CN113082060B - 一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用鸡尾酒制剂制备与应用，采用奶牛乳房炎主要致病菌噬菌体组伍，并结合特定的制备方法，制备获得治疗性鸡尾酒制剂，本发明提供的一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，易于制备，疗程短见效快，对于临床型奶牛乳房炎及隐性乳房炎治疗效果均优于抗生素治疗及抗菌肽治疗，有望成为解决奶牛乳房炎治疗过程中细菌耐药性问题，从而减轻或摆脱奶牛乳腺炎等疾病的困扰，对于奶牛养殖领域具有潜在开发价值。

Description

一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂制备与应用
技术领域
本发明属于动物疫病防治技术领域，涉及微生物制剂制备的技术领域，具体涉及一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂及其制备与应用的技术领域。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛的常见多发病，在奶牛养殖中危害最大，是投入药费最多，防治最难的奶牛主要疾病之一，每年造成巨大的经济损失。目前控制奶牛乳房炎仍以传统的抗生素和抗菌药物法治疗为主。长期大量使用抗生素和抗菌药物致使细菌耐药性越来越强，我国奶牛乳房炎致病菌的耐药性和敏感药物情况分析结果表明：奶牛乳房炎病原菌对大部分传统药物如青霉素类、磺胺类、氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类药出现较高程度的耐药性；对喹诺酮和头孢菌素等较为敏感。同时，传统方法所带来的的药物残留则更为严重。由于细菌耐药性的出现，为了达到较好的治疗效果，临床兽医往往通过加大剂量的方法来实现。大剂量的药物直接被灌注乳头，势必造成奶产品的药物残留，严重影响了奶产品的质量。
针对这一现象，为了更好地解决临床问题，寻求奶牛乳房炎新的治疗方法已成为一个研究热点。噬菌体体积微小，结构简单，具有很强的生命力，广泛存在于周围环境中，凡有细菌生长繁殖的地方都可能有噬菌体的存在。噬菌体特异性强，只针对相应的致病菌，杀灭细菌具有一定的宿主专一性，不会破坏正常菌群，不会引起严重感染。噬菌体的繁殖能力很强，细菌不易对噬菌体产生抗性。同时，作为一种微生态制剂，噬菌体制剂不存在药物残留。作为一种抗菌微生态制剂，噬菌体再次受到关注。目前，噬菌体疗法在临床使用上仍未成熟，部分噬菌体在特定体外试验环境中有效，并不意味着在体内同样行之有效。也有研究表明部分噬菌体必须进入牛的乳腺，并且与生牛乳接触，才能更好地发挥作用，而体内治疗效果并不理想。并且病牛自身的免疫球蛋白对噬菌体有抑制作用。同时，金黄色葡萄球菌在脓肿的奶牛乳房中，会形成厚厚的生物被膜，从而抑制噬菌体的进入，这也可能导致其治疗效果不佳。噬菌体治疗的剂量和时间问题也是影响治疗效果的重要因素。噬菌体只有在细菌达到一定密度的时候才开始增殖，噬菌体接种过早或剂量不合适，可能会在开始增殖之前就被机体清除掉。所以，适当的是具体制剂结合确定最佳接种时间和剂量将成为噬菌体治疗的一大难点。因此，在噬菌体大规模应用于奶牛乳房炎治疗之前，还需进一步研究来阐明其有效性、安全性及给予方式等多方面问题。
发明内容
针对现有技术中存在现有的噬菌体制剂治疗奶牛乳房炎技术方案中混合噬菌体选择不佳，裂解谱较窄，且对于临床型乳房炎及隐性乳房炎治疗效果不理想的不足问题，为此，本发明利用筛选获得的多种裂解性噬菌体，制备治疗性鸡尾酒制剂，旨在有效治疗奶牛乳房炎的同时提高产品的附加值。本发明的目的在于提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，易于制备，疗程短见效快，对于临床型奶牛乳房炎及隐性乳房炎均具有较好的治疗效果，对于患病奶牛治疗情况优于相关抗菌肽治疗及抗生素治疗效果，有望成为解决奶牛乳房炎治疗过程中细菌耐药性问题，从而减轻或摆脱奶牛乳腺炎等疾病的困扰。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5。
优选的，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体按照1:1:1的体积比混合。
优选的，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2按照1:1:1:1:1:1的体积比混合。
优选的，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1按照1:1的体积比混合。
优选的，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5按照1:1的体积比混合。
进一步，本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：
(1)选取冷冻奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5复苏；
(2)将步骤(1)中复苏获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；
(3)将步骤(2)中制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂。
本发明提供经过上述制备工艺获得的一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂在治疗奶牛乳房炎中的应用。
所述的，一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂在治疗奶牛乳房炎中的应用中，使用方式为灌注使用，通过乳头导管直接注入乳池。
所述的，一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂在治疗奶牛乳房炎中的应用中，施用量为30ml，每日2-3次。
本发明中，采用奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5，10株噬菌体均为公知噬菌体，本技术领域常规技术人员能够通过公众渠道获得，上述10种噬菌体的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明利用奶牛乳房炎主要致病菌噬菌体组伍，并结合特定的制备方法，制备获得治疗性鸡尾酒制剂，旨在预防治疗的同时提高产品的附加值，本发明提供的一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，易于制备，疗程短见效快，对于临床型奶牛乳房炎及隐性乳房炎均具有较好的治疗效果，有望成为解决奶牛乳房炎治疗过程中细菌耐药性问题，从而减轻或摆脱奶牛乳腺炎等疾病的困扰。
(2)本发明提供的技术方案制备获得的鸡尾酒制剂应用于奶牛临床型乳房炎治疗，治疗后患病牛乳样中SCC测定结果显著下降，患牛治愈率高于抗生素治疗组8.34％，乳区治愈率高于抗生素治疗组3.57％；本发明提供的技术方案制备获得的鸡尾酒制剂应用于奶牛隐性乳房炎治疗，患牛治愈率高于抗菌肽治疗组8.33％，与抗生素治疗组效果相同，乳区治愈率高于抗菌肽治疗组7.5％，高于抗生素治疗组1.79％。本发明制备的一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂对于奶牛养殖领域具有潜在开发价值。
附图说明
图1所示为奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂对于临床型治疗效果图。
图2所示为奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂对于隐性治疗效果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中采用的试剂有：PEG8000购于天津市光复精细化工研究所。SM缓冲液∶NaCl 5.8g，MgSO47H2O 2.0g，1mol/L Tris-HCl(pH值为7.5)50mL，2％明胶5mL，加蒸馏水定容至1L，然后1×10Pa灭菌20min，4℃保存；PBS缓冲液∶NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g，加蒸馏水定容至1L，调节pH为7.4，然后1×10Pa灭菌20min，4℃保存。
本发明中采用的仪器设备有：DNP-9082电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；MIKRO 120高速台式离心机，德国HETTICH制造公司；Multifuge X1R台式冷冻离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；HVE-50高压灭菌器，日本HIRAYAMA公司；ZHWY-2102双层恒温摇床，上海智城公司；YHC-260医用药品保存箱，上海天呈医流科技股份有限公司等。
所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5。
所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体按照1:1:1的体积比混合。
所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2按照1:1:1:1:1:1的体积比混合。
所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1按照1:1的体积比混合。
所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5按照1:1的体积比混合。
实施例二：一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂的制备方法
本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：
(1)选取冷冻奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5复苏；
(2)将步骤(1)中复苏获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；
(3)将步骤(2)中制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂。
实施例三：一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：
(1)选取冷冻奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1复苏；
(2)将步骤(1)中纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；
(3)将步骤(2)中制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂。
实施例四：一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：
(1)选取冷冻奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5复苏；
(2)将步骤(1)中纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；
(3)将步骤(2)中制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂。
实施例五：一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：
(1)选取冷冻牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_Sau S_IMEP5复苏；
(2)将步骤(1)中纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；
(3)将步骤(2)中制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂。
实施例六：不同噬菌体混合比例效果测定
基于上述实施例二至实施例五将制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，将各组噬菌体制剂用PBS稀释后，加入到奶牛乳房炎主要致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌)悬液中混匀，采用双层琼脂法观察噬菌斑的生长情况，各组实验设计如表1所示：
表1：试验设计
分组 培养物
对照组 奶牛乳房炎主要致病菌悬液
试验1组 实施例三中制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
试验2组 实施例四中制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
试验3组 实施例五中制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
试验4组 实施例二中制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂
根据上述表1中的试验设计，对各组噬菌斑的生长情况进行观察，对照组未出现噬菌斑，试验4组中出现噬菌斑数量最多，试验1组、试验2组、试验3组出现噬菌斑数量低于试验4组，各组之间噬菌斑数量差异不大。因此，可见对于奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂制备中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体和奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体的组合具有最佳的奶牛乳房炎主要致病菌裂解效果。
实施例七：奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂治疗效果测定
基于上述实施六中的筛选结果，对于制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂治疗效果进行测定。
(1)实验分组情况
1、采用上述具有最佳体外裂解效果的实施例二中提供的技术方案制备获得的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂进行奶牛乳房炎患病牛乳房灌注作为噬菌体治疗组，噬菌体的浓度为1×109-8pfu/ml，通过乳头导管直接注入乳池，施用量为30ml，每日2-3次，连用1-2周。
2、采用市售的抗菌肽产品进行奶牛乳房炎患病牛乳房灌注作为抗菌肽治疗组，通过乳头导管直接注入乳池，施用量为30ml，每日2-3次，连用1-2周。
3、采用抗生素(青霉素钠和硫酸链霉素)进行常规治疗的为抗生素治疗对照组。
(2)治疗效果测定
选择典型临床乳房炎和隐性乳房炎病例，采用乳房灌注法将裂解性噬菌体或裂解酶基因表达产物注入乳房，每天两次，连用1-2周；同时选用临床常规药物治疗组作为对照。选用美国加州乳房炎测试试验(CMT)对受试奶牛的隐性乳房炎发病情况及乳样中SCC水平进行测定统计，主要判定指标为试验前后试验组牛和对照组牛隐性乳房炎的发病率情况的变化以及各个时间段阴性乳房炎的头检出数和乳区检出数变化。测定结果如表2所示。
表2：不同方案治疗奶牛乳房炎效果测定
本发明提供的技术方案制备获得的鸡尾酒制剂应用于奶牛临床型乳房炎治疗，治疗后患病牛乳样中SCC测定结果显著下降，具体测定结果参见附图1及附图2。通过上述表2中测定结果所示，本发明提供的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂治疗效果优于抗菌肽治疗组及抗生素治疗对照组。通过使用6株奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、2株奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体和2株奶牛乳房炎源链球菌噬菌体制备的鸡尾酒制剂，采用乳头灌注法分别治疗由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌引起的奶牛乳房炎。噬菌体治疗临床型乳房炎的患牛治愈率为66.67％(8/12)，临床型乳房炎乳区治愈率为75.00％(15/20)；治疗隐性乳房炎的患牛治愈率为83.33％(10/12)，乳区治愈率为87.50％(14/16)；未治愈的7个乳区，5个来自患临床型奶牛乳房炎奶牛的乳区，2个来自患隐性乳房炎奶牛的乳区。对照组采用抗生素(青霉素钠和硫酸链霉素)治疗，抗生素治疗临床型奶牛乳房炎，患牛治愈率为58.33％(7/12)，乳区治愈率为71.43％(15/21)；治疗隐性奶牛乳房炎，患牛治愈率为83.33％(10/12)，乳区治愈率为85.71％(18/21)。统计分析两种疗法对临床型奶牛乳房炎患牛治愈率发现差异显著(P＝0.033，P<0.05)；对隐性乳房炎患牛治愈率发现差异不显著(P＝0.087，P>0.05)。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂，其特征在于，所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂由奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2；奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1；奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5组成；所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体按照1:1:1的体积比混合；其中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2按照1:1:1:1:1:1的体积比混合，奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1按照1:1的体积比混合，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5按照1:1的体积比混合；
所述的奶牛乳房炎治疗用噬菌鸡尾酒制剂，采用如下步骤制备获得：
(1)选取冷冻奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5复苏；
(2)将步骤(1)中纯化复苏获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；
(3)将步骤(2)中制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎治疗用噬菌体鸡尾酒制剂；
施用量为30ml，每日2-3次。
2.如权利要求1所述的一种用于制备在治疗奶牛乳房炎采用噬菌体鸡尾酒制剂药物中的应用。
3.如权利要求1所述的一种用于制备在治疗奶牛乳房炎采用噬菌体鸡尾酒制剂药物中的应用，其特征在于，使用方式为灌注使用。
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