KR101080070B1

KR101080070B1 - 브루셀라균 선택 배양용 배지

Info

Publication number: KR101080070B1
Application number: KR1020080125050A
Authority: KR
Inventors: 허문; 조동희; 조윤상; 황인영; 정석찬; 강성일
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2011-11-08
Also published as: KR20100066652A

Abstract

본 발명은 브루셀라균 선택 배양용 배지에 관한 것으로, 보다 자세하게는 탄소원(carbon source)으로서 에리스리톨(erythritol)을 포함하고, 여기에 추가로 브루셀라 증식 식별자로서 뉴트럴 레드(neutral red)를 포함하는 브루셀라균 선택 배양용 배지 및 이 배지를 이용하여 브루셀라균을 선택적으로 배양하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 브루셀라균 선택 배양용 배지는 단시간에 브루셀라균을 선택적으로 배양, 분리할 수 있어 질병의 검색 및 진단, 전염경로 분석 및 역학적 연구 등에 유용하게 활용할 수 있다.

브루셀라균, 항생제 혼합물, 에리스리톨, 뉴트럴 레드

Description

브루셀라균 선택 배양용 배지 {Medium for Selective Culture of Brucella}

브루셀라병은 가축뿐만 아니라 사람에게도 감염되는 인수공통전염병으로 소를 비롯한 다양한 숙주동물을 갖고 있으며, 전 세계적으로 발생하고 있는 질병이다. 이 질병은 소에서 잠복기간이 3주 내지 3개월로 오염된 사료, 물 등을 통한 경구감염, 태반을 통한 감염, 유두나 창상부위를 통하여도 감염될 수 있다. 체내에 침입하면 인접 임파절에 이르러 탐식세포 내에서 증식, 생존한다. 임신된 소에서는 임신 후반기에 전구증상 없이 유조산을 일으켜 양축농가에 막대한 경제적 손실을 초래하는 질병으로 사람에게도 감염될 수 있다.

브루셀라균은 토양이나 식물에 서식하는 세균과의 동종으로 환경에서 생존력 이 매우 강하다. 차가운 토양이나 퇴비 등 일반 축사환경내에서 3-8개월정도 생존할 수 있고 감염경로가 매우 다양하며 일단 동물 체내로 침투하면 세포내 기생세균으로 일반적인 항생제 치료가 매우 어렵다. 따라서 주요 인수공통전염병인 브루셀라병을 근절하기 위해서 질병을 검색하여 감염된 개체는 살처분하는 것이 주요한 방역정책으로 활용하고 있다.

브루셀라균은 숙주의 특이성 등 생물학적 성상에 따라 B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B. ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats) 6종으로 분류되고 있으며 최근 해양포유동물에서도 B. pinnipediae (common seal), B. cetaceae (common dolphin) 2종이 추가로 확인되었다.

브루셀라균은 보통 합성배지에서 증식이 느려 3일 정도의 배양시간이 소요되기 때문에 오염되거나 부패된 시료에서는 브루셀라균에 비해 일반 세균 등이 빠르게 증식함으로써 브루셀라균의 분리에 많은 어려움이 있다. 따라서 이러한 일반세균이나 곰팡이 등의 증식을 최대한 억제하면서도 브루셀라균의 증식을 억제하지 않는 선택배지가 필수적이다. 현재 브루셀라 선택배지로 널리 사용되고 있는 배지는 Farrell 배지로 영국 Oxoid사에서 상품화하여 판매되고 있으나 브루셀라 균 종류에 따라 배양 증식하기가 힘들고 균 집락의 구분이 어려워 한계점이 있다.

본 발명은 브루셀라균의 증식을 선택적으로 촉진하고 배양된 균을 보다 쉽고 빠르게 감별할 수 있는 배지를 제공하는 것이다.

본 발명은 탄소원(carbon source)으로서 '에리스리톨(erythritol)'을 포함하는 브루셀라균 선택 배양용 배지에 관한 것이다. 상기 에리스리톨은 배지의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1.0 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 0.1 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 브루셀라균 선택 배양용 배지는 추가로 뉴트럴 레드(neutral red)를 포함하는 것이 바람직하다. 브루셀라균 증식시 분홍색의 집락을 형성하여 브루셀라균을 용이하게 식별할 수 있기 때문이다(도 1).

본 발명의 브루셀라균 선택 배양용 배지는 '기본 배지'로서 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar) 또는 브로스(broth)(TS)를 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 트립틱 소이 아가 및 브로스는 탄소원으로서 덱스트로스를 함유하고 있으나, 본 발명에서는 상기 덱스트로스 대신에 에리스리톨(erythritol)을 이용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에서 기본 배지는 덱스트로스가 배제된(포함되지 않은) 트립틱 소이 아가 또는 브로스인 것이 바람직하다.

본 발명의 브루셀라균 선택 배양용 배지는 추가로 (1) 그람 양성균에 대한 항균제로서 바시트라신(bacitracin)과 반코마이신(vancomycin) 중 적어도 하나, (2) 그람 음성균에 대한 항균제로서 아조트레남(azotrenam)과 날리딕스 산(nalidixic acid) 중 적어도 하나 및 (3) 항진균제로서 암포테리신 B(amphotericine B)와 나이스타틴(nystatin) 중 적어도 하나를 함유하는 항생제 조성물을 포함할 수 있다.

그람 양성균(Gram positive bacteria)에 대한 항균제(antibacterial agent)로서, 상기 바시트라신은 1.5 내지 800 unit/ml의 농도로, 바람직하게는 1.5 내지 50 unit/ml의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 반코마이신은 1.2 내지 640 ㎍/ml의 농도로, 바람직하게는 1.2 내지 40 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다.

그람 음성균((Gram negative bacteria)에 대한 항생제(antibacterial agent)로서, 상기 아조트레남은 0.3 내지 20 ㎍/ml의 농도로, 바람직하게는 0.3 내지 10 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 날리딕스산은 0.3 내지 40 ㎍/ml의 농도로, 바람직하게는 0.3 내지 20 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다.

항진균제(antifungal agent)로서, 상기 암포테리신 B는 0.15 내지 80 ㎍/ml의 농도로, 바람직하게는 0.15 내지 10 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 나이스타틴은 6 내지 3,200 unit/ml의 농도로, 바람직하게는 6 내지 400 unit/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 전술된 브루셀라균 선택 배양용 배지에 시료를 접종하고 배양하여 브루셀라균을 선택적으로 배양하는 방법에 관한 것이다.

상기 시료는 브루셀라균의 유무를 확인하고자 하는 시료이며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 브루셀라병에 걸린 동물의 조직(간, 비장 등 실질 장기 및 임파절 등), 상기 동물의 분비물(우유, 타액, 질점액 등) 또는 축사환경시료(물, 사료, 축사바닥, 깔짚, 건초, 먼지 등) 일 수 있다.

특히, 본 발명의 브루셀라균 선택 배양용 배지는 브루셀라병을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

중요한 인수공통전염병인 브루셀라병의 원인체인 브루셀라균을 본 선택배지를 이용하여 쉽게 분리할 수 있어 질병의 검색 및 진단, 전염경로 분석 및 역학적 연구 등에 유용하게 활용할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 항생제 감수성 검사

브루셀라 선택배지에 이용되는 각 종 항생물질에 대한 항생제 감수성 검사를 통하여 브루셀라의 증식을 방해하지 않는 항생물질을 선정하였다. 브루셀라 균에 대한 정확한 감수성 여부를 판단하기 위해서 CLSI(Clinical and laboratory Standards Institute)에서 권장하는 액체배지희석방법(Broth dilution method)으로 각 항생제에 대한 최대항생제억제농도(maximum inhibitory concentrations)를 측정하였다(표 1).

측정된 결과에 따라 그람 양성균의 억제를 위해 바시트라신 (25U/ml)과 반코마이신 (20㎍/ml)을 첨가하고, 그람 음성균의 증식을 억제하기 위해 날리딕산 (5㎍/ml)과 아조트레남 (5㎍/ml)을 첨가하고, 항진균제로 암포테리신 B (2.5㎍/ml)와 나이스타틴 (100U/ml)을 항생물질 혼합액으로 첨가하였다. 이들 항생물질 혼합액 에 대해 국내 B. abortus 분리균주 71주에 대하여 감수성 검사를 한 결과 선택 배지에 첨가될 농도의 4배 이상의 농도에서 브루셀라균의 증식을 부분 억제하는 것으로 관찰되어 상기 농도로 첨가하여도 균 증식 에는 거의 영향이 없는 것으로 확인되었다.

<실시예 2> 에리스리톨 농도에 따른 브루셀라균 증식성 조사

브루셀라균 배양을 위해 사용되고 있는 TS 또는 덱스트로스가 함유된 TSg 기초배지 에 5% 소혈청(bovine serum)과 상기 항생물질 혼합액을 첨가하고 에리스리톨(erythritol) 농도에 따른 균 증 식성을 확인하였다. TS 배지나 TSg 배지에서의 균 증식성의 차이는 인정되지 않았으며, 항생물질 혼합액의 첨가에 따라 균의 증식성이 다소 억제되는 것으로 확인되었다. 하지만 TS 배지에 0.01~1.0% 범위의 에리스 리톨 농도를 첨가하여 균 증식이 촉진되는지 여부를 관찰하였다. 항생물질 혼합액이 함유된 TS 배지에 에리 스리톨을 첨가하여 7일 동안 배양했을 경우 항생물질만 함유된 배지에 비해 균의 증식이 촉진되었다. 가장 적합한 에리스리톨 농도는 0.05~0.1%였으며 그 이상의 농도로 증가할수록 오히려 균 증식에 영향을 주었다. 따라서 다른 세균과의 감별을 위해 에너지원으로 덱스트로스를 대신하여 0.1% 에리스리톨을 첨가한다. 에리스리톨을 에너지원으로 활용하는 브루셀라균은 에리스리톨을 가수분해함으로써 산성의 대사산물을 만든다. 이 를 확인하기 위해 배지에 pH indicator로 뉴트럴 레드(neutral red)를 첨가하여 브루셀라균 증식시 분홍색의 집락을 형성하도록 유도하여 균 감별에 활용하였다. 결론적으로 적정한 농도의 에리스리톨을 첨가함으로써 항생물질 혼합액에 의해 다소 억제된 브루셀라균의 증식을 촉진시키고 이를 분해하면서 생성된 대사산물을 이용하여 브루셀라균의 감별에 활용하였다.

<실시예 3> 브루셀라균 종류(species)에 따른 선 택배지의 증식률 조사

선택 배지에서 브루셀라균 종류별 증식율을 확인하기 위해 균 배양액을 식 염수에 10진 희석하여 각각 100㎕씩 분주하여 균수를 측정하였다. B. abortus biovar 1~6, 9 표준균 주와 B. abortus 2308 및 백신균주 B. abortus RB51이 포함되었으며 B. melitensis b iovar 3, B. suis biovar 1, B. canis, B. ovis 표준균주에 대하여 증식률을 조사하였 다.

B. abortus 표준균주 및 백신균주는 항생물질 혼합액이 첨가되지 않은 TSg 배지를 기준으 로 0.05~0.1% 에리스리톨이 첨가된 선택 배지에서 80% 이상의 증식률을 보였다. 다만 B. abortus b iovar 2는 0.1% 에리스리톨 함유 배지에서 67%의 증식률을 보여 약간 억제되는 경향이 있었으며, 에리스리톨 농도에 따라 증식률에 민감한 반응을 보였다. 기존에 가장 많이 사용되고 있는 Farrell 배지도 역시 증식률 은 모두 양호하였으나, B. abortus biovar 1과 biovar 3에서 각각 73%, 68%로 약간 증식률이 감소하 였다. 한편 B. abortus RB51 백신균주는 Farrell 배지에서 전혀 증식이 되지 않아 본 발명의 선택배지와 뚜렷한 차이를 보였다(표 2).

B. melitensis, B. suis, B. canis 표준균주에 대한 0.05~0.1% 에리스리톨이 첨가된 선택 배지의 증식률은 58~82%로, Farrell 배지의 증식률 79~98%와 비교하여 증식률이 약간 감소함을 알 수 있었다. 하지만 이런 정도의 증식률 차이는 야외에서 브루셀라균 분리에는 큰 영향을 미치지는 않는 다. 하지만 본 발명의 선택 배지에서 B. ovis의 증식이 되지 않았지만, Farrell 배지에서는 증식이 매우 느려 배양 7일 이후에 아주 작은 집락을 관찰할 수 있다(표 3).

도 1은 본 발명의 선택 배양용 배지에서 배양된 Brucella abortus 집락(colony)을 나타낸 것으로서, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 5일간 배양된 균 집락으로 중심부가 분홍색으로 다소 투명하고 윤택한 빛깔로 관찰된다.

도 2는 에리스리톨 농도에 따른 B. abortus strain 544(3 CFU/ml)의 증식성을 나타낸 것으로서, 항생물질 혼합액이 첨가된 TS 배지의 증식성을 기준으로 0.01~1.0% 농도의 에리스리톨이 첨가된 배지에서 균 증식이 촉진되는 것을 확인하였다(*: P < 0.05, #: P < 0.01)(TSg: tryptic soy broth with dextrose, TS: tryptic soy broth w/o dextrose, TSgA 및 TSA: 항생물질 혼합액 함유 TSg 및 TS, 0.01 T SA: 0.01% 에리스리톨 함유 TSA).

Claims

덱스트로스가 배제된 트립틱 소이 아가 (tryptic soy agar)를 기본배지로 하며, 0.01내지 1.0 중량%의 에리스리톨 (erythritol)을 탄소원으로 함유하며,

(1) 그람 양성균에 대한 항균제로서 1.5 내지 800 unit/ml의 바시트라신(bacitracin)과 1.2 내지 640 ㎍/ml의 반코마이신(vancomycin) 중 적어도 하나,

(2) 그람 음성균에 대한 항균제로서 0.3 내지 20 ㎍/ml의 아조트레남(azotrenam)과 0.3 내지 40 ㎍/ml의 날리딕스산(nalidixic acid) 중 적어도 하나 및

(3) 항진균제로서 0.15 내지 80 ㎍/ml의 암포테리신 B(amphotericine B)와 6 내지 3,200 unit/ml의 나이스타틴(nystatin) 중 적어도 하나를 함유하는 항생제 조성물을 포함하는 브루셀라균 선택 배양용 배지.
삭제
제 1항에 있어서,

뉴트럴 레드(neutral red)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 브루셀라균 선택 배양용 배지.
삭제
삭제
삭제
제1항에 따른 배지에 시료를 접종하고 배양하여 브루셀라균을 선택적으로 배양하는 방법
제 7항에 있어서,

상기 시료는 브루셀라병에 걸린 동물의 조직, 상기 동물의 분비물 또는 축사환경 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항의 방법으로 배양하여 인간을 제외한 동물의 브루셀라병을 진단하는 방법