CN113943686B - 猪多杀性巴氏杆菌eo630株的培养基、培养方法以及培养物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养基、培养方法以及培养物的应用，该培养基按质量百分比计，包括如下组分：酵母浸粉2～3％、牛肉浸粉2～3％、蛋白胨1～1.5％、葡萄糖0.6～0.8％、氯化钠0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.2～0.5％、磷酸氢二钠0.5～0.8％，余量水。本发明的猪多杀性巴氏杆菌培养基可在适宜环境下实现猪多杀性巴氏杆菌的通气发酵培养，且发酵培养时间短(仅需14～16h)，其活菌数可达到170～200×108CFU/ml，具有极好的产业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养基、培养方法以及培养物的应用。
背景技术
猪巴氏杆菌病(Swine pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起猪的一种散发性、热性传染病,也称“猪肺疫”、“锁喉风”或“肿脖子病”，主要引起猪咽喉肿胀、呼吸困难、急性败血症和肺炎等症状。该病是猪的一种常见传染病,一年四季均可发生，病菌寄生于鼠和其他啮齿动物，对多种动物和人均有致病性，以猪最易感染，无明显季节性发生，但以潮湿，多雨发生较多，营养不良、长途运输、饲养条件改变、不良等因素促进本病发生，经常集中发病。其特征是最急性型呈败血症和咽炎由于喉炎；急性型呈纤维素性胸膜肺炎；慢性型较少见，主要表现慢性肺炎。
多杀性巴氏杆菌疫苗对治疗猪巴氏杆菌病起到了重要的作用。大量生长繁殖猪多杀性巴氏杆菌，使其生长的活菌是制备高质量疫苗的关键。目前，一般使用马丁肉汤、改良马丁肉汤培养等培养猪多杀性巴氏杆菌。这些培养基的配制工艺复杂，包括购肉、冷库保存、剔选、绞碎、保温消化、提清过滤等工序，需要消耗大量的人力、物力，且生产周期较长，并受肉品质的影响而影响培养基质量的稳定性，进而影响疫苗的品质。猪多杀性巴氏杆菌繁殖能力与细菌菌株、培养基组成有关，还与培养温度、pH值、培养时间等培养条件相关。因此，研究适合猪多杀性巴氏杆菌生长繁殖培养基及其培养方法具有十分重要的现实意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养基、培养方法以及培养物的应用，该培养基培养时间短且能够促进猪多杀性巴氏杆菌高产活菌数。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株培养基，该培养基按质量百分比计，包括如下组分：酵母浸粉2～3％、牛肉浸粉2～3％、蛋白胨1～1.5％、葡萄糖0.6～0.8％、氯化钠0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.2～0.5％、磷酸氢二钠0.5～0.8％，余量水。
培养基的制备方法包括下述步骤：按照上述培养基组成称取所需量的组份，均匀混合后，加入适量的注射用水，充分溶解后，用2N氢氧化钠溶液调pH值7.5～7.7，再加入注射用水定容，116℃灭菌40min，即得。
本发明的培养基含有牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾等商品化生物化学试剂，具有培养基组成成份获取方便，且其培养方法具有工艺简便、质量稳定、生产周期短、制造成本低等优点。
优选地，按质量百分比计，该培养基包括如下组分：酵母浸粉2.2～2.7％、牛肉浸粉2.3～2.6％、蛋白胨1.2～1.4％、葡萄糖0.7～0.75％、氯化钠0.15～0.25％、磷酸二氢钾0.3～0.4％、磷酸氢二钠0.6～0.7％，余量水。
本发明第二方面提供一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养方法，该培养方法包括如下步骤：
S1、将猪多杀性巴氏杆菌EO630株稀释接种于含0.1～0.2％裂解全血及3～5％健康动物血清的平板上，在35～37℃下培养16～24h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的一级种子；所用平板为马丁琼脂平板；
S2、将猪多杀性巴氏杆菌EO630株的一级种子接种于培养基中，在36～37℃下培养18～20h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；
S3、按照70～75v/v％在发酵罐中加入培养基，以培养基体积计，加入0.1～0.2v/v％的消泡剂，灭菌后，将培养基降至30～35℃，再按1～3v/v％的接种量接种猪多杀性巴氏杆菌的二级种子，在36～37℃下和pH值7.2～7.5下培养14～16h，制得猪多杀性巴氏杆菌的发酵培养物。
其中，所述培养基为上述的培养基。
本发明利用上述的培养基在适宜环境下实现猪多杀性巴氏杆菌的通气发酵培养，且相较于改良马丁汤培养基(培养时间为16～20h)的发酵培养时间短(仅需14～16h)，其活菌数可达到170～200×108CFU/ml，具有极好的产业应用价值。
优选地，步骤S3中，所述培养基的pH值为7.0～7.8。
优选地，步骤S3中，采用通气培养方法进行培养。
本发明第三方面提供一种由上述的培养方法培养得到的发酵培养物在制备药物或疫苗中的应用。
本发明的猪多杀性巴氏杆菌菌液制成疫苗，可用于预防和治疗由猪多杀性巴氏杆菌引起的相关疾病。
具体地，所述发酵培养物在2～8℃条件下密封放置3～7日后使用。
进一步具体地，将冻干保护剂与所述发酵菌液以1:(6～8)的比例混合后进行冻干即得。
更进一步地，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖的混合物，混合后，明胶的质量分数为1～2％，蔗糖的质量分数为4～6％。
通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
1、本发明改进猪多杀性巴氏杆菌的培养基组成，培养基含有牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾等商品化生物化学试剂，具有培养基组成成份获取方便，且其培养方法具有工艺简便、质量稳定、生产周期短、制造成本低等优点。
2、本发明的猪多杀性巴氏杆菌培养基可在适宜环境下实现猪多杀性巴氏杆菌的通气发酵培养，且相较于改良马丁汤培养基(培养时间为16～20h)的发酵培养时间短(仅需14～16h)，其活菌数可达到170～200×108CFU/ml，具有极好的产业应用价值。
3、本发明的猪多杀性巴氏杆菌菌液制成疫苗，可用于预防由猪多杀性巴氏杆菌引起的相关疾病。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下实施例中，牛肉浸粉(LAB～LEMCO POWDER)购自英国Thermo FisherScientific，货号为LP0129；酵母浸粉购自湖北安琪酵母股份有限公司，货号FM888；蛋白胨购自湖北安琪酵母股份有限公司，货号FP328；葡萄糖购自上海国药集团化学试剂有限公司，货号10010518；氯化钠购自上海国药集团化学试剂有限公司，货号10019318；磷酸二氢钾购自上海国药集团化学试剂有限公司，货号10017518；十二水合磷酸氢二钠购自上海国药集团化学试剂有限公司，货号10010318；改良马丁肉汤干粉培养基购自北京奥博星有限公司生物技术，批号为201816；猪多杀性巴氏杆菌EO630株由哈药集团生物疫苗有限公司鉴定、保管和供应。
实施例1
S1、将酵母浸粉2g、牛肉浸粉2g、蛋白胨1g、葡萄糖0.6g、氯化钠0.1g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠0.5g均匀混合后，加入适量的注射用水，充分溶解后，用2N氢氧化钠溶液调pH值7.5～7.7，再加入注射用水定容至100ml，116℃灭菌40min，即得。
S2、测定装有猪多杀性巴氏杆菌EO630株安瓶的真空度，开安瓶将菌株接种于含0.1％裂解全血的步骤S1制得的培养基中，35～37℃下培养16小时，用十倍系列稀释法稀释培养物，选适当稀释培养物接种于含0.1％裂解全血及3％健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，35～37℃下培养16小时。选取中等大小一致菌落8个，划线接种于鲜血琼脂斜面若干支，35～37℃下培养16小时，经检验纯粹合格后作为一级种子。2～8℃保存，使用不超过14天。鲜血琼脂斜面上传代不超过5代。
S3、取一级种子一支或种子批一瓶接种于5000ml血清瓶(内装3500ml步骤S1制得的培养基)中36～37℃下培养18h，经检验纯粹，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；镜检菌体形态符合《兽用生物制品规程》标准，细菌计数达8亿/ml马力以上即为生产种子。2～8℃保存，使用不得超过72小时。
S3、按发酵罐容积的70％(v/v)加入步骤S1制得的培养基，以培养基体积计，加入0.1％(v/v)的消泡剂，116℃高压蒸汽灭菌40min，将培养基降至30℃，再按1％(v/v)接种量接入二级种子，通气培养，在36～37℃下和pH值7.2～7.5下培养14h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的发酵培养物。
S4、发酵培养物在2～8℃条件下密封放置3日后，与冻干保护剂以6:1的比例混合后进行冻干，制得疫苗。
实施例2
S1、将酵母浸粉3g、牛肉浸粉3g、蛋白胨1.5g、葡萄糖0.8g、氯化钠0.3g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钠0.8g均匀混合后，加入适量的注射用水，充分溶解后，用2N氢氧化钠溶液调pH值7.5～7.7，再加入注射用水定容至100ml，116℃灭菌40min，即得。
S2、测定装有猪多杀性巴氏杆菌EO630株安瓶的真空度，开安瓶将菌株接种于含0.1％裂解全血的步骤S1制得的培养基中，35～37℃培养24小时，用十倍系列稀释法稀释培养物，选适当稀释培养物接种于含0.2％裂解全血及5％健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，35～37℃下培养24小时。选取中等大小一致菌落10个，划线接种于鲜血琼脂斜面若干支，35～37℃培养24小时，经检验纯粹合格后作为一级种子。2～8℃保存，使用不超过14天。鲜血琼脂斜面上传代不超过5代。
S3、取一级种子一支或种子批一瓶接种于5000ml血清瓶(内装3500ml的培养基)中36～37℃下培养20h，经检验纯粹，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；镜检菌体形态符合《兽用生物制品规程》标准，细菌计数达8亿/ml马力以上即为生产种子。2～8℃保存，使用不得超过72小时。
S3、按发酵罐容积的75％(v/v)加入步骤S1制得的培养基，以培养基体积计，加入0.2％(v/v)的消泡剂，116℃高压蒸汽灭菌40min，将培养基降至35℃，再按3％(v/v)接种量接入二级种子，通气培养，在36～37℃下和pH值7.2～7.5下培养16h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的发酵培养物。
S4、发酵培养物在2～8℃条件下密封放置7日后，与冻干保护剂以8:1的比例混合后进行冻干，制得疫苗。
实施例3
S1、将酵母浸粉2.2g、牛肉浸粉2.3g、蛋白胨1.2g、葡萄糖0.7g、氯化钠0.15g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠0.6g均匀混合后，加入适量的注射用水，充分溶解后，用2N氢氧化钠溶液调pH值7.5～7.7，再加入注射用水定容至100ml，116℃灭菌40min，即得。
S2、测定装有猪多杀性巴氏杆菌EO630株安瓶的真空度，开安瓶将菌株接种于含0.1％裂解全血的步骤S1制得的培养基中，35～37℃培养18小时，用十倍系列稀释法稀释培养物，选适当稀释培养物接种于含0.1％裂解全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，35～37℃下培养18小时。选取中等大小一致菌落9个，划线接种于鲜血琼脂斜面若干支，35～37℃培养18小时，经检验纯粹合格后作为一级种子。2～8℃保存，使用不超过14天。鲜血琼脂斜面上传代不超过5代。
S3、取一级种子一支或种子批一瓶接种于5000ml血清瓶(内装3500ml的培养基)中36～37℃下培养19h，经检验纯粹，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；镜检菌体形态符合《兽用生物制品规程》标准，细菌计数达8亿/ml马力以上即为生产种子。2～8℃保存，使用不得超过72小时。
S3、按发酵罐容积的70％(v/v)加入步骤S1制得的培养基，以培养基体积计，加入0.1％(v/v)的消泡剂，116℃高压蒸汽灭菌40min，将培养基降至33℃，再按1～3％(v/v)接种量接入二级种子，通气培养，在36～37℃下和pH值7.2～7.5下培养15h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的发酵培养物。
S4、发酵培养物在2～8℃条件下密封放置5日后，与冻干保护剂以7:1的比例混合后进行冻干，制得疫苗。
实施例4
S1、将酵母浸粉2.7g、牛肉浸粉2.6g、蛋白胨1.4g、葡萄糖0.75g、氯化钠0.25g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钠0.7g均匀混合后，加入适量的注射用水，充分溶解后，用2N氢氧化钠溶液调pH值7.5～7.7，再加入注射用水定容至100ml，116℃灭菌40min，即得。
S2、测定装有猪多杀性巴氏杆菌EO630株安瓶的真空度，开安瓶将菌株接种于含0.1％裂解全血的步骤S1制得的培养基中，35～37℃培养20小时，用十倍系列稀释法稀释培养物，选适当稀释培养物接种于含0.2％裂解全血及5％健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，35～37℃下培养20小时。选取中等大小一致菌落10个，划线接种于鲜血琼脂斜面若干支，35～37℃培养20小时，经检验纯粹合格后作为一级种子。2～8℃保存，使用不超过14天。鲜血琼脂斜面上传代不超过5代。
S3、取一级种子一支或种子批一瓶接种于5000ml血清瓶(内装3500ml的培养基)中36～37℃下培养20h，经检验纯粹，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；镜检菌体形态符合《兽用生物制品规程》标准，细菌计数达8亿/ml马力以上即为生产种子。2～8℃保存，使用不得超过72小时。
S3、按发酵罐容积的75％(v/v)加入步骤S1制得的培养基，以培养基体积计，加入0.2％(v/v)的消泡剂，116℃高压蒸汽灭菌40min，将培养基降至30℃，再按2％(v/v)接种量接入二级种子，通气培养，在36～37℃下和pH值7.2～7.5下培养16h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的发酵培养物。
S4、发酵培养物在2～8℃条件下密封放置6日后，与冻干保护剂以8:1的比例混合后进行冻干，制得疫苗。
对比例
S1、将先将纯化水加热至80℃以上，按照购买的成品培养基改良马丁肉汤干粉培养基(北京奥博星生物技术有限公司)的配制说明，称取100g培养基干粉，倒入培养基配制桶中，加热水使其融化，在加水的过程中不停搅拌，水加至100ml，根据其融化程度，适当延长搅拌时间，直至完全融化为止。
S2、测定装有猪多杀性巴氏杆菌EO630株安瓶的真空度，开安瓶将菌株接种于含0.1％裂解全血的步骤S1制得的培养基中，35～37℃培养20小时，用十倍系列稀释法稀释培养物，选适当稀释培养物接种于含0.2％裂解全血及5％健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，35～37℃下培养20小时。选取中等大小一致菌落10个，划线接种于鲜血琼脂斜面若干支，35～37℃培养20小时，经检验纯粹合格后作为一级种子。2～8℃保存，使用不超过14天。鲜血琼脂斜面上传代不超过5代。
S3、取一级种子一支或种子批一瓶接种于5000ml血清瓶(内装3500ml的S1培养基)中36～37℃下培养20h，经检验纯粹，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；镜检菌体形态符合《兽用生物制品规程》标准，细菌计数达8亿/ml马力以上即为生产种子。2～8℃保存，使用不得超过48小时。
S3、按发酵罐容积的75％(v/v)加入步骤S1制得的培养基，以培养基体积计，加入0.2％(v/v)的消泡剂，116℃高压蒸汽灭菌40min，将培养基降至30℃，再按2％(v/v)接种量接入二级种子，通气培养，在36～37℃下和pH值7.2～7.5下培养20h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的发酵培养物。
S4、发酵培养物在2～8℃条件下密封放置6日后，与冻干保护剂以8:1的比例混合后进行冻干，制得疫苗。
性能检测
1、发酵培养物活菌数的检测
检验方法：取实施例1-实施例4和对比例制得的发酵培养物，按《中华人民共和国兽药典》三部附录计数。菌落计算及结果判定：肉眼观察菌落，并在平板底面点数，算出3个平板的平均菌落数，即为每毫升原液所含的总菌数。如有片状菌落生长或同一稀释度的不同平板间菌落相差50％以上时，应重检。
实施例1至实施例4和对比例中制得猪多杀性巴氏杆菌的发酵培养物中活菌数分别为170×108CFU/ml、200×108CFU/ml、183×108CFU/ml、191×108CFU/ml、82×108CFU/ml。
2、疫苗安全检验
用体重1.5-2kg的健康家兔25只，分为5组，每组5只，分别取实施例和对比例每组疫苗3瓶样品混合，按瓶签注明头份稀释成10头份/ml，用3％碘酒消毒试验兔注射部位皮肤(如大腿内侧)，再用75％酒精棉脱碘，用2.0ml注射器每只兔皮下注射1.0ml。观察10日，注射实施例1至实施例4疫苗的家兔均健活，注射对比例疫苗的家兔死亡1只。
3、疫苗效力试验
效力检验：下列方法任择其一。
用小鼠检验：16～18g小鼠共86只，分为5组，每组16只，另有6只对照。操作方法及结果判定：取实施例1-实施例4和对比例的疫苗样品1瓶，将疫苗按瓶签注明头份稀释为0.2ml(含1/30头份)，用75％酒精棉球消毒试验鼠(10只)注射部位皮肤，每只皮下免疫注射0.2ml。14日后，连同条件相同的对照小鼠3只，各皮下注射多杀性巴氏杆菌C44-8株(CVCC44408)强毒菌液2MLD，另用对照小鼠3只，各皮下注射1MLD，攻毒时计算方法见《细菌制品效力检验攻毒计算标准操作程序》。观察10天，攻击2MLD的对照小鼠全部死亡，攻击1MLD的对照小鼠死亡2只，注射实施例1-实施例4疫苗的免疫小鼠菌存活，注射对比例疫苗的免疫小鼠死亡5只。
用兔检验：1.5～2kg兔共22只，分为5组，每组4只，2只对照，物质量标准应符合中华人民共和国兽药典《生产检验用动物标准》。兔的饲养管理按《实验兔饲养管理程序》进行。操作方法及结果判定：取样品1瓶，将疫苗按瓶签注明头份稀释为1/3头份/ml，用3％碘酒消毒试验兔注射部位皮肤(如大腿内侧)，再用酒精棉脱碘，给每组兔分别注射实施例1-实施例4和对比例的疫苗，每只1.0ml。接种14日后，连同条件相同的对照兔2只，各皮下注射多杀性巴氏杆菌C44-8株(CVCC44408)强毒菌液80～100CFU活菌，攻毒时计算方法见《细菌制品效力检验攻毒计算标准操作程序》。观察10日，对照兔应全部死亡，实施例1-实施例4疫苗的免疫兔全部存活，注射对比例的疫苗免疫兔死亡2只。
用猪检验：用断奶1个月后、体重约20kg的健康易感猪28头，分为5组，每组5头，另2头为对照。动物质量标准应符合中华人民共和国兽药典《生产检验用动物标准》，猪的饲养管理应按《检验猪饲养管理程序》进行。取实施例1-实施例4和对比例的疫苗样品1瓶，将疫苗按瓶签注明头份稀释为1头份/ml，用3％碘酒消毒试验猪注射部位皮肤(如耳后颈部)，各皮下注射1.0ml，接种14日后，连同条件相同的对照猪3头，每头猪皮下注射的多杀性巴氏杆菌C44-1(CVCC44401)强毒菌液1MLD，攻毒时计算方法见《细菌制品效力检验攻毒计算标准操作程序》。观察10日，对照猪全部死亡时，注射施例1-实施例4疫苗的免疫猪全部存活，注射对比例疫苗的免疫猪死亡1头。
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (4)
1.一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株培养基，其特征在于，按质量百分比计，包括如下组分：酵母浸粉2.2~2.7%、牛肉浸粉2.3~2.6%、蛋白胨1.2~1.4%、葡萄糖0.7~0.75%、氯化钠0.15~0.25%、磷酸二氢钾0.3~0.4%、磷酸氢二钠0.6~0.7%，余量水。
2.一种猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将猪多杀性巴氏杆菌EO630株稀释接种于含0.1~0.2%裂解全血及3~5%健康动物血清的平板上，在35~37℃下培养16~24h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的一级种子；
S2、将猪多杀性巴氏杆菌EO630株的一级种子接种于培养基中，在36~37℃下培养18~20h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子；
S3、按照70~75v/v%在发酵罐中加入培养基，以培养基体积计，加入0.1~0.2v/v%的消泡剂，灭菌后，将培养基降至30~35℃，再按1~3v/v%的接种量接种猪多杀性巴氏杆菌EO630株的二级种子，在36~37℃下和pH值7.2~7.5下培养14~16h，制得猪多杀性巴氏杆菌EO630株的发酵培养物；
其中，所述培养基为根据权利要求1所述的培养基。
3.根据权利要求2所述的猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养方法，其特征在于，步骤S3中，所述培养基的pH值为7.0~7.8。
4.根据权利要求2所述的猪多杀性巴氏杆菌EO630株的培养方法，其特征在于，步骤S3中，采用通气培养方法进行培养。
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