CN105012946A - 一种鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物疫苗制备技术领域,具体的说,是关于一种鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法,采用鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株抗原,经过蜂胶原液制备、生产用菌株制备、抗原液制备、活菌计数、灭活、超滤浓缩、疫苗安全性检验和效力检验,从而完成二联蜂胶灭活疫苗的制备。本发明的二联蜂胶灭活疫苗免疫效果好。
Description
技术领域
本发明属于动物疫苗制备技术领域,具体的说,是关于一种鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
鸭大肠杆菌病是鸭的常发病,主要侵害2周龄~6周龄的雏鸭或中鸭。发病鸭场—般卫生条件较差、潮湿,饲养密度过大,通风不良。发病以秋末和冬春多见,可引起败血症,因此也称鸭大肠杆菌败血症。
大肠杆菌(E.Coli)为革兰氏染色阴性杆菌,大小为2μm~3μm×0.6μm,能够在大多数培养基中生长良好。在麦康凯琼脂上生长形成红色菌落。大多数大肠杆菌作为人和动物肠道的正常菌,对鸭为非致病菌,只有少数血清型具有致病性,可在鸭体免疫功能下降或饲养环境恶劣时引起鸭发病。
雏鸭大肠杆菌感染时主要表现为脐炎(大肚脐),雏鸭精神不振,行动迟缓,拉稀,泄殖腔周围粪便污染等。成年鸭大肠杆菌感染时表现为精神沉郁,喜卧,不愿走动,站立或行走时腹部有明显的下垂。种(蛋)鸭还表现产蛋量稍下降、产异常蛋以及病鸭腹部下垂等。由于鸭大肠杆菌病是鸭的常发病,常用药物有青霉素、土霉素、金霉素,由于长期使用,多数的菌株已产生抗药性。
鸭巴氏杆菌病是由鸭巴氏杆菌(RA)引起的一种接触性传染性疾病,又称为鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等。多见于1-8周龄的小鸭,呈急性或慢性败血症,临诊上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤,少数慢性病例出现头颈歪斜等症状。在病变上以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征,常引起小鸭的大批发病和死亡。
在自然条件下,鸭巴氏杆菌病一年四季都有发生,主要通过污染的饲料、饮水、尘土、飞沫等,经呼吸道、消化道或皮肤的伤口(尤其是足蹼部皮肤)而感染。它的发生与鸭龄的大小、饲养管理的好坏、各种不良应激因素或其它病原感染有一定的关系,死亡率一般在5%-75%。如在卫生条件差,饲养管理不善、或雏鸭转换环境、气候骤变、受寒、淋雨,及有其它疾病(番鸭花肝病、禽大肠杆菌病、禽出败等)混合感染时,更易引起本病的发生和流行,死亡率往往可高达90%以上。该病在发病场能持续存在,易引起不同批次的鸭感染发病,加上本病难于根治,给养鸭业造成严重的经济损失。
鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病在临床上常以混合感染的形式出现,死亡率高,饲料转化率低,治疗成本高,给养鸭业造成极大的经济损失。因此,需要开发一种有效的疫苗以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的提供一种鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗,该疫苗制备过程简单、成本低、免疫效果良好。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗,包括抗原和佐剂,所述抗原为鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的灭活抗原浓缩-重悬稀释液按1:1混合而成,占所述灭活疫苗总体积的60%~68%,所述佐剂为蜂胶乙醇提取液,占所述灭活疫苗总体积的27%~33%,还包括5~7%的黄芪多糖。
根据本发明,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株抗原液灭活前活菌数在2.5×109CFU/ml~4.0×109CFU/ml之间,鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原液灭活前活菌数在6.0×109CFU/ml~7.0×109CFU/ml之间。
根据本发明,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩稀释液浓度均大于或等于2.0×109CFU/ml。
根据本发明,所述疫苗中不含有硫柳汞。
一种如上述任一项所述的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法,包括如下步骤:
1)蜂胶乙醇浸出液制备:蜂胶在低温下贮存,使用时先将蜂胶置-15℃冷冻24-48h,再用冷冻粉碎机磨碎过筛,按1:4的比例加入95%乙醇,在37℃浸提48-72小时,冷却、过滤,即得纯净蜂胶乙醇浸出液(透明栗色溶液),浸出液的蜂胶干物质含量不小于32g/ml;
2)制备生产用菌株:将鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行繁殖制备生产用菌株,并对该生产用菌株进行纯粹检验;
3)制备抗原液:将步骤2)的生产用菌株分别接种到相应的制苗用培养基培养,制备抗原液;并进行纯粹检验;
4)活菌计数:分别从步骤3)所获得的两种抗原液中取样,对鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行活菌计数,以确定培养的菌数;
5)灭活:两种抗原液经甲醛灭活制得灭活抗原液,并进行灭活检验;
6)超滤浓缩:将上述两种灭活的抗原液用超滤仪浓缩4倍,弃去上清,制得其灭活抗原浓缩液;
7)疫苗成品完成:先将两种灭活的抗原浓缩液稀释;再将两种灭活的抗原浓缩稀释液按1:1的比例混合;接着,加入黄芪多糖摇匀,再加入步骤1)的蜂胶乙醇浸出液混合搅拌30分钟;再加入配制疫苗所需量的注射用水,搅拌5min,制得所述鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗。
根据本发明,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株抗原液灭活前活菌数在2.5×109CFU/ml~4.0×109CFU/ml之间,鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原液灭活前活菌数在6.0×109CFU/ml~7.0×109CFU/ml之间。
根据本发明,步骤7)的抗原稀释剂为注射用水,稀释后,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩稀释液浓度均大于或等于2.0×109CFU/ml。
根据本发明,所述黄芪多糖的质量百分比为5~7%,所述蜂胶的质量百分比为27~33%,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的灭活抗原浓缩-重悬稀释液的质量百分比为60%~68%。
本发明所述的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗,其有益效果是:降低鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病的发生,提高鸭的存活率。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法作进一步详细说明。
菌种来源
大肠埃希氏菌CVCC1560菌株,购自中国兽医药品监察所;
鸭巴氏杆菌CAU0085菌株,由中国兽医药品监察所提供。
一、蜂胶乙醇浸出液制备
蜂胶在低温下贮存,使用时先将蜂胶置-15℃冷冻24-48h,再用冷冻粉碎机磨碎过筛,按1:4的比例加入95%乙醇,在37℃浸提48-72小时,冷却、过滤,即得纯净蜂胶乙醇浸出液(透明栗色溶液),浸出液的蜂胶干物质含量不小于32g/ml。
二、制备生产用菌株
1、鸭巴氏杆菌CAU0085菌株
(1)一级种子繁殖:将冻干的鸭巴氏杆菌CAU0085菌株在1%裂解血球全血的马丁肉汤中培养,置37℃的CO2培养箱培养24小时;
然后选取生长良好的菌落,接种于10%犊牛血清琼脂平板,置37℃,培养20~22小时,-20℃保存备用,做为一级种子;
(2)二级种子繁殖:取鸭巴氏杆菌CAU0085菌株的一级种子接种于1%裂解血球全血的马丁肉汤中培养,置37℃,培养20~22小时,用生理盐水洗下,按《中国兽药典》附录进行纯粹检验,合格后作为二级种子,4℃保存,备用。
2、大肠埃希氏菌CVCC1560菌株
(1)一级种子繁殖:将冻干的大肠埃希氏菌CVCC1560菌株接种于麦康凯琼脂培养基,置37℃培养24小时,然后选取生长良好的菌落,接种马丁琼脂固体培养基,置37℃培养20~24小时,2~8℃保存备用,做为一级种子。
(2)二级种子繁殖:取大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的一级种子接种于马丁肉汤培养基中,置37℃培养24小时,用灭菌生理盐水洗下,按《中国兽药典》附录进行纯粹检验,合格后作为二级种子,2~8℃保存备用。
三、制备抗原液
1、鸭巴氏杆菌CAU0085菌株的二级种子液按2%接种于含1%裂解血球全血的马丁肉汤液体培养基,置37℃通气培养16小时;
2、大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的二级种子液按2%接种于马丁肉汤培养基,置37℃培养12小时。
四、纯粹检验
按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验。
五、活菌计数
分别从所获得的两种抗原液中取样,用血琼脂平板进行活菌计数,以确定培养的菌数。
六、灭活
分别向两种抗原液中加入各抗原液液体总量的0.4%的甲醛溶液,摇匀,
置37℃灭活48小时,灭活期间振摇6~8次,然后取样按《中国兽药典》
进行灭活检验,应无细菌生长。
其中,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株抗原液灭活前活菌数在2.5×109CFU/ml~4.0×109CFU/ml之间,鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原液灭活前活菌数在6.0×109CFU/ml~7.0×109CFU/ml之间。
七、超滤浓缩
将上述两种灭活的抗原液用Milliproe公司的MODEL No.XX814V230超滤仪浓缩,4倍浓缩,弃去上清,制得其灭活抗原浓缩液。
八、疫苗成品完成以及安全性实验和效力实验
实施例1
(1)使用时,用生理盐水重悬稀释上述两种灭活抗原浓缩液,参照菌落计数结果,将所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩液分别稀释至浓度为2.0×109CFU/ml。
(2)将上述两种灭活的抗原浓缩稀释液按1:1的比例混合,构成疫苗抗原液。
(3)按照60%的量量取疫苗抗原液,再加入7%的黄芪多糖并摇匀,再按照33%的量量取蜂胶原液混合搅拌30分钟,使其充分混合乳化,构成疫苗乳化液;
(4)再加入配制疫苗所需量的注射用水,搅拌5min,制得所述鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗。
(5)雏鸭的安全性实验
将上述制得的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗接种至20只7日龄雏鸭上,每只颈部皮下注射1.0ml,对照组颈部皮下注射1.0ml马丁肉汤,观察2周,实验组和对照组全部健康,精神食欲正常。
(6)雏鸭的效力实验
将3~7日龄的雏鸭,分为空白对照组、鸭巴氏杆菌CAU0085菌株组和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株组,每组各20只,空白对照组不接种二联蜂胶灭活疫苗,鸭巴氏杆菌CAU0085菌株组和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株组的颈部皮下注射0.5ml所制得的二联蜂胶灭活疫苗,免疫21日,分别用一个最小致死量的鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行颈部皮下注射1.0ml(含菌量为1.0×107CFU)。观察2周,检验结果见表1。
表1 雏鸭的效力实验结果
实施例2
(1)使用时,用生理盐水重悬稀释上述两种灭活抗原浓缩液,参照菌落计数结果,将所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩液分别稀释至浓度为2.5×109CFU/ml。
(2)将上述两种灭活的抗原浓缩稀释液按1:1的比例混合,构成疫苗抗原液。
(3)按照68%的量量取疫苗抗原液,再加入5%的黄芪多糖并摇匀,再按照27%的量量取蜂胶原液混合搅拌30分钟,使其充分混合乳化,构成疫苗乳化液;
(4)再加入配制疫苗所需量的注射用水,搅拌5min,制得所述鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗。
(5)雏鸭的安全性实验
将上述制得的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗接种至20只7日龄雏鸭上,每只肌肉注射2.0ml,对照组肌肉注射2.0ml马丁肉汤,连续观察2周。实验组和对照组全部健康,精神食欲正常。
(6)中鸭的效力实验
将35日龄的中鸭,分为空白对照组、鸭巴氏杆菌CAU0085菌株组和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株组,每组各15只,空白对照组不接种二联蜂胶灭活疫苗,鸭巴氏杆菌CAU0085菌株组和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株组的肌肉注射1ml所制得的二联蜂胶灭活疫苗,免疫21日后,分别用一个最小感染剂量的鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行肌肉注射1ml(含菌量为5.0×107CFU)。观察2周,检验结果见表2。
表2 雏鸭的效力实验结果
实施例3
(1)使用时,用生理盐水重悬稀释上述两种灭活抗原浓缩液,参照菌落计数结果,将所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩液分别稀释至浓度为3.0×109CFU/ml。
(2)将上述两种灭活的抗原浓缩稀释液按1:1的比例混合,构成疫苗抗原液。
(3)按照65%的量量取疫苗抗原液,再加入6%的黄芪多糖并摇匀,再按照29%的量量取蜂胶原液混合搅拌30分钟,使其充分混合乳化,构成疫苗乳化液;
(4)再加入配制疫苗所需量的注射用水,搅拌5min,制得所述鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗。
(5)雏鸭的安全性实验
将上述制得的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗接种至20只7日龄雏鸭上,每只颈部皮下注射1.0ml,对照组颈部皮下注射1.0ml马丁肉汤,观察2周,实验组和对照组全部健康,精神食欲正常。
(6)中鸭的效力实验
将35日龄的中鸭,分为空白对照组、鸭巴氏杆菌CAU0085菌株组和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株组,每组各15只,空白对照组不接种二联蜂胶灭活疫苗,鸭巴氏杆菌CAU0085菌株组和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株组的肌肉注射1ml所制得的二联蜂胶灭活疫苗,免疫21日后,分别用一个最小感染剂量的鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行肌肉注射1ml(含菌量为5.0×107CFU)。观察2周,检验结果见表2。
表2 雏鸭的效力实验结果
从上述实施例可以看出,鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗对鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病具有良好的保护力。
Claims (8)
1.一种鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗,包括抗原和佐剂,其特征在于,所述抗原为鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的灭活抗原浓缩-重悬稀释液按1:1混合而成,占所述灭活疫苗总体积的60%~68%,所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液,占所述灭活疫苗总体积的27%~33%,还包括5~7%的黄芪多糖。
2.如权利要求1所述的疫苗,其特征在于,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株抗原液灭活前活菌数在2.5×109CFU/ml~4.0×109CFU/ml之间,鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原液灭活前活菌数在6.0×109CFU/ml~7.0×109CFU/ml之间。
3.如权利要求1所述的疫苗,其特征在于,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩稀释液浓度均大于或等于2.0×109CFU/ml。
4.如权利要求1所述的疫苗,其特征在于,所述疫苗中不含有硫柳汞。
5.一种如权利要求1~4任一项所述的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)蜂胶乙醇浸出液:蜂胶在低温下贮存,使用时先将蜂胶置-15℃冷冻24-48h,再用冷冻粉碎机磨碎过筛,按1:4的比例加入95%乙醇,在37℃浸提48-72小时,冷却、过滤,即得纯净蜂胶乙醇浸出液,浸出液的蜂胶干物质含量不小于32g/ml;
2)制备生产用菌株:将鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行繁殖制备生产用菌株,并对该生产用菌株进行纯粹检验;
3)制备抗原液:将步骤2)的生产用菌株分别接种到相应的制苗用培养基培养,制备抗原液;并进行纯粹检验;
4)活菌计数:分别从步骤3)所获得的两种抗原液中取样,对鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株进行活菌计数,以确定培养的菌数;
5)灭活:两种抗原液经甲醛灭活制得灭活抗原液,并进行灭活检验;
6)超滤浓缩:将上述两种灭活的抗原液用超滤仪浓缩4倍,弃去上清,制得其灭活抗原浓缩液;
7)疫苗成品完成:先将两种灭活的抗原浓缩液稀释;再将两种灭活的抗原浓缩稀释液按1:1的比例混合;接着,加入黄芪多糖摇匀,再加入步骤1)的蜂胶乙醇浸出液混合搅拌30分钟,搅拌5min,制得所述鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二价蜂胶灭活疫苗。
6.如权利要求5所述的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株抗原液灭活前活菌数在2.5×109CFU/ml~4.0×109CFU/ml之间,鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原液灭活前活菌数在6.0×109CFU/ml~7.0×109CFU/ml之间。
7.如权利要求5所述的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法,其特征在于,步骤7)的抗原稀释剂为注射用水,稀释后,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的抗原浓缩稀释液浓度均大于或等于2.0×109CFU/ml。
8.如权利要求5所述的鸭巴氏杆菌病和鸭大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法,所述黄芪多糖的质量百分比为5~7%,所述蜂胶的质量百分比为27~33%,所述鸭巴氏杆菌CAU0085菌株和鸭大肠埃希氏菌CVCC1560菌株的灭活抗原浓缩-重悬稀释液的质量百分比为60%~68%。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151104 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |