取上清过滤除菌，制得四种噬菌体中之一种的扩充滤液；

7）将步骤6）制得的四种噬菌体扩充滤液按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，得到引复合噬菌体。

3.根据权利要求2所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤6）中将噬菌体裂解液8000 r/min离心10 min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体按照(1-10):(1-10)比例混合，置入搅拌机中充分混合均匀，制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY与复合噬菌体组合物。

5.一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物，其特征在于，采用权利要求1-4中任意一项所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法制得。

6.一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，其中包括根据权利要求1-4中任意一项所述方法制备的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物，还包括针剂辅料或乳膏辅料。

7.根据权利要求6所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，所述制剂为针剂，所述针剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。

8.根据权利要求6所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，所述制剂为乳房灌注剂，所述针剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。

9.根据权利要求6所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，所述制剂为乳膏，所述乳膏辅料包括油、钛白粉、以及微粉硅胶。