CN111040971A - 一种猪肺疫疫苗增菌培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪肺疫疫苗增菌培养基，涉及生物学领域，由以下重量份的原料制成：肉肝胃膜消化液粉20.0g、牛胰脏消化物8.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、生长促进因子1.0g，纯化水加至1000ml；猪肺疫疫苗增菌培养基制备方法：将用于制备猪肺疫疫苗培养基的所有原料，加入到纯化水中，充分溶解后，121℃灭菌15分钟，备用。本发明涉及合成干粉培养基在猪肺疫疫苗生产中的应用，具有可选用商品化原料、培养基澄清、培养菌菌数高、提高菌体冻干存活率的有益效果。

Description

一种猪肺疫疫苗增菌培养基
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体是一种猪肺疫疫苗增菌培养基。
背景技术
猪肺疫又称猪巴氏杆菌病(Swinepasteurellosis)，是猪的三大传染病之一，呈世界性分布，也是一种人畜共患病，其病源是多杀性巴氏杆菌。目前我国现有的猪肺疫疫苗，有单苗、二联苗和三联苗，它们对预防猪肺疫疾病起到了重要的作用。但由于病原菌本身血清型复杂，至今国内外缺乏理想的疫苗，尤其在疫苗菌液增菌培养方面还有待进一步提高。
近几年，从传统的常规疫苗的生产和研究来看，各厂家在菌种、生产工艺方面都比较下功夫，对培养基材料的选择和工艺改进上也做了很多探讨和尝试。从最初的用新鲜的动物组织制备马丁肉汤，到用碎肉浸出直煮法制备，后来发展到干粉合成马丁肉汤培养基。
杨红云等(使用马丁干粉培养基生产猪肺疫活疫苗，中国兽药杂志，2002年第7期，44-45)，指出使用马丁干粉培养基可降低成本，增加效益，但其使用的干粉培养基存在灭菌后有沉淀，划线选菌和活菌计数时不易看清的问题；王春华(合成马丁汤培养基中添加葡萄糖对猪肺疫巴氏杆菌培养菌数影响试验，现代畜牧兽医，2012年第6期，62-63)，指出在合成马丁培养基中添加适量的葡萄糖，对猪肺疫巴氏杆菌增菌效果明显，但培养出的菌苗冻干后存活率明显降低；公告号为CN107312733A的专利申请，提供了一种多杀性巴氏杆菌混合培养方法，主要从培养条件方面着手增加菌液中的菌数，里面未提及所用培养基的成分。
发明内容
本发明提供一种猪肺疫疫苗增菌培养基，解决了现有技术中培养基灭菌后有沉淀、培养菌数低、菌苗冻干存活率低的技术问题。
本发明是这样实现的：培养基包括以下重量份的原料：肉肝胃膜消化液粉10.0-20.0g、蛋白胨5.0-10.0g、NaCl 3.0-5.0g、牛胰脏消化物7.0-9.0g和生长促进因子0.5-1.0g，纯化水加至1000ml。
作为一种优选的实施方案，包括以下重量份的原料：肉肝胃膜消化液粉20.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、牛胰脏消化物8.0g和生长促进因子1.0g，纯化水加至1000ml。
作为一种优选的实施方案，所述生长促进因子包括氨基酸、盐离子和微量元素中的至少一种。
作为一种优选的实施方案，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.001-0.003g，对氨基苯甲酸0.001-0.003g。
作为一种优选的实施方案，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.4g，NH4Cl 0.03g。
作为一种优选的实施方案，所述磷酸氢二钾0.1-0.5g，磷酸二氢钾0.1-0.5g，NH4Cl 0.01-0.05g。
作为一种优选的实施方案，所述微量元素包括烟酸、泛酸钙和生物素。
作为一种优选的实施方案，所述烟酸0.0001-0.001g，所述泛酸钙为0.0001-0.001，所述生物素为0.0001-0.001g。
作为一种优选的实施方案，所述培养基pH为7.2-7.6。
本发明的有益效果：蛋白胨为微生物生长提供多种氮源；肉肝胃膜消化液粉含有丰富的游离氨基酸、多肽、维生素、核苷酸及微量元素等，各种营养成分含量丰富，比例协调，可为微生物发酵培养提供全面的营养；NaCl维持稳定的渗透压；另外为了促进菌体生长繁殖，培养基中还特意增加了牛胰脏消化物和生长促进因子。
本发明的组分配比灭菌后澄清、促进菌体增殖、使培养菌菌数高、提高菌体冻干存活率，实现批次间质量稳定，操作简便。
具体实施方式
下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种猪肺疫疫苗增菌培养基，包括以下重量份的原料，肉肝胃膜消化液粉10.0g、蛋白胨5.0g、NaCl 3.0g、牛胰脏消化物7.0和生长促进因子0.5g，纯化水加至1000ml。
其中生长促进因子包括氨基酸、微量盐离子和微量元素，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.001g和对氨基苯甲酸0.001g，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.2674g，磷酸二氢钾0.2000g、NH4Cl 0.01g、硫酸镁0.01g和硫酸锌0.01g，所述微量元素包括烟酸0.0002g、泛酸钙0.0002g、生物素0.0002g。
基制备方法：将用于制备猪肺疫疫苗培养基的所有原料，加入到纯化水中，充分溶解后，121℃灭菌15分钟，备用。
实施例二
一种猪肺疫疫苗增菌培养基，包括以下重量份的原料，肉肝胃膜消化液粉15.0g、蛋白胨8.0g、NaCl 4.0g、牛胰脏消化物9.0和生长促进因子0.8g，纯化水加至1000ml。
其中生长促进因子包括氨基酸、微量盐离子和微量元素，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.003g和对氨基苯甲酸0.003g，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.3437g，磷酸二氢钾0.3000g、NH4Cl 0.05g、硫酸镁0.05g和硫酸锌0.05g，所述微量元素包括烟酸0.0001g、泛酸钙0.0001g、生物素0.0001g。
基制备方法：将用于制备猪肺疫疫苗培养基的所有原料，加入到纯化水中，充分溶解后，121℃灭菌15分钟，备用。
实施例三
一种猪肺疫疫苗增菌培养基，包括以下重量份的原料，肉肝胃膜消化液粉20.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、牛胰脏消化物8.0和生长促进因子1.0g，纯化水加至1000ml。
其中生长促进因子包括氨基酸、微量盐离子和微量元素，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.002g和对氨基苯甲酸0.002g，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.4g、NH4Cl 0.03g、硫酸镁0.033g和硫酸锌0.03g，所述微量元素包括烟酸0.001g、泛酸钙0.001g、生物素0.001g。
基制备方法：将用于制备猪肺疫疫苗培养基的所有原料，加入到纯化水中，充分溶解后，121℃灭菌15分钟，备用。
实施例四
一种猪肺疫疫苗增菌培养基，包括以下重量份的原料，肉肝胃膜消化液粉12g、蛋白胨7.0g、NaCl 4.2g、牛胰脏消化物7.5g和生长促进因子0.558g，纯化水加至1000ml。
其中生长促进因子包括氨基酸、微量盐离子和微量元素，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.002g和对氨基苯甲酸0.003g，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.3g、NH4Cl 0.05g、硫酸镁0.05g和硫酸锌0.05g，所述微量元素包括烟酸0.001g、泛酸钙0.001g、生物素0.001g。
基制备方法：将用于制备猪肺疫疫苗培养基的所有原料，加入到纯化水中，充分溶解后，121℃灭菌15分钟，备用。
实施例五
一种猪肺疫疫苗增菌培养基，包括以下重量份的原料，肉肝胃膜消化液粉15g、蛋白胨6.5g、NaCl 3.5g、牛胰脏消化物8.5g和生长促进因子0.690g，纯化水加至1000ml。
其中生长促进因子包括氨基酸、微量盐离子和微量元素，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.003g和对氨基苯甲酸0.003g，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.4315g，磷酸二氢钾0.1g、NH4Cl 0.05g、硫酸镁0.05g和硫酸锌0.05g，所述微量元素包括烟酸0.0009g、泛酸钙0.0007g、生物素0.0009g。
基制备方法：将用于制备猪肺疫疫苗培养基的所有原料，加入到纯化水中，充分溶解后，121℃灭菌15分钟，备用。
效果实验
将合成干粉培养基对猪多杀性巴氏杆菌进行增菌试验，结果如下。
A实验用菌株
猪多杀性巴氏杆菌EO630株(CVCC1765)，由中国兽医药品监察所(以下简称中监所)提供。
B种子液制备
开启1支冻干的猪多杀性巴氏杆菌EO630株，用1.0ml的马丁肉汤稀释，接种于血平板，37℃培养24h，再挑单菌落划线接种于含4％血清和0.1％-1％全血的马丁琼脂平板，37℃培养18-22h后，选取在低倍镜45度折光条件下带蓝绿色荧光、边缘有红黄色光带的菌落5-10个，接种于1支血斜面，37℃培养24h，放2-8℃保存，作为基础种子备用，该种子保存不应超过1个月。取一级种子接种于马丁肉汤培养基，37℃培养20～22h，纯粹检查合格后，作为种子液(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二零零零年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。
C菌液培养及判定
将种子液按2％接种装有200ml液体培养基的500ml三角瓶1个，37℃、150r/min振荡培养13～15小时，同时设1个不接种阴性对照。分别取样按现行《中国兽药典》附录进行活菌计数，重复三次。菌数应不低于140×108CFU/ml，且阴性对照应无菌生长。增菌效果见表1。
表1合成干粉培养基对猪多杀性巴氏杆菌的增菌效果
Figure BDA0002344598990000051
由表1可见，实施例一至实施例五的活菌均不低于140×108CFU/ml，均能满足要求。实施例一制成的增菌培养基中，三个批次平均活菌数为162×108CFU/ml，实施例二制成的增菌培养基中，三个批次平均活菌数为205×108CFU/ml，实施例三制成的增菌培养基中三批次活菌数分别达282×108CFU/ml、280×108CFU/ml、289×108CFU/ml，三次重复均超过了280×108CFU/ml，实施例四制成的增菌培养基中，三个批次平均活菌数为272×108CFU/ml，实施例五支制成的增菌培养基中，三个批次平均活菌数为238×108CFU/ml，可见增菌效果显著。
冻干效果试验
将不同批次用实施例三的配方和马丁肉汤培养出的菌液，进行离心(3500r/min离心20分钟)倒掉上清液，收集菌体，将菌泥用保护剂稀释(取80ml菌液，离心后加40ml奶粉)，分装后(每瓶装0.5ml)进行冷冻，然后计数(以每毫升中所含CFU计)。结果如下表2。
表2用合成干粉培养基培养出的猪多杀性巴氏杆菌的冻干效果
Figure BDA0002344598990000061
由表2可见，用传统马丁肉汤培养出的猪多杀性巴氏杆菌的冻干率最高为61.3％，三批用实施例三培养基培养出的猪多杀性巴氏杆菌冻干率分别为78.3％、85.1％和83.2％，均明显高于马丁肉汤。可见，本专利配方有提高菌体冻干率的有益效果。
安全实验
选用实施例三所得的培养基作为A组，马丁肉汤作为B组，培养同批次的猪多杀性巴氏杆菌EO630株，并对上述培养基、马丁肉汤培养所得的菌株进行安全实验。
步骤：用实施例三合成培养基和马丁肉汤培养基均培养同批次猪多杀性巴氏杆菌EO630株菌液，经3500r/min离心20分钟，弃上清液，沉淀菌体用适量马丁肉汤悬浮后，用含0.1％裂解血细胞全血及4％健康动物血清的马丁琼脂平板进行活菌计数。并进一步将悬浮菌液用20％氢氧化铝生理盐水稀释至30×108CFU活菌/ml(兽药典规定每头份活菌不少于3.0*108CFU，安全试验要求注射1.0ml，含10头份菌量，所以稀释至30×108CFU活菌/ml)。
选取2只体重1.5-2.0kg的健康兔子，各皮下注射1.0ml上述稀释的菌液。实施例三合成培养基和马丁肉汤培养基培养的各3批菌液分别注射2只兔子，观察10日，记录存活情况，结果见表3。
表3两种培养基培养菌体安全实验结果
Figure BDA0002344598990000071
由表3可看出，实施例三培养基培养的菌体对兔安全，每个重复均达到2/2的存活率。
效力实验
选用实施例三所得的培养基、马丁肉汤分别培养同批次的猪多杀性巴氏杆菌EO630株，并对上述培养所得的菌株进行效力实验。
步骤：用实施例三合成培养基和马丁肉汤均培养同批次猪多杀性巴氏杆菌EO630株，经3500r/min离心20分钟，弃上清，沉淀菌体用适量20％铝胶生理盐水悬浮后，进行活菌计数。
并进一步将悬浮菌液用20％氢氧化铝生理盐水稀释至5.0×107CFU活菌/ml(效力试验要求每0.2ml含1/30头份，即每0.2ml含107CFU，所以每ml应含5*107CFU)。
实施例三合成培养基培养的三个批次的稀释菌液分别皮下注射小鼠10只，体重16～18g，0.2ml/只，所含活菌量为1.0×107CFU/0.2ml，作为A组。
马丁肉汤培养的三个批次的稀释菌液分别皮下注射小鼠10只，体重16～18g，0.2ml/只，含有1.0×107CFU活菌/0.2ml，作为B组，A组与B组组成免疫组。
14日后，选取16～18g的小鼠6只，不免疫，作为未免疫组。选取未免疫组的3只小鼠和免疫组的所有小鼠各皮下注射2MLD的多杀性巴氏杆菌C44-8株(CVCC44408)强毒菌液，该3只小鼠作为C组。未免疫组的另3只对照小鼠注射1MLD的强毒菌液，作为D组，观察10日，记录存活情况，结果见表4。
表4
Figure BDA0002344598990000072
Figure BDA0002344598990000081
由表3可看出，实施例三所得的培养基培养的菌体对小鼠免疫大部分可达10/10保护，免疫效果优于马丁肉汤，
上述安全性试验和免疫保护率试验结果显示，合成培养基培养安全性及免疫原性良好。
本发明的有益效果：蛋白胨为微生物生长提供多种氮源；肉肝胃膜消化液粉含有丰富的游离氨基酸、多肽、维生素、核苷酸及微量元素等，各种营养成分含量丰富，比例协调，可为微生物发酵培养提供全面的营养；NaCl维持稳定的渗透压；另外培养基中还特意增加了牛胰脏消化物和生长促进因子，能够有效地促进菌体生长繁殖。
本发明的组分配比培养基灭菌后澄清、促进菌体增殖、使培养菌菌数高、提高菌体冻干存活率、实现批次间质量稳定，操作简便。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，包括以下重量份的原料：肉肝胃膜消化液粉10.0-20.0g、蛋白胨5.0-10.0g、NaCl 3.0-5.0g、牛胰脏消化物7.0-9.0g和生长促进因子0.5-1.0g，纯化水加至1000ml。
2.根据权利要求1所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，包括以下重量份的原料：肉肝胃膜消化液粉20.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、牛胰脏消化物8.0g和生长促进因子1.0g，纯化水加至1000ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述生长促进因子包括氨基酸、盐离子和微量元素中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述氨基酸包括L-谷氨酸0.001-0.003g，对氨基苯甲酸0.001-0.003g。
5.根据权利要求3所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述微量盐离子包括磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.4g，NH4Cl 0.03g。
6.根据权利要求5所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述磷酸氢二钾0.1-0.5g，磷酸二氢钾0.1-0.5g，NH4Cl 0.01-0.05g。
7.根据权利要求3所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述微量元素包括烟酸、泛酸钙和生物素。
8.根据权利要求7所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述烟酸0.0001-0.001g，所述泛酸钙为0.0001-0.001，所述生物素为0.0001-0.001g。
9.权利要求1-8任一所述的一种猪肺疫疫苗增菌培养基，其特征在于，所述培养基pH为7.2-7.6。
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