CN116983419B - 一种通用型耐热冻干保护剂及其制备方法 - Google Patents

一种通用型耐热冻干保护剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种通用型耐热冻干保护剂，该保护剂主要成份为(质量体积比)：6～12％聚乙烯吡咯烷酮、8～12％酪蛋白、10～20％乳酸钙、10～20％L‑谷氨酸钠、1～8％海藻糖、1～6％L‑半胱氨酸、1～6％L‑精氨酸和1～6％抗坏血酸，此保护剂与猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪丹毒杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪肺炎支原体病原等以合适比例混匀后冻干，可使猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪丹毒杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪肺炎支原体于2～8℃保藏24个月后，仍具有有效活性，并且提升了运输的便利性以及显著降低了病毒、细菌和支原体类疫苗的冷链运输成本。

Description

一种通用型耐热冻干保护剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及一种通用型耐热冻干保护剂及其制备方法。
背景技术
干燥是保持微生物病原活性的一种重要技术手段，通过去除水分，可以使微生物代谢受阻并长期处于稳定的生理状态，从而延长菌株的贮藏期。真空冷冻干燥技术是将微生物混液冷冻至固态，并在真空条件下将水分由固态直接升华为气态，使微生物混液成为冻干团块的过程。
冻干保护剂的作用是在冷冻干燥和贮藏过程中改变生物样品物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害；同时保持蛋白质及细胞的稳定性，尽可能保持原有的生理生化特性和生物活性。
在兽用生物制品领域，多数制品使用的冻干保护剂为常规保护剂，主要成份为脱脂奶粉、蔗糖和明胶，不具有耐高温特质，冻干后只能保存于-15℃以下。这一保存条件对于冷链运输过程、成本以及疫苗病原活力的保持都有很高的要求。而且可能因保存不当造成疫苗的失活,效力降低,达不到防疫的目的而造成经济损失。
耐热冻干保护剂已在兽用生物制品中运用多年，但有些主要流行的猪疫病疫苗仍采用传统冻干保护剂。病毒类疫苗如猪瘟和猪伪狂犬病活疫苗，细菌类疫苗如猪丹毒和猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗，及支原体类疫苗如猪支原体肺炎活疫苗等使用的均为传统冻干保护剂，其冷链运输成本高，容易因保存温度不够导致病原失活而失效。
发明内容
鉴于以上问题，本发明开发一种新型通用型耐热冻干保护剂，能有效降低涵盖病毒、细菌和支原体等5种病原的冻干损失，提升病原微生物对温度的耐受性，使其制成的疫苗或毒种在2-8℃保存24个月后，仍然能维持良好的物理性状与效价，具有性状稳定、耐热、保存时间长、显著降低冷链运输成本等优点。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种通用型耐热冻干保护剂，其应用范围涵盖了病毒、细菌和支原体。
一种通用型耐热冻干保护剂，所述耐热冻干保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、酪蛋白、乳酸钙、L-谷氨酸钠、海藻糖、L-半胱氨酸、L-精氨酸和抗坏血酸制成。
进一步，所述的通用型耐热冻干保护剂，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮6～12％、酪蛋白8～12％、乳酸钙10～20％、L-谷氨酸钠10～20％、海藻糖1～8％、L-半胱氨酸1～6％、L-精氨酸1～6％、抗坏血酸1～6％、余量为注射用水。
进一步，所述的通用型耐热冻干保护剂，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮10～12％、酪蛋白8～10％、乳酸钙10～15％、L-谷氨酸钠10～15％、海藻糖2～6％、L-半胱氨酸2～5％、L-精氨酸1～2％、抗坏血酸1～2％、余量为注射用水。
进一步，所述的通用型耐热冻干保护剂，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮10％、酪蛋白10％、乳酸钙15％、L-谷氨酸钠10％、海藻糖6％、L-半胱氨酸3％、L-精氨酸3％、抗坏血酸1％、余量为注射用水。
进一步，所述的通用型耐热冻干保护剂，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮12％、酪蛋白8％、乳酸钙10％、L-谷氨酸钠15％、海藻糖5％、L-半胱氨酸5％、L-精氨酸5％、抗坏血酸2％、余量为注射用水。
进一步，所述的通用型耐热冻干保护剂，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮10％、酪蛋白10％、乳酸钙15％、L-谷氨酸钠13％、海藻糖2％、L-半胱氨酸2％、L-精氨酸2％、抗坏血酸1％、余量为注射用水。
本发明还提供了一种含有所述的通用型耐热冻干保护剂的活疫苗。
本发明还提供了所述的活疫苗的制备方法，具体方法为：按体积比例将所述冻干保护剂溶液与病毒液、菌液或支原体液混合均匀冻干后既得，所述冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h。
进一步，所述冻干保护剂溶液与病毒液、菌液或支原体液的体积比为2:5～2:1。
进一步，所述病毒液为猪瘟病毒液、猪伪狂犬病毒液；所述菌液为猪丹毒杆菌液、猪巴氏杆菌液；所述支原体液为猪肺炎支原体液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的耐热冻干保护剂其各组分来源丰富，成本低，易配制。
本发明提供的耐热冻干保护剂可用于病毒、细菌和支原体，适用于多种不同类型的病原微生物，为通用型耐热冻干保护剂。
本发明提供的耐热冻干保护剂，可使病毒类、细菌类和支原体类活疫苗保存于2～8℃长达2年，仍可提供有效活性。
本发明提供的耐热冻干保护剂，因物理性状稳定，高温耐受性强，从传统保存温度-15℃提升至2～8℃保存，显著降低了冷链运输的压力和成本。
附图说明
图1猪瘟活疫苗冻干后外观性状
图2猪伪狂犬病活疫苗冻干后外观性状
图3猪丹毒活疫苗冻干后外观性状
图4猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗冻干后外观性状
图5猪支原体肺炎活疫苗冻干后外观性状
具体实施方式
下述实施例为进一步说明本专利，不对本专利形成限制；实施例所用试剂，如无说明，均可从商业途径购买；所用ST细胞、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪丹毒杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪肺炎支原体等病原微生物均由兆丰华生物科技(南京)有限公司北京生物医药科技中心制备、鉴定和保存。
实施例1耐热冻干保护剂的筛选
1.1不同耐热冻干保护剂的配制
保护剂1的配制(质量体积比)：10％聚乙烯吡咯烷酮、10％酪蛋白、15％乳酸钙、10％L-谷氨酸钠、6％海藻糖，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
保护剂2的配制(质量体积比)：10％聚乙烯吡咯烷酮、10％酪蛋白、15％乳酸钙、10％L-谷氨酸钠、6％海藻糖、3％L-半胱氨酸，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
保护剂3的配制(质量体积比)：10％聚乙烯吡咯烷酮、10％酪蛋白、15％乳酸钙、10％L-谷氨酸钠、6％海藻糖、3％L-半胱氨酸、3％L-精氨酸，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
保护剂4的配制(质量体积比)：10％聚乙烯吡咯烷酮、10％酪蛋白、15％乳酸钙、10％L-谷氨酸钠、6％海藻糖、3％L-半胱氨酸、3％L-精氨酸、1％抗坏血酸，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
保护剂5的配制(质量体积比)：10％脱脂奶粉、10％蔗糖，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
1.2培养猪伪狂犬病病毒
1.2.1培养选择生长良好的单层鸡胚成纤维细胞。培养制造方法按《中华人民共和国兽用生物制品生产规程(2000年版)》附录442页进行。
倒去细胞培养液，换以含1％猪伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)毒种液的细胞维持液。置37℃或旋转培养。
接毒后，每日观察1～2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75％以上时收获，在-20℃以下保存。
1.2.2病毒含量测定
按含毒组织量用乳汉液将病毒液做10倍系列稀释，取10-5、10-6和10-7三个稀释度各接种鸡胚成纤维细胞4小瓶，每瓶0.1ml，补充维持液0.9ml，使之总量为1ml。观察细胞病变(CPE)，计算TCID50,每0.1ml病毒含量应≥105.0TCID50。本次制备的猪伪狂犬病病毒含量为1.0×107.5TCID50/ml，符合规定。
1.3冻干
将“1.2培养猪伪狂犬病病毒”中收获的猪伪狂犬病病毒进行适当稀释，与1.1制备的保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4和保护剂5分别按混匀时每毫升混液应不低于106TCID50，2:1的体积比例混合均匀，定量分装。分装后，按冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h进行冷冻干燥。
1.4冻损结果
冻干前与冻干后复溶的病毒混液均取样，与适当稀释后的病毒液同时进行病毒含量测定。样品按“1.2.2病毒含量测定”方法进行，病毒液、冻前混液及冻后样品的病毒含量(TCID50)以及不同冻干保护剂的冻损如表1所示。
从结果可知，保护剂1在与猪伪狂犬病病毒混合时，冻损最高，为94.9倍。其次为冻干保护剂5，保护剂5为传统经典保护剂，其在加入到病毒中时，病毒活性降低10倍有余，总冻损倍数达47.5倍。保护剂2和保护剂3的总损倍数分别为28.5和20.1倍。保护剂4的总损倍数最低，为3.8倍。
表1不同样品的病毒含量及不同保护剂的冻损情况
保护剂2、保护剂3和保护剂4与保护剂1的组分差别在于其分别多了组分3％L-半胱氨酸、3％L-精氨酸、1％抗坏血酸，冻损结果说明，这3种组分对于冻干效果起到非常关键的作用。筛选耐热冻干保护剂的结果显示，L-半胱氨酸、L-精氨酸和抗坏血酸均有的保护剂4为最佳耐热冻干保护剂。
实施例2制备猪瘟耐热冻干保护剂活疫苗
2.1耐热冻干保护剂的配制
在烧杯中分别加入10％聚乙烯吡咯烷酮、10％酪蛋白、15％乳酸钙、10％L-谷氨酸钠、6％海藻糖、3％L-半胱氨酸、3％L-精氨酸、1％抗坏血酸，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
2.2猪瘟病毒培养
2.2.1ST细胞培养
将含有1mL ST细胞悬液冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL DMEM培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4～6mL DMEM培养基后吹匀。将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养过夜，24h后换液并观察细胞密度。
细胞密度达80％～90％，即可进行传代培养。
弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；加1ml消化液(0.25％Trypsin-0.53mM EDTA)于T25培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1～2min，于显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含8～10％血清的培养基终止消化；轻轻吹打细胞，脱落后吸出，在1000rpm条件下离心8～10分钟，弃去上清液，补加1～2mL培养液后吹匀，按5～6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1:5的比例分到新的培养瓶中。
2.2.2病毒培养
已长成良好细胞单层的培养瓶弃去上清培养液，接种含3～5％猪瘟病毒的维持液，置37℃继续培养。
接毒培养至4日后，收获上清，加培养基继续培养，以后每隔4日收获换液1次，连续收5次。
2.2.3耐热冻干保护剂与猪瘟病毒混匀后冻干
2.2.3.1冻干
取2.1制备好的冻干保护剂与2.2.2培养的猪瘟病毒液以每头份大于等于20000RID，3:5的体积比例混合均匀，定量分装于干烤后西林瓶中。进行冻干保存。
冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h。猪瘟疫苗冻干后的外观如图1所示。
2.2.3.2取样
冻干前，猪瘟病毒液中取3ml作为检样，命名为病毒液；与冻干保护剂混匀后于分装前取3mL样品作为检样，命名为冻干混样；冻干后，取3瓶冻干后的样品，分别以2mL注射用水溶解后混匀，命名为冻后样。
2.2.3.3病毒含量测定(按《中国兽药典三部(2020版)》操作)
将以上3个样品的1ml，分别用灭菌生理盐水稀释为1/7500头份/ml、1/15000头份/ml、1/20000头份/ml和1/25000头份/ml，3个样品的4个稀释度分别以耳静脉注射1.5～3.0kg兔2只，各l.0ml。接种后，上、下午各测体温1次，48小时后，每隔6小时测体温1次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。
接种疫苗后，兔的体温反应标准如下：
定型热反应(++)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次升高1℃以上，并稽留18～36小时。如稽留42小时以上，则必须攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干毒)，攻毒后如果无反应，可判为定型热。
轻热反应(+)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次升高0.5℃以上，并稽留12～36小时。
可疑反应(±)潜伏期48～96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。
体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔的热反应可判为定型热或轻热反应。
无反应(-)体温正常。
结果判定接种疫苗后，当2只兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。
在兔体感染试验中，3个样品的4种稀释度的病毒含量均大于25000兔体感染量(RID)/头份，结果如表2所示。
表2 3个样品4种稀释度的病毒含量检测结果
2.2.4其它检测
取2.2.3冻干制备的猪瘟活疫苗进行按《中国兽药典三部(2020版)》附录3306、3308、3305、3204和3103分别进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、剩余水分和真空度的检测，结果均符合要求。
2.2.4保存期病毒含量检测
将2.2.3冻干后的猪瘟疫苗(冻干品)分为2份，1份置于37℃，另1份置于2～8℃保存。
置于37℃保存的猪瘟疫苗，每隔3天取样，按“2.2.3.3病毒含量测定”方法检测病毒含量，同时检测真度和剩余水分，检测至第27日；置于2～8℃保存的猪瘟疫苗，每隔3个月取样，按“2.2.3.3病毒含量测定”方法检测病毒含量，同时检测真空度和剩余水分，检测至第27个月。
检测结果显示，置37℃保存的猪瘟活疫苗，保存27日后，真空度检测合格，但剩余水分不合格；兔体感染量于第27日时仅为20000RID/头份；而置于2～8℃保存的猪瘟疫苗，保存至27个月后，真空度、剩余水分均合格，兔体感染量为25000RID/头份。结果如表3所示。
表3猪瘟活疫苗不同保存条件下保存期检测结果
实施例3制备猪伪狂犬病耐热冻干保护剂活疫苗
3.1耐热冻干保护剂的配制
按“2.1耐热冻干保护剂的配制”的方法配制耐热冻干保护剂，备用。
3.2猪伪狂犬病病毒的培养
按《中华人民共和国兽用生物制品生产规程(2000年版)》进行培养。
3.2.1培养猪伪狂犬病病毒
选择生长良好的单层鸡胚成纤维细胞。培养制造方法按《中华人民共和国兽用生物制品生产规程(2000年版)》附录442页进行。
倒去细胞培养液，换以含1％猪伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)毒种液的细胞维持液。置37℃或旋转培养。
接毒后，每日观察1～2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75％以上时收获，在-20℃以下保存。
3.2.2病毒含量测定
按含毒组织量用乳汉液将病毒液做10倍系列稀释，取10-5、10-6和10-7三个稀释度各接种鸡胚成纤维细胞4小瓶，每瓶0.1ml，补充维持液0.9ml，使之总量为1ml。观察细胞病变(CPE)，计算TCID50,每0.1ml病毒含量应≥105.0TCID50。本次制备的猪伪狂犬病病毒含量为1.0×107.0TCID50/ml，符合规定。
3.3冻干
将“3.2猪伪狂犬病病毒的培养”收获的猪伪狂犬病病毒进行适当稀释，与3.1制备的耐热冻干保护剂按每头份应不低于5000TCID50，2:1的体积比例混合均匀，定量分装。分装后，按冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h进行冷冻干燥。冻干后外观如图2所示。
冻干前的病毒混液与冻干后的各取样，与3.2制备的病毒液一起进行病毒含量测定。样品按“3.2.2病毒含量测定”方法进行，病毒液、冻前混液及冻后样品的病毒含量(TCID50)分别为1.0×105.5TCID50/头份、2.0×105.2TCID50/头份、1.5×105.0TCID50/头份。均不低于5000TCID50，为合格疫苗产品。
3.4其它检测
按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3306、3308、3305、3204和3103对冻干后的样品分别进行无菌、支原体、外源检测、剩余水分和真空度检验，均符合规定，为合格品。
3.5保存期检测
将“3.3冻干”的样品，分为2份，1份置37℃保藏，另1份置于2～8℃保藏。置37℃保藏的猪伪狂犬病活疫苗，每隔3天取样，直至第27日；置2～8℃保藏的样品，每隔3个月取样，检测至保藏后第27个月。所取样品均按“3.2.2病毒含量测定”方法检测病毒含量，同时按《中国兽药典三部(2020年版)》检测真空度和剩余水分。
保藏于37℃的疫苗样品，每隔3日取样检测，直至保藏后第27日，真空度和剩余水分均符合规定，病毒含量于27日时为1.0×104.0TCID50/头份，大于5000TCID50，即保存期病毒活力损失为15倍。2～8℃保藏的疫苗样品，直至第27个月，真空度和剩余水分均符合规定，病毒含量为8×104.0TCID50/头份，大于5000TCID50的标准，保存了27个月，病毒含量损失约2倍。此结果显示，使用发明的冻干保护剂，能使猪伪狂犬病活疫苗在2～8℃至少保存24个月。结果如表4所示。
表4猪伪狂犬病活疫苗不同保藏条件下不同时间点的检测结果
实施例4制备猪丹毒耐热冻干保护剂活疫苗
4.1耐热冻干保护剂配制
在烧杯中分别加入12％聚乙烯吡咯烷酮、8％酪蛋白、10％乳酸钙、15％L-谷氨酸钠、5％海藻糖、5％L-半胱氨酸、5％L-精氨酸、2％抗坏血酸，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
4.2猪丹毒杆菌菌液制备
4.2.1培养
按《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000版)》方法，将纯粹性检验合格的二级猪丹毒杆菌(GC42)种子液按培养基量的1～2％接种于肉肝胃(膜)消化汤内，同时按2～4％加入裂解血球全血，36～37℃培养20～22小时，培养过程中需振荡2～3次。培养菌液用高速离心法，将菌液浓缩制成菌悬液，用于配苗。
4.2.2活菌计数
按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3405方法进行活菌计数，GC42的活菌计数结果为1×1012CFU/ml。
4.3冻干
将“4.1耐热冻干保护剂配制”的保护剂与“4.2猪丹毒杆菌菌液制备”的菌液按每头份不低于1×108CFU，以3:7的体积比进行混合均匀，定量分装，然后冻干制苗。冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h进行冷冻干燥。冻干后外观如图3所示。
冻干前的混液与冻干后样品分别取样，按“3.2.2活菌计数”方法进行，冻前混液及冻后样品的活菌计数结果分别1.2×1010CFU/头份和1.0×1010CFU/头份。大于标准要求的1×108CFU/头份，为合格疫苗产品。
4.4其它检测
按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3204、3103、3306进行剩余水分、真空度和纯粹性检测，结果均合格。按《中国兽药典三部(2020年版)》92页进行鉴别检测，符合规定，为合格品。
4.5保存期检测
将“4.3冻干”的样品，分为2份，1份置37℃保藏，另1份置于2～8℃保藏。置37℃保藏的猪丹毒活疫苗，每隔3天取样，直至第27日；置2～8℃保藏的样品，每隔3个月取样，检测至保藏后第27个月。所取样品均按“3.2.2活菌计数”方法检测活菌数，同时按《中国兽药典三部(2020年版)》附录检测真空度和剩余水分。
37℃保存的疫苗样品，保存至第27日，真空度和剩余水分均符合规定，活菌数为1.1×108CFU/头份，大于标准要求的1×108CFU/头份1.1倍。2～8℃的疫苗样品保存至第27个月，真空度和剩余水分均符合规定，活菌数为8.3×108CFU/头份，大于标准要求的1×108CFU/头份8.3倍。
此结果表明，发明的冻干保护剂能使猪丹毒活疫苗在2～8℃至少保存24个月。结果如表5所示。
表5猪丹毒活疫苗不同保存条件下不同时间点的检测结果
实施例5制备猪多杀性巴氏杆菌耐热冻干保护剂活疫苗
5.1耐热冻干保护剂的配制
按“4.1耐热冻干保护剂配制”的方法进行配制。
5.2猪多杀性巴氏杆菌菌液培养
5.2.1菌液培养
按《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000版)》方法，将纯粹性检验合格的猪多杀性巴氏杆菌(679-230株)二级种子接种于含0.1％裂解血球全血及适量消泡剂的马丁肉汤培养基中，以逐渐增大通气量的方法，在37℃培养15小时左右，当菌样达到最高峰时，停止培养。
培养结束后，取样涂片镜检，应无杂菌，同时按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3406进行纯粹性检验合格。
5.2.2活菌计数
用含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的马丁琼脂平板，按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3405进行活菌计数，计数结果作为配苗计算头份时参考。计数结果为5.1×1012CFU/ml。
5.3冻干
将“5.1耐热冻干保护剂的配制”配制的耐热冻干保护剂及“5.2猪多杀性巴氏杆菌菌液的培养”培养的菌液以按每头份不低于3.0×108CFU，以4:7的体积比进行混合均匀，定量分装配苗，冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h进行冷冻干燥。冻干后外观如图4所示。
5.4活菌计数
将冻干前混液及冻干后样品进行活菌计数(按“5.2.2活菌计数”方法)，冻干前的活菌数为4.3×1010CFU/头份，冻干后为2.1×1010CFU/头份。
5.5部分检验
按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3204、3103、3306进行剩余水分、真空度和纯粹性检测，结果均合格。
5.6保存期检测
将“5.3冻干”的样品，分为2份，1份置37℃保存，另1份置于2～8℃保存。置37℃保存的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗，每隔3天取样，直至第27日；置2～8℃保存的疫苗，每隔3个月取样，检测至第27个月。所取样品均按“5.2.2活菌计数”方法检测活菌数，同时按《中国兽药典三部(2020年版)》附录按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3204、3103进行剩余水分和真空度，结果均合格。
37℃保存的疫苗保存至第27日，真空度和剩余水分均符合规定，活菌数为3.2×108CFU/头份，与标准要求的3×108CFU/头份相当。2～8℃的疫苗保存至第27个月，真空度和剩余水分均符合规定，活菌数为9.1×108CFU/头份，大于标准要求的3.0×108CFU/头份3倍。
此结果表明，发明的冻干保护剂能使猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗在2～8℃至少保存24个月。结果如表6所示。
表6猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗不同保存条件下不同时间点的检测结果
实施例6制备猪支原体肺炎耐热冻干保护剂活疫苗
6.1耐热冻干保护剂的配制
在烧杯中分别加入10％聚乙烯吡咯烷酮、10％酪蛋白、15％乳酸钙、13％L-谷氨酸钠、2％海藻糖、2％L-半胱氨酸、2％L-精氨酸、1％抗坏血酸，加注射用水溶解，完成溶解后，以注射用水定容至1L，以116℃高压灭菌30分钟，备用。
6.2猪肺炎支原体的培养
6.2.1制备KM2培养基
按《中国兽药典三部(2020年版)》91页附注进行制备。
Eagle’s液50％、1％水解乳蛋白磷酸盐缓冲液29％、健康猪血清20％、鲜酵母浸出汁1％、青霉毒200单位/ml、酚红0.002％。除血清外，用灭菌6号玻璃滤器过滤后，分装备用。健康猪血清经56℃灭活30分钟后，过滤除菌，按20％比例混合，然后用1.0mol/L氢氧化钠溶液pH值至7.4～7.6。37℃培养24小时，进行无菌检验。无菌检验合格后，4℃保存，备用。
6.2.2支原体培养
取二级猪肺炎支原体(168株)种子按8％～10％接种于KM2液体培养基，置37℃发酵罐20％通氧量培养4～5日，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.5～6.8时收获菌液。
取样按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3306进行纯粹性检验，合格后备用。
6.2.3CCU含量测定
按《中国兽药典三部(2020年版)》92页附注进行操作。
将猪肺炎支原体菌液用KM2培养基进行10倍系列稀释，即4.5ml KM2培养基接种0.5ml样品，依次1:10递减连续稀释成10-1、10-2…10-8、10-9、10-10、10-11、10-12，另设KM2培养基对照3管，共15管，同批作3个重复，置37℃培养，每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化直到第10日，并对培养物涂片，染色，镜检，检查有无典型猪肺炎支原体形态。稀释培养后，菌体生物，变化的最高稀释度为待检培养物CCU含量。
猪肺炎支原体菌液经检测，其CCU为1.0×109CCU/ml。
6.3冻干
将“6.1耐热冻干保护剂的配制”配制的耐热冻干保护剂与“6.2支原体培养”培养的支原体菌液按每头份不低于1.0×106CCU，体积比为2:5进行混合均匀，定量分装，冻干制苗。冻干程序为42℃7h、25℃16h、-5℃2h、5℃2h和26℃6h。冻干后的外观如图5所示。
6.4其它检测
按《中国兽药典三部(2020年版)》92页附注进行鉴别检验，按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3204、3103、3306进行剩余水分、真空度和纯粹性检测，结果均合格。
6.5保存期检测
将“6.3冻干”的样品，分为2份，1份置37℃保存，另1份置于2～8℃保存。置37℃保存的猪支原体肺炎活疫苗，每隔3天取样，直至第27日；置2～8℃保存的疫苗，每隔3个月取样，检测至第27个月。所取样品均按“6.2.3CCU含量测定”方法检测活菌数，同时按《中国兽药典三部(2020年版)》附录3204、3103检测剩余水分和真空度。
37℃保存的疫苗保存至第27日，真空度和剩余水分均符合规定，活菌数为1.3×106CCU/头份，与标准要求的1.0×106CFU/头份相当。2～8℃的疫苗保存至第27个月，真空度和剩余水分均符合规定，活菌数为9.1×106CFU/头份，大于标准要求的1.0×106CFU/头份9.1倍。
此结果表明，发明的冻干保护剂能使猪支原体肺炎活疫苗在2～8℃至少保存24个月。结果如表7所示。
表7猪支原体肺炎活疫苗不同保存条件下不同时间点的检测结果
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Claims (9)

1.一种通用型耐热冻干保护剂，其特征在于，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮6～12%、酪蛋白8～12%、乳酸钙10～20%、L-谷氨酸钠10～20%、海藻糖1～8%、L-半胱氨酸1～6%、L-精氨酸1～6%、抗坏血酸1～6%、余量为注射用水。
2.根据权利要求1所述的通用型耐热冻干保护剂，其特征在于，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮10～12%、酪蛋白8～10%、乳酸钙10～15%、L-谷氨酸钠10～15%、海藻糖2～6%、L-半胱氨酸2～5%、L-精氨酸1～2%、抗坏血酸1～2%、余量为注射用水。
3.根据权利要求1所述的通用型耐热冻干保护剂，其特征在于，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮10%、酪蛋白10%、乳酸钙15%、L-谷氨酸钠10%、海藻糖6%、L-半胱氨酸3%、L-精氨酸3%、抗坏血酸1%、余量为注射用水。
4.根据权利要求1所述的通用型耐热冻干保护剂，其特征在于，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮12%、酪蛋白8%、乳酸钙10%、L-谷氨酸钠15%、海藻糖5%、L-半胱氨酸5%、L-精氨酸5%、抗坏血酸2%、余量为注射用水。
5.根据权利要求1所述的通用型耐热冻干保护剂，其特征在于，由下述质量体积百分比的成分制备而成：聚乙烯吡咯烷酮10%、酪蛋白10%、乳酸钙15%、L-谷氨酸钠13%、海藻糖2%、L-半胱氨酸2%、L-精氨酸2%、抗坏血酸1%、余量为注射用水。
6.一种含有权利要求1~5任意一项所述的通用型耐热冻干保护剂的活疫苗。
7.权利要求6所述的活疫苗的制备方法，其特征在于，按体积比例将所述冻干保护剂溶液与病毒液、菌液或支原体液混合均匀冻干后既得，所述冻干程序为42℃ 7h、25℃ 16h、-5℃ 2h、5℃ 2h和26℃ 6h。
8.根据权利要求7所述的活疫苗的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂溶液与病毒液、菌液或支原体液的体积比为2:5~2:1。
9.根据权利要求7或8所述的活疫苗的制备方法，其特征在于，所述病毒液为猪瘟病毒液、猪伪狂犬病毒液；所述菌液为猪丹毒杆菌液、猪巴氏杆菌液；所述支原体液为猪肺炎支原体液。
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