CN113207913A - 一种奶牛乳房炎生物消毒剂制备与应用 - Google Patents

一种奶牛乳房炎生物消毒剂制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体提供的一种奶牛乳房炎生物消毒剂，利用奶牛乳房炎主要致病菌噬菌体组伍，制备获得噬菌体消毒剂，本发明提供的奶牛乳房炎生物消毒剂易于制备，疗程短见效快，对于乳房炎患病区的环境消毒具有显著的消毒效果，喷施30min后，环境中大肠杆菌、金黄色葡萄酒球菌、链球菌的数量急剧下降，试验组测定数菌落总数均小于10cfu/mL，杀灭对数值均大于等于5.00KL，对于奶牛养殖领域绿色、环保消毒剂的开发具有潜在开发价值。

Description

一种奶牛乳房炎生物消毒剂制备与应用
技术领域
本发明属于环境消毒技术领域，涉及微生物制剂制备的技术领域，具体涉及一种奶牛乳房炎生物消毒剂及其制备与应用的技术领域。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛的常见多发病，在奶牛养殖中危害最大，是投入药费最多，防治最难的奶牛主要疾病之一，每年造成巨大的经济损失。而环境问题也是造成奶牛乳房炎的重要原因之一。针对这一现象，为了更好地解决临床问题，研制新型无害的消毒剂成为目前研究的重点。噬菌体体积微小，结构简单，具有很强的生命力，广泛存在于周围环境中，凡有细菌生长繁殖的地方都可能有噬菌体的存在。噬菌体特异性强，只针对相应的致病菌，杀灭细菌具有一定的宿主专一性，不会破坏正常菌群，不会引起严重感染。噬菌体的繁殖能力很强，细菌不易对噬菌体产生抗性。同时，噬菌体制剂不存在药物残留。作为一种新型消毒剂，噬菌体再次受到关注。
现有技术中，申请号为201711322276.1的发明专利中披露了一株可裂解牛源无乳链球菌的链球菌噬菌体，vB_SagS_FSN1，及其在在防治无乳链球菌引起的奶牛乳房炎中的可行性，但其作用缓慢，作用5h才能够达到无乳链球菌的数量下降到10CFU以下的效果；申请号为202010169216.6的发明专利中披露噬菌体组合物是由两株葡萄球菌噬菌体vB-SauM-PB67和vB-SauM-PB93复配形成，可用于防治由牛源葡萄球菌感染导致的疾病，使用噬菌体组合物消毒液喷洒3h后，垫料表面的葡萄球菌的数量降到50CFU/1g垫料以下；申请号为202010141247.0的发明专利披露了有效成分包括大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227，及相关辅料制备的消毒剂，但其在实验室环境下作用4h仍能检测到部分致病菌的残留。
发明内容
针对现有技术中存在现有的噬菌体制剂用于奶牛乳房炎患病圈舍消毒作用时间长，作用效果不佳的技术问题问题，为此，本发明利用筛选获得的多种裂解性噬菌体，制备噬菌体消毒剂，旨在有效杀灭发病圈舍中主要致病菌。本发明的目的在于提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂，易于制备，作用时间短见效快，对于乳房炎发病圈舍均具有较好的消毒效果，有望成为解决奶牛乳房炎治疗过程中环境消毒导致的细菌耐药性问题。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明具体提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体，所述的大肠杆菌噬菌体为Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2，链球菌噬菌体为vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1，金黄色葡萄球菌噬菌体为P42、vB_SauS_IMEP5。
优选的，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2按照1:1:1:1:1:1的体积比混合。
优选的，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1按照1:1的体积比混合。
优选的，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5按照1:1的体积比混合。
优选的，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，混合噬菌体效价不低于1×109pfu/ml。
本发明提供经过上述制备工艺获得的一种奶牛乳房炎生物消毒剂在治疗奶牛乳房炎中的应用。
所述的，一种奶牛乳房炎生物消毒剂在治疗奶牛乳房炎中的应用中，使用方式为1:50稀释，150ml/m2的喷洒量进行喷施。
本发明中，采用奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5，10株噬菌体均为公知的噬菌体，普通技术人员可以通过公众渠道获得，上述10种噬菌体的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明利用奶牛乳房炎主要致病菌噬菌体组伍，并结合特定的制备方法，制备获得噬菌体消毒剂，旨在预防治疗的同时提高产品的附加值，本发明提供的一种奶牛乳房炎生物消毒剂，易于制备，疗程短见效快，对于乳房炎患病区的环境消毒具有显著的消毒效果。
(2)本发明提供的技术方案制备获得的消毒剂应用于奶牛乳房炎环境消毒，消毒效果显著，喷施30min后，环境中大肠杆菌、金黄色葡萄酒球菌、链球菌的数量急剧下降，试验组测定数菌落总数均小于10cfu/mL，杀灭对数值均大于等于5.00KL，对于奶牛养殖领域绿色、环保消毒剂的开发具有潜在开发价值。
附图说明
无
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中采用的试剂有：PEG8000购于天津市光复精细化工研究所。SM缓冲液∶NaCl 5.8g，MgSO47H2O 2.0g，1mol/L Tris-HCl(pH值为7.5)50mL，2％明胶5mL，加蒸馏水定容至1L，然后1×10Pa灭菌20min，4℃保存；PBS缓冲液∶NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g，加蒸馏水定容至1L，调节pH为7.4，然后1×10Pa灭菌20min，4℃保存。
液体LB培养基(g/L)∶NaCl 10.0，酵母浸粉5.0，胰蛋白胨10.0，加蒸馏水定容至1L。调节pH为7.2-7.4，然后1×10Pa灭菌20min，4℃保存。半固体LB培养基是在液体LB培养基基础上加入0.7％(质量体积比)的琼脂。固体LB培养基是在液体LB培养基基础上加入1.5％(质量体积比)的琼脂。
本发明中采用的仪器设备有：DNP-9082电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；MIKRO 120高速台式离心机，德国HETTICH制造公司；Multifuge X1R台式冷冻离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；HVE-50高压灭菌器，日本HIRAYAMA公司；ZHWY-2102双层恒温摇床，上海智城公司；YHC-260医用药品保存箱，上海天呈医流科技股份有限公司等。
所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：一种奶牛乳房炎生物消毒剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体，所述的大肠杆菌噬菌体为Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2，链球菌噬菌体为vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1，金黄色葡萄球菌噬菌体为P42、vB_SauS_IMEP5。
所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2按照1:1:1:1:1:1的体积比混合。
所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1按照1:1的体积比混合。
所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5按照1:1的体积比混合。
实施例二：一种奶牛乳房炎生物消毒剂的制备方法
本发明具体提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂的制备方法，具体的，奶牛乳房炎生物消毒剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5；将纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；将制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎生物消毒剂。
实施例三：一种奶牛乳房炎生物消毒剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂的制备方法，具体的，奶牛乳房炎生物消毒剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1；将纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；将制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎生物消毒剂。
实施例四：一种奶牛乳房炎生物消毒剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂的制备方法，具体的，奶牛乳房炎生物消毒剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5；将纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；将制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎生物消毒剂。
实施例五：一种奶牛乳房炎生物消毒剂
本发明具体提供一种奶牛乳房炎生物消毒剂的制备方法，具体的，奶牛乳房炎生物消毒剂包奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5；将纯化筛选获得的各株噬菌体原液取100μL，接种于5mL对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、180r/min振荡培养至澄清，10000r/min离心10min，取上清，稀释至浓度为1×109pfu/ml；将制备获得的各株噬菌体稀释液按照比例混合，即制得奶牛乳房炎生物消毒剂。
实施例六：不同噬菌体混合比例效果测定
基于上述实施例二至实施例五将制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂，将各组噬菌体制剂用无菌水1:50稀释后，加入到奶牛乳房炎主要致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌)悬液中混匀，采用双层琼脂法观察噬菌斑的生长情况，各组实验设计如表1所示：
表1：试验设计
分组 培养物
对照组 奶牛乳房炎主要致病菌悬液
试验1组 实施例三中制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂
试验2组 实施例四中制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂
试验3组 实施例五中制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂
试验4组 实施例二中制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂
根据上述表1中的试验设计，对各组噬菌斑的生长情况进行观察，对照组未出现噬菌斑，试验4组中出现噬菌斑数量最多，试验1组、试验2组、试验3组出现噬菌斑数量低于试验4组，各组之间噬菌斑数量差异不大。因此，可见对于奶牛乳房炎生物消毒剂制备中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体和奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体的组合具有最佳的奶牛乳房炎主要致病菌裂解效果。
实施例七：奶牛乳房炎生物消毒剂消毒效果测定
基于上述实施六中的筛选结果，对于制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂在患病牛舍消毒效果进行测定。
(1)实验分组情况
采用上述具有最佳体外裂解效果的实施例二中提供的技术方案制备获得的奶牛乳房炎生物消毒剂按照1:50的比例使用无菌水进行稀释，150ml/m2的喷洒量进行喷施，30min后进行奶牛乳房炎患病圈舍消毒效果测定，测定时对牛舍地面、空气、粉尘进行采样，设置不做任何消毒处理的对照组，并测定不同来源样品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的杀灭情况。
(2)消毒测定结果
针对不同样品来源对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌类型，对照组菌落总数、对照组平均菌落总数、实验组菌落总数、杀灭对数值指标进行测定，测定结果如表2所示：
表2：不同致病菌杀灭效果测定结果
Figure BDA0003050307610000091
Figure BDA0003050307610000101
本发明提供的技术方案制备获得的生物消毒剂应用于奶牛乳房炎环境杀毒，喷施后患病牛中主要致病菌数量测定结果显著下降，。通过使用6株奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、2株奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体和2株奶牛乳房炎源链球菌噬菌体消毒剂根据GB14930.2-2012《食品安全国家标准消毒剂》和WS628-2018《消毒产品卫生安全评价技术要求》以50倍稀释后进行试验。作用30min即可符合标准里对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌杀灭要求。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种奶牛乳房炎生物消毒剂，其特征在于，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂包含奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体、奶牛乳房炎源链球菌噬菌体、奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体，所述的大肠杆菌噬菌体为Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2，链球菌噬菌体为vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1，金黄色葡萄球菌噬菌体为P42、vB_SauS_IMEP5。
2.如权利要求1所述的一种奶牛乳房炎生物消毒剂，其特征在于，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体Ecp1、Ecp3、Ecp5、Ecp16、Ecp17、vB_EcoM_XJ2按照1:1:1:1:1:1的体积比混合。
3.如权利要求1所述的一种奶牛乳房炎生物消毒剂，其特征在于，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源链球菌噬菌体vB_StrM_L1、vB_SagS_FSN1按照1:1的体积比混合。
4.如权利要求1所述的一种奶牛乳房炎生物消毒剂，其特征在于，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P42、vB_SauS_IMEP5按照1:1的体积比混合。
5.如权利要求1所述的一种奶牛乳房炎生物消毒剂，其特征在于，所述的奶牛乳房炎生物消毒剂中，混和噬菌体效价不低于1×109pfu/ml。
6.如权利要求1-5任意一项所述制备获得的一种奶牛乳房炎生物消毒剂在乳房炎发病牛舍消毒中的应用。
7.如权利要求6所述制备获得的一种奶牛乳房炎生物消毒剂在乳房炎发病牛舍消毒中的应用，其特征在于，使用方式为喷施。
8.如权利要求6所述制备获得的一种奶牛乳房炎生物消毒剂在乳房炎发病牛舍消毒中的应用，其特征在于，使用方式为1:50稀释，150ml/m2的喷洒量进行喷施。
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