CN104338128A

CN104338128A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104338128A
Application number: CN201310330866.4A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: CN104338128B

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含有免疫量的SIV、Mhp、APP抗原和兽医学上可接受的载体。该疫苗组合物免疫程序简单，能有效防治SIV、Mhp、APP的单独感染或混合感染。在发生混合感染时，其免疫效果明显超过分别注射单苗。该疫苗组合物副反应小，免疫期长，耗时少费力少，生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗组合物。

背景技术

猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(SIV)引起的一种急性、热性和高度接触性呼吸道传染病，以突然发病、咳嗽、呼吸困难、发热和衰竭，以及随后的迅速恢复或死亡为特征。各品种、性别和年龄的猪均能感染、发病率高，猪群爆发流感时，发病率可达100％。猪流感典型的临床症状为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难，伴有发热、嗜睡以及随之而来的厌食和消瘦等。SIV在单独感染情况下很少引起死亡，而与PRRSV、PCV2及Mhp混合感染时，会显著增加上述疾病的损害程度和病死率。另外，SIV也是猪呼吸道疾病综合征的主要病原。SIV与其它病原体共感染或继发感染所造成的损害已成为制约当前猪场经济效益的主要原因之一。

猪气喘病又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。

猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种。该疾病通过咳嗽产生的飞沫以及与感染或恢复期的病原携带猪直接接触而传播。感染动物和未感染动物混居导致早期和频繁的再感染。感染通常开始于携带病原的母猪产胎时感染小猪。由于猪群集中管理技术的影响，感染在生命后期才变得明显。当断乳后把猪集中起来时，通常还可发现其它感染。在六周龄或更大的猪中常常观察到明显的疾病。感染猪的生长速度和饲料转化率显著降低。使用抗生素治疗贵并且需要长期使用。同时再感染也是一个问题。目前疫苗是避免感染及其影响的最有效方法。

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病。该病在世界范围内分布广泛，常呈地方性流行，造成持续的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展。猪传染性胸膜肺炎主要是由感染猪直接传染给易感猪群的，能感染任何年龄的猪只，1～4月龄最易感，APP最主要的传播方式是通过感染猪呼出的小液滴进行的，这些小液滴随着气流漂移，当距离较近的易感猪呼入或直接接触到小液滴时就容易发病。猪传染性胸膜肺炎与猪传染性萎缩性鼻炎和猪气喘病一起成为当今大型养猪场的三大呼吸道传染病。该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，目前在多数工厂化的养猪国家均有发生。本病主要通过飞沫传播，也可通过接触传染。该病造成的猪只死亡、生长缓慢、饲料报酬降低及药物防治费用的增加，给世界各地的养殖业造成了严重的经济损失。

在临床上，常见Mhp和SIV混合感染，而两者均可以降低猪体的抵抗力，在协同其它细菌继发感染时会带来较大的损失(赵东升等，猪肺炎支原体与其它病原的相互作用，养猪，2008，(5)：66-68)。Mhp和APP的感染具有一定的协同作用，二者共同感染对肺部造成的损伤比病原单独感染要严重(Caruso J P，Ross R F.Am Journal Veterinarian Research[J]，1990，51：227-231.)。

在使用疫苗防治这3种疾病时，单苗多次注射会引发应激和安全问题，预防效果质量下降。因此，本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗SIV、Mhp、APP感染的疫苗，减少所述感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现。此外，联合疫苗不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗相比，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种含有SIV、Mhp、APP抗原的疫苗组合物及其制备方法，该疫苗组合物免疫程序简单，能有效防治SIV、Mhp、APP的单独感染或混合感染。在发生混合感染时，其免疫效果明显超过分别注射单苗。该疫苗组合物副反应小，免疫期长，耗时少费力少，生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。

本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含有免疫量的SIV、Mhp、APP抗原和兽医学上可接受的载体。

SIV抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪流感的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述抗猪流感抗原为灭活的、改良的活的或减毒的SIV，含SIV的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽；更优选地SIV抗原是灭活的SIV。

Mhp抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗支原体肺炎的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述抗猪支原体肺炎抗原为灭活的、改良的活的或减毒的Mhp，含Mhp的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽；更优选地Mhp抗原是灭活的Mhp。

APP抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗传染性胸膜肺炎的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述抗传染性胸膜肺炎抗原为灭活的、改良的活的或减毒的APP，含APP的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含APP的免疫原性氨基酸序列的多肽；优选灭活的APP。

优选地，所述SIV抗原是灭活的SIV全病毒抗原，所述Mhp抗原是灭活的Mhp全菌抗原，所述APP抗原是灭活的APP全菌抗原。

所述SIV抗原可以是灭活的H1N1亚型和H3N2亚型

更优选地，所述SIV抗原是灭活的SIV H1N1 ZJS株全病毒抗原，所述Mhp抗原是灭活的Mhp HN0613株全支原体抗原，所述APP抗原是灭活的APP血清1型LC株全菌抗原。

所述Mhp抗原可以是灭活的J株或HN0613株。

所述猪流感病毒(H1N1亚型)ZJS株(Swine influenza virus(H1N1 subtype)strain ZJS)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201233，保藏日期为2012年8月13日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。

SIV抗原还可以用以下毒株来实现本发明目的：如本实验室分离的H3N2 WX株(保藏号为CGMCC NO：V201234)、专利文件CN102747045A中的SIV H1N1 TJ株(保藏号为CGMCC NO：V201107)、专利文件CN102166352A中的SIV H1N1LN株(保藏号为CGMCC NO：4141)、SIV H3N2HLJ株(保藏号为CGMCC NO：4142)；专利文件CN102899294A中的SIV H1N1 Nanjing株(保藏号为CCTCC NO：V201218)；专利文件CN102586196A中的SIV H1N1Shanxi株(保藏号为CGMCC NO：5323)；专利文件CN102766604A中的SIV H1N2(保藏号为CCTCC NO：V201223)。

所述猪肺炎支原体HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012230，保藏日期为2012年6月13日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。

还可以用以下Mhp抗原来实现本发明目的：如勃林格殷格翰公司的 M.hyo(J株)；哈药集团公司的Respisure和RespisureOne(P-5722-3株)；美国先灵葆雅的Myco(J株)；西班牙海博莱生物大药厂的MYPRAVAC SUIS(J株)；美国普泰克公司的MycoGard(P株)；美国辉瑞公司的RespiFend MH(P-5722-3株)；梅里亚动物保健公司的猪克喘(BQl4株)。

所述胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株(Actinobacillus Pleuropneumoniae Serotype1strain LC，APP-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011458，保藏日期为2011年12月9日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。

还可以用以下APP抗原来实现本发明目的：如本实验室分离的APP血清5型YC株(保藏编号为：CCTCC NO：M2011459)、血清7型YS株(保藏编号为：CCTCC NO：M2011460)；华中农业大学的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗(1、2、7型)中的疫苗株；专利文件CN102058880中的传染性胸膜肺炎放线杆菌HT株(猪传染性胸膜肺炎HT株的分离、鉴定与定型试验，中国动物检疫，1999，16(2)：7～9)、SZ株(保藏编号为CGMCC NO：4215)、DY株(保藏编号为CGMCC NO：4216)。

更优选地，所述SIV抗原为灭活前10⁶～10⁸EID₅₀/ml，所述Mhp抗原为灭活前10⁸～10¹⁰MHDCE/ml，所述APP抗原为灭活前10⁸～10¹⁰CFU/ml。

MHDCE＝猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体。

进一步优选，所述SIV抗原为灭活前10⁷EID₅₀/ml，所述Mhp抗原为灭活前10⁹～2×10⁹MHDCE/ml，所述APP抗原为灭活前10⁹～2×10⁹CFU/ml。

优选地，所述兽医学上可接受的载体包括防腐剂、稀释剂、佐剂；所述佐剂为10wt％～60wt％。

更优选地，所述防腐剂包括硫柳汞；所述稀释剂包括PBS溶液；所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Ge101、蜂胶、ISA206、ISA760VG，优选卡波姆、Ge101、ISA206、ISA760VG；更优选卡波姆、Ge101；最优选Ge101。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：1)培养增殖SIV病毒，灭活；2)培养增殖Mhp支原体，灭活；3)培养增殖APP菌体，灭活；4)按比例配制混合抗原液，添加兽医学上可接受的载体，混匀。

本发明提供了一种根据本发明所述疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将抗原与兽医学上可接受的载体混合制得抗猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的疫苗组合物，其中，所述抗原包括SIV、Mhp、APP抗原。

根据本发明方法，所述方法还包括在配苗步骤之前的抗原准备步骤，包括制备抗原，或者通过其他方法获得抗原，如直接购置抗原。优选制备抗原，包括分别培养SIV、Mhp、APP，并分别进行浓缩、灭活，获得SIV、Mhp、APP抗原。

优选地，本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：分别培养所述SIV H1N1ZJS株，所述Mhp HN0613株，所述APP型1型LC株；浓缩并测定含量，分别灭活；按比例配制，混匀乳化。

本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪呼吸道综合征的药物中的应用。

本发明的所述疫苗组合物中的3种抗原在一定含量范围内不仅均能保留各自成分的免疫效力，没有相互干扰，更有相互免疫促进作用，组合疫苗比单苗效果更佳。疫苗组合物针对混合感染效果比单苗或二联苗要好。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中以SIV H1N1ZJS株、Mhp HN0613株、APP1型LC株为例说明本发明。

实施例1、SIV、Mhp、APP抗原的制备

1.菌(毒)株的来源

SIV H1N1ZJS株，系本实验室分离保存，保藏号为CCTCC NO：V201233，保藏日期为2012年9月11日。

Mhp HN0613株，本实验室分离保存，保藏号为CCTCC NO：M2012230，保藏日期为2012年6月13日。

APP1型LC株，本实验室分离保存，保藏号为CCTCC NO：M2011458，保藏日期为2011年12月9日。

2.疫苗半成品的制备及检验

2.1生产用种子的制备

2.1.1猪流感病毒

将SIV H1N1ZJS株接种SPF鸡胚进行传代，收获尿囊液作为病毒液，第一代为F1依次传至F3，取F3代尿囊液用1％鸡红细胞进行病毒血凝滴度测定。其HA效价≥8log2。取F3代尿囊液作为生产用种毒。

2.1.2猪肺炎支原体：

一级种子的繁殖

将Mhp HN0613株冻干菌种用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d，作为一级种子。

二级种子的繁殖

取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。

液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH₂O360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25％酚红10ml马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25ml。

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar(纯化琼脂)即可。

2.1.3猪胸膜肺炎放线杆菌：

一级种子的繁殖

将LC、YC、YS株冻干菌种分别划线接种于TSA(大豆酪蛋白琼脂)平板，在5～10％CO2条件下37℃培养16h，挑取典型菌落划线再接种于TSA平板，继续培养16～18h，平板菌落作为一级种子。

二级种子的繁殖

从一级种子TSA平板上挑取典型单菌落，接种TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养基，37℃震荡培养10h，经纯检合格，即为二级种子。

TSB培养基：胰蛋白胨1.7g，酵母粉0.6g，大豆胨0.5g，葡萄糖0.25g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.328g溶于100mL水中，调pH至7.6，115～121℃高压灭菌15min。使用前加入终浓度为10μg/ml的NAD。

TSA平板：在TSB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，115～121℃高压蒸汽灭菌30min，待温度冷到50℃时加入终浓度为10μg/ml的NAD，铺制成平板，约15ml/块。

2.2制苗用菌液的制备

2.2.1猪流感病毒：

将SIV H1N1ZJS株生产用种毒用灭菌生理盐水作10^-4稀释后，接种非免疫鸡胚，0.2ml/胚，置33～35℃、60％～65％相对湿度孵育72h，弃去24h内死胚，24h后死胚随时取出置2～8℃，72h后全部取出置2～8℃不少于12h。收获尿囊液无杂菌检验合格后，置2～8℃保存备用。

2.2.2猪肺炎支原体：

将液体培养基培养的Mhp二级种子液按10％(v/v)接种于液体培养基中。37℃下培养3-6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。培养物经纯粹检验合格后置2～8℃保存备用。

2.2.3猪胸膜肺炎放线杆菌：

将TSB预热至37℃左右，按1～5％接种二级种子液，37℃摇床培养8～9h，转速为200rpm，收获菌液经纯粹检验合格后，置2～8℃保存备用。

2.3含量测定

2.3.1猪流感病毒：

取病毒液按《中华人民共和国兽药典》(2010版)附录方法进行EID₅₀测定。

2.3.2猪肺炎支原体：

用PCR方法对培养物进行计数。10倍比稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3×10^-3μg(相当于1000左右个菌体)，按稀释的倍数算出菌体数(沈青春，谭青松，王琴，等.PCR方法测定Mhp培养物菌数[J].中国预防兽医学报，2006，28(1)：55-57)。

2.3.3猪胸膜肺炎放线杆菌：

取培养菌液按《中华人民共和国兽药典》(2010版)附录方法进行活菌计数。

2.4浓缩和含量测定

2.4.1将SIV H1N1ZJS株病毒液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为100Kda道尔顿)进行浓缩后，测定EID₅₀。

2.4.2将Mhp HN0613株菌液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为1000Kda道尔顿)进行浓缩，菌体计数。

2.4.3将APP型1型LC株菌液离心，弃去上清获得菌泥，加无菌PBS悬浮，活菌计数。

2.5灭活

分别取合格的SIV HIN1ZJS株、Mhp HN0613株、APP型1型LC株培养液，按培养液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔3-4小时振摇一次，24小时后取出，进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。

表1制备的浓缩抗原及含量

抗原	灭活前含量
		猪流感病毒HIN1ZJS株	10⁹EID₅₀/ml
猪肺炎支原体HN0613株	10¹¹MHDCE/ml
		猪胸膜肺炎放线杆菌1型LC株	10¹¹CFU/ml

实施例2.疫苗组合物的制备

1防腐剂的配制

1％(w/v)的硫柳汞(国药集团化学试剂有限公司20120106)水溶液

2稀释剂的配制

无菌的PBS(0.01M，pH＝0.02)缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121℃高压灭菌30min备用。

3佐剂的配制

Gel01(法国SEPPIC公司20120401)，121℃高压灭菌30min备用。

4配苗

取实施例1制备的Mhp、SS2、SESZ浓缩灭活抗原，根据联苗及单苗中最终的抗原含量制成混合抗原液或直接制成抗原液，然后将抗原液与Gel01佐剂按90∶10(v/v)混合，用pH为7.2的PBS补充至所需体积，以500r/min搅拌30分钟即可。

具体制备如下：

表2疫苗L

表3疫苗H

表4疫苗1

表5疫苗2

表6疫苗3

表7疫苗4

表8疫苗5

表9疫苗6

表10疫苗7

表11疫苗8

制备各种疫苗如表12：

表12各种疫苗的组分及含量

实施例3、本研究是为了评价SIV、Mhp、APP混合感染后对APP发病的促进作用，从而证明三者混合感染的协同作用。

1材料：

动物：60～70日龄，SIV、Mhp、APP血清抗体均为阴性的猪

攻毒菌株：SIV H1N1ZJS株、Mhp CVCC354株(购自中国兽医药品监察所)、APP型1型LC株

2方法：

选60～70日龄小猪50头，随机分为10组，每组5头。用不同剂量APP1型LC株分别攻击1～3组猪，观察14天后统计发病情况；用发病剂量的SIV H1N1ZJS株和不同剂量APP型1型LC株联合攻击4、5组猪，观察14天后统计发病情况；用发病剂量的CVCC354株和不同剂量APP型1型LC株联合攻击6、7组猪，观察14天后统计发病情况；用发病剂量的Mhp CVCC354株、SIV H1N1ZJS株和不同剂量APP型1型LC株联合攻击8、9组猪，观察14天后统计发病情况。试验设计具体见表13：

表13各组攻毒菌毒株及剂量

3攻毒结果如表14：

表14不同攻毒菌毒株及剂量下各组攻毒结果

组别	肺病变	PCR阳性数	死亡数	发病数
					1	0/5	0/5	0/5	0/5
2	2/5	2/5	1/5	2/5
					3	5/5	5/5	4/5	5/5
4	2/5	2/5	1/5	2/5
					5	4/5	4/5	3/5	4/5
6	3/5	3/5	2/5	3/5
					7	4/5	4/5	4/5	4/5
8	4/5	4/5	2/5	4/5
					9	5/5	5/5	4/5	5/5
10	0/5	0/5	0/5	0/5

APP发病标准：

①肺脏出现出血斑或出血块、心肺表面与胸膜出现粘连、取肺病料PCR扩增为阳性。

②死亡

以上2项出现任1项判为发病。

攻毒结果表明单独攻击APP时，随着攻毒剂量的增加，病变会逐渐加重，低剂量对猪没有致病性；然而，SIV-APP或Mhp-APP联合攻毒时，APP低剂量组出现APP病变和死亡，中剂量组发病情况比单独攻毒时加重；最后SIV-Mhp-APP联合攻毒时，不同剂量组发病情况均显著加重，程度比2种病原混合攻毒更严重。

4小结：

实施例3研究表明，SIV、Mhp、APP的混合感染对APP的发病具有协同和促进作用，两者或三者混合感染后均能加重APP的发病，三者混合感染比二者混合感染发病更严重。

实施例4、本研究是为了评价不同抗原含量SIV-Mhp-APP组合疫苗抵抗SIV、Mhp、APP单独感染或混合感染的效力。

1材料：

实施例2制备疫苗：

表15疫苗L、H的抗原和含量

动物：4-5周龄，SIV、Mhp、APP血清抗体均为阴性的猪

2方法：

选4-5周龄仔猪65头，随机分为13组，每组5头。第0天，对第1、4、7、10组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗L，对第2、5、8、11组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗H，第3、6、9、12组颈部肌肉注射无菌PBS，均为2ml/头，第13组作为空白对照，既不免疫也不攻毒。第1～3组、4～6组、7～9组、10～12组、13组分别置不同房间饲养。第28天，用SIV H1N1ZJS株攻击1～3组猪，气管注射2ml/头，观察10天后统计攻毒保护情况；用APP型1型LC株攻击4～6组猪，气管注射5ml/头，观察14天后统计攻毒保护情况；第55天，用Mhp CVCC354株攻击7～9组猪，气管注射5ml/头，28天后统计肺病变情况；第35天，同时用SIVH1N1ZJS株、APP型1型LC株、MhpCVCC354株攻击10～12组猪，统计攻毒保护情况。具体见表16：

表16各组免疫、攻毒情况

3结果：

3.1SIV H1N1ZJS株攻毒保护结果见表17：

表17SIV H1N1ZJS株攻毒保护结果

SIV攻毒发病标准

①出现上呼吸道症状：攻毒后1～3天出现咳嗽、流鼻涕、呼吸困难、精神沉郁等。

②病毒分离阳性：攻毒后第3天采集所有攻毒猪的鼻腔棉拭子，每份拭子样品接种9日龄易感鸡胚各5枚，每份接种样品中有1枚鸡胚液HA效价≥4log2，即判为病毒分离阳性。

③出现肺脏病理变化：攻毒后第10天剖杀所有攻毒猪，肺脏出现斑点块或斑块状实变、出血等。

以上3项出现任意2项者，即判为发病。

攻毒结果表明疫苗L、H对SIV H1N1ZJS株攻击均有免疫保护作用，前者保护率均在80％以上，后者保护率为100％。研究结果表明，SIV低剂量抗原组合疫苗和高剂量抗原组合疫苗均能产生良好的保护作用，且随着抗原含量的增加，保护效果增强。

3.2APP型1型LC株攻毒保护结果如表18：

表18APP型1型LC株攻毒保护结果

组别	死亡数	肺病变	PCR阳性数	发病数	保护数
						4	1/5	1/5	1/5	1/5	4/5
5	0/5	0/5	0/5	0/5	5/5
						6	5/5	5/5	5/5	5/5	0/5
13	0/5	0/5	0/5	0/5	-

发病标准：

②死亡

以上2项出现任1项判为发病。

攻毒试验结果表明疫苗L、H对APP血清1型LC株攻击均有免疫保护作用，前者保护率为80％，后者保护率为100％。研究结果表明，APP低剂量抗原组合疫苗和高剂量抗原组合疫苗均能产生良好的保护作用，且随着抗原含量的增加，保护效果增强。

3.3Mhp攻毒保护结果如表19：

表19Mhp攻毒保护结果

组别	平均肺病变评分
		7	5.8
8	2.2
		9	16.1
13	0

组对组比较	P值
		7对9	0.039
8对9	＜0.001
		7对8	0.423

[0172] 所有接种组与对照组比较均显示统计学显著差异(P＜0.05)，组7比组8肺评分高，但差异不明显(P＝0.423)。研究结果表明：疫苗L和H均能明显减少Mhp引起的肺病变，具有良好的免疫保护作用。另外，随着疫苗中Mhp抗原含量的增加，保护效果会增强。

3.4SIV、Mhp、APP联合攻毒保护结果如表20：

表20SIV、Mhp、APP联合攻毒保护结果

攻毒结果表明疫苗L、H对3种强毒的联合攻击均有免疫保护作用，前者保护率为80％，后者保护率为100％。其中，攻毒对照组5头猪均死亡，剖检发现肺脏严重实变和出血，已不能区分出病原特异性病变。组10肺病变与组12相比明显减少。研究结果表明，SIV-Mhp-APP低剂量抗原组合疫苗和高剂量抗原组合疫苗对联合攻毒均能产生良好的保护作用，且随着抗原含量的增加，保护效果增强。

4小结：

实施例3研究表明，SIV-Mhp-APP组合疫苗在一定的抗原含量范围之内，无论是单独攻毒还是混合攻毒，均能产生对相应病原感染的保护作用，且抗原含量越大，保护作用越强。

实施例5、本研究是为了评价SIV-Mhp-APP、SIV-APP、Mhp-APP组合疫苗和APP单苗抵抗SIV、Mhp、APP混合感染的效果。

1材料：

实施例2制备疫苗：

表21各疫苗组分和含量

动物：4-5周龄，SIV、Mhp、APP血清抗体均为阴性的猪

2方法：

选4-5周龄仔猪35头，随机分为7组，每组5头。第0天，分别对第1、2、3、4、5组颈部肌肉注射疫苗1～5，2ml/头；第6组颈部肌肉注射无菌PBS，2ml/头；第7组作为空白对照，既不免疫也不攻毒。第35天，第35天，同时用SIV H1N1ZJS株、APP型1型LC株、MhpCVCC354株攻击1～6组猪，观察临床症状及病理变化，统计攻毒保护情况。具体见表21。

表21A各组免疫和攻毒情况

3结果：

3.1攻毒保护结果见表22：

表22攻毒保护结果

攻毒结果表明疫苗1对混合感染无保护作用，3种病原特征性病变均出现；疫苗2对混合感染保护率为20％，能明显减轻SIV特征性病变，但对Mhp和APP保护作用不强；疫苗3对混合感染保护率为40％，能分别减轻3种病原特征性病变；疫苗4和疫苗5对混合感染保护率均为100％，3种病原攻毒均未发病；第6组攻毒对照猪均出现3种病原特征性病变；第7组空白对照猪无任何异常。

4小结：

实施例4研究结果令人意外：3种病原的混合感染有明显的协同作用，尤其是Mhp或SIV的感染会促进APP的感染和发病。APP单苗对混合感染时APP的发病无任何保护作用；SIV-APP、Mhp-APP组合疫苗均能减轻混合感染后APP的发病，后者稍强于前者；Mhp-APP组合疫苗也能减轻混合感染后SIV的发病；不同APP抗原含量SIV-Mhp-App组合疫苗均能对混合感染产生保护作用，且效果相当，说明SIV、Mhp抗原对APP抗原的免疫效应产生了协同作用。此3种病原的混合感染必须通过3种抗原的有效组合免疫来预防，本发明中的SIV-Mhp-App疫苗组合物效果确实。

实施例6、本研究是为了评价SIV-Mhp-APP组合疫苗和Mhp单苗相比Mhp部分的免疫效力，以及在组合疫苗中有不同含量Mhp时的组合效力。

1材料：

实施例2制备疫苗：

表23各疫苗组分和含量

动物：4-5周龄，Mhp血清抗体均为阴性的猪

攻毒菌株：Mhp CVCC354株(购自中国兽医药品监察所)

2方法：

选4-5周龄仔猪30头，随机分为6组，每组5头。第0天，对第1～4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗6、疫苗7、疫苗8、疫苗5各2ml/头，第5组颈部肌肉注射无菌PBS2ml/头，第6组作为空白对照，既不免疫也不攻毒，隔离饲养。第55天，分别用CVCC354株强毒攻击1-5组猪，气管内注射5ml/头，28天后统计肺病变。具体见表24。

表24各组免疫和攻毒情况

3结果：

攻毒保护结果如表25、26：

表25肺病变评分

组别	平均肺病变评分
		1	4.4
2	2.7
		3	2.2
4	2.6
		5	15.6
6	0

表26肺评分成对测试结果

组对组比较	P值
		1对2	0.33
1对3	0.15
		1对4	0.19
1对5	＜0.001
		2对5	＜0.001
3对5	＜0.001
		4对5	＜0.001

所有接种组与对照组比较显示统计学显著差异(P＜0.05)，组2、组3、组4肺评分相当，组1比组2、组3、组4肺评分均要高，但差异不显著。研究结果令人意外：SIV-Mhp-APP组合疫苗比单苗更能减少Mhp引起的肺病变；而低含量Mhp抗原组合疫苗、中等含量Mhp抗原组合疫苗、高含量Mhp抗原组合疫苗产生的免疫效力相当，三者减少 Mhp引起的肺病变程度相当。

4小结：

实施例5研究结果令人意外：实施例2制备的4种疫苗均能产生对Mhp的保护力，但SIV-Mhp-APP组合疫苗中Mhp部分免疫效力不仅仍存在，而且明显高于Mhp单苗；而低含量Mhp抗原组合疫苗、中等含量Mhp抗原组合疫苗、高含量Mhp抗原组合疫苗产生的免疫效力相当；表明三种抗原的混合增强了Mhp的免疫保护作用。这些可能是SIV、APP抗原对Mhp抗原的免疫效应产生了协同作用，而这种协同作用可能只会在一定抗原量比例下存在并维持在一定范围。所以，只需一次免疫该组合疫苗，即可达到甚至超过免疫Mhp单苗的效果，大大提高免疫效率。

实施例7、评价本发明疫苗组合物在田间试验中对PRDC的使用效果。

本研究在PRDC发病较为严重的猪场进行，选择609头健康、出生重差异不显著的杜长大哺乳仔猪进行免疫观察试验。

随机分2组，即疫苗免疫组(319头猪)和对照组(290头猪)，分别记为A、B组。

A组：在研究当天(第0天)，对约28日龄的猪进行单次肌肉接种本发明的疫苗组合物，2ml/头。

B组：不免疫作为对照组。

采用猪场日常饲养管理方法，由专人饲养，在育肥结束时(研究第22周)终止研究。

所记录的参数如下：

(1)个体体重(所有动物)

(2)僵猪率(所有动物)

(3)临床表现(所有动物)

(4)死亡率(所有动物)

（5）尸检(若可能，每一只死亡或处死动物)

养猪场发病情况

根据饲养及猪场的发病史，动物自育肥中期开始经历与猪呼吸道疾病综合征(PRDC)相关的呼吸道症状。这些症状伴有育肥期间的体重增加程度降低(ADWG750-800g)、及死亡率增加(7.4-8.9％)，导致整个饲养期料重比的增高(2.95～3.2∶1)及养殖成本的增加。此时被认为涉及PRDC的病原体为SIV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀巴斯德氏菌、支气管败血性波氏菌，有时还涉及PRRSV。本研究中还发现，猪鼻支原体与此疾病综合征有关。有趣的是，本研究的结果表明，PRRSV和猪肺炎支原体的感染在SIV病毒血症发作的约4-6周前出现。可能是猪群中存在早期潜伏感染造成的。

结果

体重、体重增加、平均每日体重增加(ADWG)、饲料消耗量、料重比

在研究起始时免疫组和对照组体重相当。在研究第15周及第22周，疫苗接种组体重与对照组体重差异有显著性(p＜0.01)。

自研究起始至研究第22周，疫苗接种组动物比对照组动物多增重5.38kg。此对应于，从研究起始至研究第15周时疫苗接种组动物的ADWG高出对照组18.9g/d，至研究第22周时疫苗接种组动物的ADWG高出对照组35.3g/d。对于整个育肥期(研究第7-22周)而言，两组ADWG差值可达到47.6。免疫组(2.76∶1)和对照组(3.04∶1)动物整个研究阶段的料重比差异有显著性。具体情况见表27。

表27接种疫苗对动物体重增长的影响

*表示组间比较之t检验之p值，ns：不显著(p＞0.05)，***：极显著(p＜0.01)。

僵猪率

在任一称重时间点，未在疫苗接种组与对照组之间观测到僵猪率的显著差异。免疫组和对照组的僵猪率都较低(2.5％-4.3％和2.8％-3.7％)。

临床表现

对照组和免疫组有类似的临床表现，跛行、腹泻(在5％-8％的动物中)。这些表现在对照组和免疫组中出现频率相等。对死亡动物进行尸检且随后进行微生物学检验发现，猪链球菌可能是引起跛行的感染性病原体，溶血性大肠杆菌可能是腹泻的原因。此外，对照组在研究第10-22周呼吸道症状明显(在15-20％的动物中)，咳嗽、呼吸困难、精神不振，严重的猪只呈犬坐，对症状严重濒死猪只处死后，解剖进行微生物检验发现，呼吸道症状可能是由SIV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌混合感染引起的。与对照组相比，疫苗免疫组猪只中咳嗽及呼吸困难的频率分别降低33％及45.7％。表明免疫组对呼吸道综合症有较好防制效果。

死亡率

整个试验过程中，对照组猪只具有比疫苗接种组动物显著较高的死亡率(疫苗接种组动物2.7％，对照组动物6.92％，p＝0.0087)。疫苗接种组猪只的死亡率比对照组猪只下降61％。

试验猪在本研究第10-17周龄时出现呼吸道症状、死亡率增加、且体重增加幅度减小。通过血清学及微生物学筛查发现，SIV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体及多杀巴斯德氏菌都可能参与此种疾病综合征。

与对照组相比，疫苗接种组的以下统计学显著表现值得注意：

-增重损失减小

-死亡率降低

-咳嗽及呼吸困难减少

-料重比减少

如所预期，僵猪率未观测到统计学显著差异，因为僵猪的出现并非PRDC的典型表现。

将这些表现汇总能得出以下结论：

1、本研究在受PRDC影响的畜群中进行。SIV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌参与此种疾病综合征，观测到呼吸道症状、增重损失、料重比增加、死亡率增加。

2、本发明疫苗组合物免疫靶动物后可预防或治疗由SIV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌混合感染引起的PRDC。

本发明针对现有技术的不足提供了一种含有SIV、Mhp、APP抗原的疫苗组合物，该疫苗组合物免疫程序简单，能有效防治SIV、Mhp、APP的单独感染或混合感染，尤其针对混合感染效果确实。同时，该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，副反应小，实用性强。

至少具有以下优点：

1)解决了现有技术的困难，首次将SIV、Mhp、APP抗原按照合适的比例联合使用，抵抗单独感染或混合感染，而在本发明之前，一直没有人发现使用联合疫苗抵抗混合感染的有效性。

2)本发明的SIV、Mhp、APP抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的三联疫苗，不仅不会产生抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且意外发现SIV、Mhp、APP抗原混合后，不仅能抵抗SIV、Mhp、APP的单独感染或混合感染，还意外发现疫苗组合物中APP、Mhp抗原免疫效果被增强的事实。而且如本发明后续实施例所证明的，特别是疫苗组合物中APP或Mhp抗原量减半却仍能维持全抗原量的免疫效果，这出乎本领域普通技术人员预料的。

3)另外，本研究还意外发现3种病原的混合感染有明显的协同作用，尤其是Mhp或SIV的感染会促进APP的感染和发病。APP单苗对混合感染时APP的发病无任何保护作用；SIV-APP、Mhp-APP组合疫苗均能减轻混合感染后APP的发病；Mhp-APP组合疫苗也能减轻混合感染后SIV的发病；SIV-Mhp-App组合疫苗对混合感染产生完全保护作用。此3种病原的混合感染必须通过3种抗原的有效组合免疫来预防。

4)本发明中预防和治疗猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的疫苗组合物，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的疫苗组合物安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。

5)含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

6)此外，本发明预防和治疗猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的疫苗组合物，制备方法简单，安全有效，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打3针才能防治以上三种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能够预防猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含有免疫量的SIV、Mhp、APP抗原和兽医学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述SIV抗原是灭活的SIV全病毒抗原，所述Mhp抗原是灭活的Mhp全支原体抗原，所述APP抗原是灭活的APP全菌抗原。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述SIV抗原是灭活的SIV H1N1ZJS株全病毒抗原，所述Mhp抗原是灭活的Mhp HN0613株全支原体抗原，所述APP抗原是灭活的APP血清1型LC株全菌抗原。

4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述SIV抗原为灭活前10⁶～10⁸EID₅₀/ml，所述Mhp抗原为灭活前10⁸～10¹⁰MHDCE/ml，所述APP抗原为灭活前10⁸～10¹⁰CFU/ml。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述SIV抗原为灭活前10⁷EID₅₀/ml，所述Mhp抗原为灭活前10⁹～2×10⁹MHDCE/ml，所述APP抗原为灭活前10⁹～2×10⁹CFU/ml。

6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述兽医学上可接受的载体包括防腐剂、稀释剂、佐剂；所述佐剂为10wt%～60wt%。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述防腐剂包括硫柳汞；所述稀释剂包括PBS溶液；所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA206、ISA760VG，优选卡波姆、Gel01、ISA206、ISA760VG；更优选卡波姆、Gel01；最优选Gel01。

8.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1）培养增殖SIV病毒，灭活；

2）培养增殖Mhp支原体，灭活；

3）培养增殖APP菌体，灭活；

4）按比例配制混合抗原液，添加兽医学上可接受的载体，混匀。

9.根据权利要求1～7所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪流感、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的药物中的应用。

10.根据权利要求1～7所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪呼吸道综合征的药物中的应用。