CN104645324A - 一种猪支原体肺炎疫苗株的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的猪支原体肺炎疫苗株的应用，该猪支原体肺炎疫苗株在制备以及治疗猪支原体肺炎的兽药中的应用；所述的猪支原体肺炎疫苗株，其分类命名为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae），菌株号为CJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日。本发明的灭活疫苗所用的菌株是从国内商品猪上分离得到的，该菌株具有高的生长滴度对和良好的免疫原性；本发明的灭活疫苗制备工艺简单，安全有效，能够有效预防猪支原体肺炎疾病的发生。

Description

一种猪支原体肺炎疫苗株的应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，涉及一种新的猪支原体肺炎疫苗株的应用。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)继发感染。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场都有发生。由于带菌病猪的存在和分布较广，通常会引起猪群生产性能显著下降，受感染猪群日增重下降，饲料报酬降低，上市时间延迟，猪群生长均匀度较差，药物治疗成本增加，因而给猪场造成较为严重的经济损失。由国内外临床经验可知，接种疫苗，能够显著的降低猪肺炎病变程度，降低饲养成本，是一种比较可行的预防方法。

为了减少猪支原体肺炎对养猪业造成的损失，国内外许多学者进行了广泛研究，并取得了一定的成果。目前，国内自主研发的猪支原体肺炎疫苗只有弱毒疫苗，该疫苗由于需要胸腔接种，所以不易于推广普及，而国外已有多家兽药公司研发生产了猪支原体肺炎灭活疫苗，并在国内市场上销售，灭活疫苗可以通过肌肉注射进行接种，易于操作。由于国内无自主研发的猪支原体肺炎灭活疫苗，市场上均依赖进口，可进口疫苗价格较为昂贵。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种猪支原体肺炎疫苗株的应用，该疫苗株用于猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药。本发明的灭活疫苗所用的菌株是从国内商品猪上分离得到的，对商品猪具有良好的免疫原性；本发明的灭活疫苗制备工艺简单，安全有效，能够有效预防猪支原体肺炎疾病的发生。

本发明所述的一种猪肺炎支原体疫苗株的应用，该猪支原体肺炎疫苗株在制备治疗猪支原体肺炎的兽药中的应用，将疫苗株接种培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活与佐剂混合制成，具体操作按下列步骤进行：

a、生产用种子制备：从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养基溶解，并按1∶10继代于改良Friis液体培养基中，放入温度36-38℃恒温培养箱中培养48-72小时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6.70-6.80时收取菌液，纯粹检验合格，作为一级种子液，再重复制备二级种子液和三级种子液；

b、制苗用菌液制备：将步骤a得到的三级种子液按1∶10加入改良Friis液体培养基中，密闭发酵罐罐口，通入无菌空气，罐内压力达到0.08MPa时，关闭发酵罐上所有进出口，保压，温度36-38℃培养2-3天，pH值降低至6.70-6.80时取样，进行纯粹检验和含菌量测定；

c、灭活：按步骤b中制备菌液总量的0.2％加入甲醛溶液，在温度36-38℃灭活2小时，再将灭活的菌液置温度2-8℃保存；

d、配苗：将步骤c中灭活的菌液与免疫佐剂混合，即得到猪支原体肺炎灭活疫苗，再将疫苗无菌定量分装后，加盖密封，粘贴标签，置温度2-8℃保存。

步骤a和步骤b中的改良Friis液体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成。

步骤d中所述的免疫佐剂为氢氧化铝胶、MONTANIDE ISA 206、ISA 11R、ISA 760、ISA 563或Gel 01。

本发明所述的猪支原体肺炎疫苗株的应用，所述的猪支原体肺炎疫苗株，于2010年在新疆昌吉某猪场分离鉴定获得的一株猪支原体肺炎疫苗株。其分类命名为猪肺炎支原体，菌株号为CJ株，已于2014年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.9909。

本发明所述的改良Friis固体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉10-15.0g，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成。

本发明所述的猪支原体肺炎疫苗株的应用，其有益效果为：

(1)菌株免疫原性好：本发明的猪支原体肺炎疫苗株是从国内商品猪上分离得到的新菌株，培养滴度高且具有良好的免疫原性，保证了疫苗的免疫效力。

(2)疫苗生产简便：该菌株在改良液体培养基上能够快速生长，菌液滴度高，适合于大生产；用甲醛灭活，灭活完全且时间短，且甲醛本身是一种防腐剂，用其来灭活兼顾了灭活和防腐，减少了用量以及对动物的不良反应；本发明的灭活疫苗中使用的免疫佐剂成分简单，制苗方法简便，简化了生产工艺，降低了生产污染的风险。

(3)疫苗安全有效：本发明的猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)经过安全检验和与同类进口疫苗进行效力比对试验，证明疫苗是安全的，免疫保护效力与进口疫苗没有差异。

总之，本发明的灭活疫苗免疫原性良好、生产简便、成本低廉，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

具体实施方式

通过下列实施例进一步说明本发明，而不限制本发明的范围；

实施例1：猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)的制备：

1 菌种：

1.1 制造本品用菌种为猪肺炎支原体CJ株(所述的猪支原体肺炎疫苗株，其分类命名为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，菌株号为CJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日)，检验用菌种为猪支原体肺炎肺组织毒，均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离、鉴定、保管和供应；

1.2 生产用菌种：

1.2.1 形态和生化特性：用液体培养物涂片，经姬母萨氏染色，在高倍镜下可见环状、短链状和两极状等典型的多形态，并具有代谢葡萄糖的生化特性；

1.2.2 培养特性：在改良Friis液体培养基中培养2-3日，呈轻度浑浊，在改良Friis固体培养基上培养7-10日，肉眼可见针尖大小的菌落，显微镜下观察为外周质地疏松、中央致密的圆形菌落，表面粗糙带有颗粒状；

1.2.3 生长抑制试验：吸取菌液涂布于改良Friis固体培养基上，置温度36-38℃使琼脂表面稍干燥，夹取浸猪肺炎支原体抗血清纸片贴于琼脂表面，培养14日后，分离菌株出现大于2.0mm的抑菌圈，其中所述的改良Friis固体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉10-15.0g，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成；

1.2.4 免疫原性：用3-4周龄健康易感仔猪10头，5头各耳后颈部深层肌肉注射猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)2ml，另5头不注射作为对照，在同等条件下隔离饲养，一免后14日，以相同途径与相同剂量进行二免，二免后14日，连同对照猪5头，各气管注射猪肺炎支原体肺组织毒，连续观察28日进行剖检，按28分评分法对每头猪肺炎病变进行评分肺炎病变减少率＝(对照猪肺炎算术平均分-免疫猪肺炎算术平均分)/对照猪肺炎算术平均分×100％，按上述公式计算免疫组猪的肺炎病变减少率，免疫组猪肺炎病变减少率不低于60％；

1.2.5 检验用菌种毒力：将猪支原体肺炎肺组织毒用无菌生理盐水稀释，气管注射健康易感仔猪5头，连续观察28日，部分仔猪出现咳嗽或腹式呼吸；攻毒28日进行剖检，患病猪出现典型的猪支原体肺炎肺部病变，在肺脏心叶、尖叶、膈叶前1/3部位以及中间叶，出现“肉样”或“胰样”实质样病变，界限明显；

2 疫苗制造及半成品检验：

2.1 生产用种子制备：

2.1.1 一级种子繁殖及鉴定：从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养基溶解，并按1∶10继代于改良Friis液体培养基中，放入温度36-38℃恒温培养箱中培养48-72小时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6.70-6.80时收取菌液，作为一级种子液，按《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹，在温度2-8℃保存，使用期应不超过7日，继代应不超过5代，其中改良Friis液体培养基为基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成；

2.1.2 二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按2.1.1项进行，在温度2-8℃保存，使用期应不超过7日；

2.1.3 三级种子繁殖及鉴定：取二级种子，按2.1.1项进行，在温度2-8℃保存，使用期应不超过7日；

2.2 制苗用菌液制备：

2.2.1 培养基改良Friis液体培养基，由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司制备和供应，是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成；

2.2.2 接菌及收获：将三级种子液按1∶10加入改良Friis液体培养基中，密闭发酵罐罐口，通入无菌空气，罐内压力达到0.08MPa时，关闭发酵罐上所有进出口，保压，温度36-38℃培养2-3日，pH值降低至6.70-6.80时取样，进行纯粹检验和含菌量测定；

2.2.3 纯粹检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌污染；

2.2.4 含菌量测定：含菌量不低于1.0×10⁹CCU/ml；

2.3 灭活：按制备菌液总量的0.2％加入甲醛溶液，在温度36-38℃灭活2小时，灭活的菌液置温度2-8℃保存；

2.4 半成品检验：

2.4.1 无菌检验：取灭活的菌液做无菌检验，按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长；

2.4.2 灭活检验：取灭活的菌液加入改良Friis液体培养基中，置于温度36-38℃恒温振荡培养箱中培养5-7日，培养物不变色，灭活检验合格；

2.5 疫苗制备：

2.5.1 氢氧化铝胶的配苗：将灭活的菌液与氢氧化铝胶佐剂按5∶1(体积比)混合，置温度2-8℃保存；其余的佐剂ISA 206、ISA 11R、ISA 760、ISA 563或Gel 01的配苗按照说明书进行配苗，如ISA 206，按抗原和佐剂重量比50∶50配苗，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中，用低剪切力搅拌器搅拌均一即可；ISA 11R，按抗原和佐剂重量比15∶85配苗，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中，用低剪切力搅拌器搅拌均一即可；ISA 760，按抗原和佐剂重量比15∶85配苗，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中，用高剪切力搅拌器搅拌均一即可。ISA 563，按抗原和佐剂重量比50∶50配苗，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中，用高剪切力搅拌器搅拌均一即可；Gel01，佐剂按5％-20％配苗，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中，用低剪切力搅拌器搅拌均一即可；

2.5.2分装：无菌定量分装后，加盖密封，粘贴标签；

3 成品检验：

3.1 性状：本品静置后，上层为淡黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液；

3.2 装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定；

3.3 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长；

3.4 安全性检验：用3-4周龄健康易感仔猪5头，耳后颈部深层肌肉注射猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)4ml/头，连续观察14日，均没出现由接种疫苗引起的不良反应和死亡；

3.5 效力检验：用3-4周龄健康易感仔猪10头，5头各耳后颈部肌肉注射猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)2ml，另5头不注射作为对照，在同等条件下隔离饲养，一免后14日，以相同途径与相同剂量进行二免，二免后14日，连同对照猪5头，各气管注射猪肺炎支原体肺组织毒，连续观察28日进行剖检，按28分评分法对每头猪肺炎病变进行评分；肺炎病变减少率＝(对照猪肺炎算术平均分-免疫猪肺炎算术平均分)/对照猪肺炎算术平均分×100％，按上述公式计算免疫组猪的肺炎病变减少率，免疫组猪肺炎病变减少率不低于60％；

3.6 甲醛残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行测定，均符合兽用生物制品通则的规定。

实施例2：猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)免疫效果观察

疫苗：猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)(氢氧化铝胶佐剂)，猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)(ISA 206)，猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)(ISA 11R)，猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)(ISA 760)，猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)(ISA 563)，猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)(Gel 01)，进口的猪支原体肺炎灭活疫苗；

检验用菌种：猪肺炎支原体肺组织毒，由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离、鉴定、保管和供应；

试验动物：3-4周龄不同品种健康易感仔猪，购自新疆天康畜牧科技有限公司；

试验设计：试验分为八组，第一组至第六组试验动物分别耳后颈部深层肌肉不同佐剂配成的猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)，依次为氢氧化铝胶佐剂、ISA 206、ISA 11R、ISA760、ISA 563、Gel 01，第七组免疫进口猪支原体肺炎灭活疫苗，2ml/头，第八组为对照组，不做任何处理；第一次免疫后的14日按照相同条件和途径进行第二次免疫；二免后14日，连同对照组，每头猪气管注射猪肺炎支原体肺组织毒；

临床症状观察：攻毒后，每组试验动物定时定点连续观察28日，对照组有咳嗽和腹式呼吸等临床症状；除个别猪出现轻微咳嗽和腹式呼吸症状外，免疫组基本没有出现典型猪支原体肺炎临床症状；

效力对比试验：攻毒28日，将所有试验动物处死并解剖，第一组到第七组猪肺炎病变减少率均不低于60％，运用Prism 5.0统计分析软件进行方差分析，不同佐剂配成的猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)与进口疫苗没有显著差异(P＞0.05)，具体肺炎病变得分见表1：

表1 试验组猪肺炎病变得分

注：(1)N/A(not Available)为不适用；

(2)a-b表示每组之间两两比较，字母相同者表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。

Claims (3)

1.一种猪支原体肺炎疫苗株的应用，其特征在于该猪支原体肺炎疫苗株在制备治疗猪支原体肺炎的兽药中的应用，将疫苗株接种培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活与佐剂混合制成，具体操作按下列步骤进行：

a、生产用种子制备：从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养基溶解，并按1∶10继代于改良Friis液体培养基中，放入温度36-38℃恒温培养箱中培养48-72小时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6.70-6.80时收取菌液，纯粹检验合格，作为一级种子液，再重复制备二级种子液和三级种子液；

b、制苗用菌液制备：将步骤a得到的三级种子液按1∶10加入改良Friis液体培养基中，密闭发酵罐罐口，通入无菌空气，罐内压力达到0.08MPa时，关闭发酵罐上所有进出口，保压，温度36-38℃培养2-3天，pH值降低至6.70-6.80时取样，进行纯粹检验和含菌量测定；

c、灭活：按步骤b中制备菌液总量的0.2%加入甲醛溶液，在温度36-38℃灭活2小时，再将灭活的菌液置温度2-8℃保存；

d、配苗：将步骤c中灭活的菌液与免疫佐剂混合，即得到猪支原体肺炎灭活疫苗，再将疫苗无菌定量分装后，加盖密封，粘贴标签，置温度2-8℃保存。

2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体疫苗株的应用，其特征在于步骤a和步骤b中的改良Friis液体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25%酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成。

3.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体疫苗株的应用，其特征在于步骤d中所述的免疫佐剂为氢氧化铝胶、MONTANIDE ISA 206、ISA 11R、ISA 760、ISA 563或Gel 01。