CN113122453A - 一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基及其制备方法 - Google Patents
一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基及其制备方法。具体由琼脂、胰蛋白月示、氯化钠、无水亚硫酸钠、酵母提取物、牛肝浸粉、D‑葡萄糖、赤藓糖醇、枸橼酸钠、特级马血清、杆菌肽、放线菌酮及蒸馏水或双蒸水组分构成。该培养基是一种能够对布鲁氏菌进行培养的固体培养基，营养加均衡；所添加的组分即满足了布鲁氏菌的代谢需求的碳源、氮源等，又抑制污染样品中其他细菌的生长，提高污染样品中布鲁氏菌的检出率；各组分之间相辅相成，达到协同增效的作用；本发明提供的培养基能够满足自喜马拉雅旱獭组织中分离布鲁氏菌的生长繁殖需求，具有质量稳定、制备简便和培养菌数高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基及其制备方法。
背景技术
布鲁氏菌病(简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患性疾病，世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)均将其列为法定报告传染病之一，我国将其列为乙类传染病。布鲁氏菌是一种细胞内寄生的需氧型革兰氏阴性菌，多寄生于网状内皮系统，可在人和动物体内存活，它的繁殖生长对营养要求较高，且生长缓慢，在37℃、pH6.6～7.4环境生长最佳。青海省布鲁氏菌病病原分为三个种共六个生物型，以羊种布鲁氏菌为主，在菌种与宿主中存在有转移的现象，菌株也有变异发生。
喜马拉雅旱獭是青藏高原特有的野生动物，主要栖息在高原高山草原、高寒草甸、灌丛草甸和高寒草原的食草类哺乳动物，生活习性是每年4月底出蜇、10月底入蜇冬眠。近几年，国内及国内西北地区对旱獭及喜玛拉雅旱獭进行血清样品调查后，未分离出布鲁氏菌。但是，青南地区对245份喜马拉雅旱獭全血样品，抗体阳性13份，分离到 1株疑似布鲁氏菌。可以推断喜马拉雅旱獭可以感染布病，但未能从旱獭体内分离出布鲁氏菌。
现有分离、培养布鲁氏菌的培养基方案中，经常使用布鲁氏琼脂培养基用于培养布鲁氏菌，达到使用要求。但是，这种培养基适用于无污染的样品，对已污染和组织样品而言分离纯化布鲁氏菌较困难和费时，因此，寻找一种从已污染和组织样品中分离、纯化布鲁氏菌的适宜、高效的培养基，对传统培养基和方法进行改进，是急需解决的问题。本申请人首先从喜马拉雅旱獭组织样品中分离布鲁氏菌，现有的技术无法实现在喜马拉雅旱獭中检测出布病抗体阳性的同时分离出布鲁氏菌，另外，在进行从喜马拉雅旱獭组织样品中分离布鲁氏菌的实际操作中，由于样品多有污染，其中混有其他各种病原性微生物，因此需要选择敏感性优异的培养基用于布鲁氏菌的培养和分离。
发明内容
基于上述技术问题，本发明通过选择提供敏感性优异的培养基能够从喜马拉雅旱獭组织样品中分离出布鲁氏菌，同时初步分析喜马拉雅旱獭组织样品中分离出的疑似菌是否是布鲁氏菌。目的是以喜马拉雅旱獭为对象提供一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基及其制备方法。
本发明保护一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，制备 1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂13～18g；胰蛋白月示10～18g；氯化钠4～8g；无水亚硫酸钠0.1～0.4g；酵母提取物2～5g；牛肝浸粉5～15g；D-葡萄糖2～6g；赤藓糖醇0.05～0.2g；枸橼酸钠 0.2～0.5g；特级马血清6～10ml；杆菌肽15～25单位/ml；放线菌酮 100～200ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
进一步的，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂13～15g；胰蛋白月示10～15g；氯化钠4～5g；无水亚硫酸钠0.1～0.2g；酵母提取物2～3g；牛肝浸粉5～10g；D-葡萄糖2～3g；赤藓糖醇0.05～0.1g；枸橼酸钠0.2～0.3g；特级马血清6～8ml；杆菌肽15～20 单位/ml；放线菌酮100～150ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
进一步的，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂15～18g；胰蛋白月示15～18g；氯化钠5～8g；无水亚硫酸钠 0.2～0.4g；酵母提取物3～5g；牛肝浸粉10～15g；D-葡萄糖3～6g；赤藓糖醇0.1～0.2g；枸橼酸钠0.3～0.5g；特级马血清8～10ml；杆菌肽 20～25单位/ml；放线菌酮150～200ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
优化的，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂13g；胰蛋白月示10g；氯化钠5g；无水亚硫酸钠0.1g；酵母提取物3g；牛肝浸粉5g；D-葡萄糖2g；赤藓糖醇0.1g；枸橼酸钠0.2g；特级马血清6ml；杆菌肽15单位/ml；放线菌酮150ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
本发明还保护上述一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一：称取上述比例的琼脂、胰蛋白月示、氯化钠、无水亚硫酸钠、酵母提取物、牛肝浸粉加入蒸馏水或双蒸水中混合至1000mL，得混合物；
步骤二：将所得到的上述混合物煮沸、沉淀、过滤，取上清液，备用；
步骤三：向步骤二所述的上清液中加入上述比例的D-葡萄糖、赤藓糖醇、枸橼酸钠，充分混匀，用上述比例的氢氧化钠溶液调节混合物的pH值为7.0～7.2，然后将混合物封装于洁净、干燥的烧瓶中， 116～121℃条件下高压灭菌20～30min；
步骤四：待高压灭菌后的混合物冷却至50～60℃时，在无菌条件下加入灭菌后的特级马血清、杆菌肽及放线菌酮，轻轻旋转烧瓶中的混合物，待混匀后将烧瓶中的液体于无菌条件下快速倾倒至灭菌后的平皿中，每一个平皿中倾倒液体12～18ml；
步骤五：平皿平放于室温中隔夜，次日观察平皿中所述液体是否成固体、是否生长菌落；若观察到不生长任何菌落的固体物时，即为制备合格的上述培养基，于2～8℃条件下冷藏，备用。
进一步的，所述特级马血清是血浆中除去纤维蛋白分离出液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。
进一步的，所述胰蛋白月示是采用动物组织、混合蛋白、经生物酶消化而制成的。
本发明还保护用上述培养基培养布鲁氏菌的方法，具体步骤包括如下：
培养温度为恒温37℃，对培养气氛没有特别限制，只要布鲁氏菌的生长没有受到明显抑制即可，可以向培养气氛中引入二氧化碳以增加其浓度，其中，引入二氧化碳的量为5～10％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～60天。
进一步的，所述引入二氧化碳的量为5％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～25天。
其中，所述琼脂中含有生物代谢的物质或微生物抑制物质，有良好的凝固性、稳定性、弹性和透明性，具有能与一些物质形成络合物等的物理化学性质。
所述胰蛋白月示富含天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等多种氨基酸，也包含不同的肽，营养丰富，其中总氮≥11％、氨基氮≥ 3％。
所述酵母提取物富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分，其中氨基酸含量≥30％，总蛋白≥50％，核苷酸≥10％。
所述牛肝浸粉是培养基的一种必需材料，可提供细菌生长所需的生长因子。
所述D-葡萄糖是单糖，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物。
所述赤藓糖醇是一种新开发的4碳糖醇，在广泛pH范围内稳定，具有稳定性高、溶解热高、溶解度高、吸湿性低的性质。
所述无水亚硫酸钠，易溶于水，呈碱性，是一种还原剂。
所述枸橼酸钠是体外抗凝剂，易溶于水、乙醇。
所述特级马血清能提供基本营养物质、激素和各种生长因子，对培养中的细胞起到某些保护作用。在培养基中加入马血清可以保存血中一些不耐热的生长因子，促使细菌生长繁殖。
所述氯化钠可以维持渗透压，对维持正常的血液和细胞外液的容量和渗透压起着非常重要的作用。
所述氢氧化钠具有强碱性和有很强的吸湿性，易溶于水，水溶液呈碱性，与酸类起中和作用。用氢氧化钠溶液调节pH值，确保培养基的pH值范围在一定值之间，使细菌生长繁殖在一个较为稳定的环境中。
所述杆菌肽对革兰阳性细菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体等均有杀菌作用；
放线菌酮对酵母菌、霉菌、原虫等病原菌等有抑制作用，对细菌无显著抑制作用。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，是一种能够对布鲁氏菌进行培养的固体培养基，营养均衡；所添加的组分即满足了布鲁氏菌的代谢需求的碳源、氮源等，又抑制污染样品中其他细菌的生长，提高污染样品中布鲁氏菌的检出率；各组分之间相辅相成，达到协同增效的作用；本发明提供的培养基能够满足自喜马拉雅旱獭组织中分离布鲁氏菌的生长繁殖需求，具有质量稳定、制备简便和培养菌数高的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的培养基培养喜马拉雅旱獭组织中分离布鲁氏菌48小时效果图；
图2为本发明实施例2制备的培养基培养喜马拉雅旱獭组织中分离布鲁氏菌48小时效果图；
图3为本发明培养基培养分离的喜马拉雅旱獭组织中的布鲁氏菌的镜下图；
图4为本发明培养基分离的喜马拉雅旱獭组织中的布鲁氏菌的BCSP31-PCR扩增图。
图中，A1为阴性对照；A2标准疫苗株；A3实施例1培养基培养出的喜马拉雅旱獭组织中分离的布鲁氏菌；A4实施例2培养基培养出的喜马拉雅旱獭组织中分离的布鲁氏菌。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
(1)本发明实施例中所用部分材料
琼脂、胰蛋白月示、氯化钠、无水亚硫酸钠、酵母粉、牛肝浸粉、 D-葡萄糖、赤藓糖醇、枸橼酸钠、特级马血清、杆菌肽、放线菌酮等均购自美国BD有限公司和北京索莱宝科技有限公司。所有标准试剂：布鲁氏菌诊断、检测、鉴定试剂均购自中国疾病预防控制中心传染病所布病室；鼠疫杆菌诊断试剂均购自中国吉林鼠疫、布鲁氏菌病基地； PCR扩增试剂购自上海生工生物公司；引物购自上海生工生物公司。
(2)仪器
分析天平、精密PH计购自梅特勒-托利多仪器有限公司；生物安全柜购自Thermo有限公司；麦氏浊度计购自生物梅里埃公司。
(3)生物安全实验室条件
所有实验活动均在二级生物安全水平(BSL-2实验室)及以上实验室进行。
(4)生物安全实验室操作标准依据
《实验室生物安全通用要求(GB19489-2008)》、《实验室生物安全认可准则(CNAS/CL05：2009)》、《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则(WS233-2002)》和ISO/IEC17025：2006及相关的标准、准则和文件。
(5)实验室试验操作和诊断标准依据
《布鲁氏菌病诊断标准》(WS269-2019)、《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)和《鼠疫诊断标准》(WS279-2008)。
(6)喜马拉雅旱獭组织材料来源
在青南地区的自然环境中，做好个人防护的前提下，人工捕捉喜马拉雅旱獭，人工保定，颈部或后肢肌肉内注射盐酸氯胺酮进行麻醉，后肢静脉无菌操作采集血样5～8毫升，盐酸氯胺酮剂量范围32～110 毫克/千克，尽量维持最小剂量。解剖取材前，先用消毒液将动物体沾湿消毒，然后按照皮下、胸腔、腹腔的顺序解剖，无菌操作采集骨髓、淋巴结、肝脏、脾脏、肺、心备检。腐败或疑似污染样品，须与较新鲜样品分开放置，分别检查。所有被检材料必须按照规定的生物安全措施保存和送检，同时必须附有详细的书面记述材料。
(7)对喜马拉雅旱獭组织被检材料排除鼠疫杆菌感染的方法
①血清学检测例如间接血球凝集试验、反向血凝试验、胶体金快速诊断试验、ELISA试验；
②病原学检测例如采用1％赫氏兔溶血培养基和龙胆紫培养基进行培养等。
对已排除鼠疫杆菌感染的喜马拉雅旱獭血样品材料进行布鲁氏菌抗体的检测，抗体为阳性的采用本发明的培养基进行喜马拉雅旱獭组织样品中布鲁氏菌的分离和培养。
实施例1
本实施例提供一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，并用该培养基对喜马拉雅旱獭组织中分离的布鲁氏菌进行培养。
一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂13g；胰蛋白月示10g；氯化钠5g；无水亚硫酸钠0.1g；酵母提取物3g；牛肝浸粉5g；D-葡萄糖 2g；赤藓糖醇0.1g；枸橼酸钠0.2g；特级马血清6ml；杆菌肽15单位/ml；放线菌酮150ug/ml；余量的蒸馏水。
上述一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一：称取上述比例的琼脂13g、胰蛋白月示10g、氯化钠5g、无水亚硫酸钠0.1g、酵母提取物3g、牛肝浸粉5g加入蒸馏水中混合至1000mL，得混合物；
步骤二：将所得到的上述混合物煮沸、沉淀、过滤，取上清液，备用；
步骤三：向步骤二所述的上清液中加入上述比例的D-葡萄糖2g、赤藓糖醇0.1g、枸橼酸钠0.2g，充分混匀，用0.1％氢氧化钠溶液调节混合物的pH值为7.0～7.2，然后将混合物封装于洁净、干燥的烧瓶中，116℃条件下高压灭菌30min；
步骤四：待高压灭菌后的混合物冷却至50℃时，在无菌条件下加入灭菌后的特级马血清6ml、杆菌肽15单位/ml及放线菌酮 150ug/ml，轻轻旋转烧瓶中的混合物，待混匀后将烧瓶中的液体于无菌条件下快速倾倒至灭菌后的平皿中，每一个平皿中倾倒液体15ml；
步骤五：平皿平放于室温中隔夜，次日观察平皿中所述液体是否成固体、是否生长菌落；若观察到不生长任何菌落的固体物时，即为制备合格的上述培养基，于2～8℃条件下冷藏，备用。
其中，所述特级马血清是血浆中除去纤维蛋白分离出液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。所述胰蛋白月示是采用动物组织、混合蛋白、经生物酶消化而制成的。
用上述方法制备的培养基培养喜马拉雅旱獭组织样品中分离的布鲁氏菌的方法，具体步骤包括如下：
培养温度为恒温37℃，对培养气氛没有特别限制，只要布鲁氏菌的生长没有受到明显抑制即可，可以向培养气氛中引入二氧化碳以增加其浓度，其中，引入二氧化碳的量为5％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～25天。
实施例2
本实施例提供一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，并用该培养基对喜马拉雅旱獭组织中分离的布鲁氏菌进行培养。
一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂18g；胰蛋白月示15g；氯化钠8g；无水亚硫酸钠0.4g；酵母提取物5g；牛肝浸粉13g；D-葡萄糖5g；赤藓糖醇0.2g；枸橼酸钠0.5g；特级马血清8ml；杆菌肽23 单位/ml；放线菌酮180ug/ml；余量的蒸馏水。
上述一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一：称取上述比例的琼脂18g、胰蛋白月示15g、氯化钠8g、无水亚硫酸钠0.4g、酵母提取物5g、牛肝浸粉13g加入蒸馏水中混合至1000mL，得混合物；
步骤二：将所得到的上述混合物煮沸、沉淀、过滤，取上清液，备用；
步骤三：向步骤二所述的上清液中加入上述比例的D-葡萄糖5g、赤藓糖醇0.2g、枸橼酸钠0.5g，充分混匀，用0.1％氢氧化钠溶液调节混合物的pH值为7.0～7.2，然后将混合物封装于洁净、干燥的烧瓶中，118℃条件下高压灭菌25min；
步骤四：待高压灭菌后的混合物冷却至55℃时，在无菌条件下加入灭菌后的特级马血清8ml、杆菌肽23单位/ml及放线菌酮 180ug/ml，轻轻旋转烧瓶中的混合物，待混匀后将烧瓶中的液体于无菌条件下快速倾倒至灭菌后的平皿中，每一个平皿中倾倒液体18ml；
步骤五：平皿平放于室温中隔夜，次日观察平皿中所述液体是否成固体、是否生长菌落；若观察到不生长任何菌落的固体物时，即为制备合格的上述培养基，于2～8℃条件下冷藏，备用。
其中，所述特级马血清是血浆中除去纤维蛋白分离出液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。所述胰蛋白月示是采用动物组织、混合蛋白、经生物酶消化而制成的。
用上述方法制备的培养基培养喜马拉雅旱獭组织样品中分离的布鲁氏菌的方法，具体步骤包括如下：
培养温度为恒温37℃，对培养气氛没有特别限制，只要布鲁氏菌的生长没有受到明显抑制即可，可以向培养气氛中引入二氧化碳以增加其浓度，其中，引入二氧化碳的量为10％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～30天。
实施例3
本实施例提供一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，并用该培养基对喜马拉雅旱獭组织中分离的布鲁氏菌进行培养。
一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：
琼脂15g；胰蛋白月示18g；氯化钠4g；无水亚硫酸钠0.2g；酵母提取物2g；牛肝浸粉15g；D-葡萄糖3g；赤藓糖醇0.05g；枸橼酸钠0.3g；特级马血清10ml；杆菌肽25单位/ml；放线菌酮100ug/ml；余量的双蒸水。
上述一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一：称取上述比例的琼脂15g、胰蛋白月示18g、氯化钠4g、无水亚硫酸钠0.2g、酵母提取物2g、牛肝浸粉15g加入双蒸水中混合至1000mL，得混合物；
步骤二：将所得到的上述混合物煮沸、沉淀、过滤，取上清液，备用；
步骤三：向步骤二所述的上清液中加入上述比例的D-葡萄糖3g、赤藓糖醇0.05g、枸橼酸钠0.3g，充分混匀，用0.1％氢氧化钠溶液调节混合物的pH值为7.0～7.2，然后将混合物封装于洁净、干燥的烧瓶中，121℃条件下高压灭菌20min；
步骤四：待高压灭菌后的混合物冷却至60℃时，在无菌条件下加入灭菌后的特级马血清10ml、杆菌肽25单位/ml及放线菌酮 100ug/ml，轻轻旋转烧瓶中的混合物，待混匀后将烧瓶中的液体于无菌条件下快速倾倒至灭菌后的平皿中，每一个平皿中倾倒液体12ml；
步骤五：平皿平放于室温中隔夜，次日观察平皿中所述液体是否成固体、是否生长菌落；若观察到不生长任何菌落的固体物时，即为制备合格的上述培养基，于2～8℃条件下冷藏，备用。
其中，所述特级马血清是血浆中除去纤维蛋白分离出液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。所述胰蛋白月示是采用动物组织、混合蛋白、经生物酶消化而制成的。
用上述方法制备的培养基培养喜马拉雅旱獭组织样品中分离的布鲁氏菌的方法，具体步骤包括如下：
培养温度为恒温37℃，对培养气氛没有特别限制，只要布鲁氏菌的生长没有受到明显抑制即可，可以向培养气氛中引入二氧化碳以增加其浓度，其中，引入二氧化碳的量为7％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～60天。
实施例4
依照布鲁氏菌的鉴定方法对培养出的疑似喜马拉雅旱獭布鲁氏菌落进行鉴定如下：
①不同染色方法：包括沙黄染色和革兰氏染色方法。
②在高倍和低倍显微镜下观察染色后的疑似布鲁氏菌的菌落形态、结构；
③对分离出的疑似布鲁氏菌进行鉴定：挑选分离出的疑似布鲁氏菌进行24～72小时培养，进行单相特异性血清A和M血清凝集试验、粗糙型(R)血清凝集试验、布鲁氏菌阳性血清凝集试验。
根据细菌DNA提取试剂盒的说明书,提取疑似布鲁氏菌的模板 DNA，进行BCSP31-PCR初步鉴定：
①BCSP31-PCR引物序列设计来自文献，如下：
B4:5`-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3`
B5:5`-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3`
②所述的PCR反应体系(20ul反应体系)包括：正向引物B4 和反向引物B5各1ul，待测菌的基因组DNA1ul；Taq PCR Master Mix10ul，双蒸水7ul。
③PCR反应扩增条件：95℃预变性4分钟，95℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；共30个循环；72℃延伸5分钟。
④PCR扩增扩增结束后，其扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；经100V电压1小时后，进行凝胶成像分析，若电泳结果被检样品PCR扩增有223bp目的条带，表明该疑似菌含有布鲁氏菌核酸 DNA阳性；若电泳结果被检样品未有条带的，表明被检样品不存在布鲁氏菌核酸DNA，或者核酸DNA量少至PCR无法检测到。
根据本发明能够提供和选择敏感性优异的培养基，并能够从喜马拉雅旱獭及其样品中分离出布鲁氏菌。
同时，初步鉴定喜马拉雅旱獭及其样品中分离出的布鲁氏菌。
经测试，实施例2与实施例1具有类似的性能效果，实施例2效果较低，优化地从喜马拉雅旱獭组织样品中分离、培养布鲁氏菌选用本发明培养基实施1制备的培养基。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，其特征在于，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：
琼脂13～18g；胰蛋白月示10～18g；氯化钠4～8g；无水亚硫酸钠0.1～0.4g；酵母提取物2～5g；牛肝浸粉5～15g；D-葡萄糖2～6g；赤藓糖醇0.05～0.2g；枸橼酸钠0.2～0.5g；特级马血清6～10ml；杆菌肽15～25单位/ml；放线菌酮100～200ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
2.根据权利要求1所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，其特征在于，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂13～15g；胰蛋白月示10～15g；氯化钠4～5g；无水亚硫酸钠0.1～0.2g；酵母提取物2～3g；牛肝浸粉5～10g；D-葡萄糖2～3g；赤藓糖醇0.05～0.1g；枸橼酸钠0.2～0.3g；特级马血清6～8ml；杆菌肽15～20单位/ml；放线菌酮100～150ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
3.根据权利要求1所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，其特征在于，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂15～18g；胰蛋白月示15～18g；氯化钠5～8g；无水亚硫酸钠0.2～0.4g；酵母提取物3～5g；牛肝浸粉10～15g；D-葡萄糖3～6g；赤藓糖醇0.1～0.2g；枸橼酸钠0.3～0.5g；特级马血清8～10ml；杆菌肽20～25单位/ml；放线菌酮150～200ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
4.根据权利要求1所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基，其特征在于，制备1000mL的该培养基，具体由如下的组分构成：琼脂13g；胰蛋白月示10g；氯化钠5g；无水亚硫酸钠0.1g；酵母提取物3g；牛肝浸粉5g；D-葡萄糖2g；赤藓糖醇0.1g；枸橼酸钠0.2g；特级马血清6ml；杆菌肽15单位/ml；放线菌酮150ug/ml；余量的蒸馏水或双蒸水。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤一：称取上述比例的琼脂、胰蛋白月示、氯化钠、无水亚硫酸钠、酵母提取物、牛肝浸粉加入蒸馏水或双蒸水中混合至1000mL，得混合物；
步骤二：将所得到的上述混合物煮沸、沉淀、过滤，取上清液，备用；
步骤三：向步骤二所述的上清液中加入上述比例的D-葡萄糖、赤藓糖醇、枸橼酸钠，充分混匀，用上述比例的氢氧化钠溶液调节混合物的pH值为7.0～7.2，然后将混合物封装于洁净、干燥的烧瓶中，116～121℃条件下高压灭菌20～30min；
步骤四：待高压灭菌后的混合物冷却至50～60℃时，在无菌条件下加入灭菌后的特级马血清、杆菌肽及放线菌酮，轻轻旋转烧瓶中的混合物，待混匀后将烧瓶中的液体于无菌条件下快速倾倒至灭菌后的平皿中，每一个平皿中倾倒液体12～18ml；
步骤五：平皿平放于室温中隔夜，次日观察平皿中所述液体是否成固体、是否生长菌落；若观察到不生长任何菌落的固体物时，即为制备合格的上述培养基，于2～8℃条件下冷藏，备用。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述特级马血清是血浆中除去纤维蛋白分离出液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白月示是采用动物组织、混合蛋白、经生物酶消化而制成的。
8.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基培养布鲁氏菌的方法，其特征在于，具体步骤包括如下：
培养温度为恒温37℃，对培养气氛没有特别限制，只要布鲁氏菌的生长没有受到明显抑制即可，可以向培养气氛中引入二氧化碳以增加其浓度，其中，引入二氧化碳的量为5～10％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～60天。
9.根据权利要求8所述的一种用于分离旱獭组织中布鲁氏菌的培养基培养布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述引入二氧化碳的量为5％；培养时间达到布鲁氏菌的水平生长即可，即5～25天。
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