CN104998256A - 一种猪用三联灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法首先通过对抗原的优选确定了具有极佳免疫效果的抗原组合，以此制备的多联疫苗具有突出的免疫功效。本发明制备的疫苗包含PCP免疫保护性抗原—外毒素(Apx)，其交叉免疫保护效果优于全菌体灭活苗，同时免疫副反应大大降低，在此基础上与副猪嗜血杆菌、猪链球菌灭活后联合免疫，能同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪传染性胸膜肺炎。本发明制备的三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力相当，与市售的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗相比，对不同血清型致病猪只具交叉免疫保护力，同时可以达到一针多防的目的。

Description

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪用三联灭活疫苗的制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌是当今危害养猪业的重要细菌性病原，常与猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒或猪流感病毒发生混合感染，严重危害养猪业的发展。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPs)是猪Glasser’s病的病原体，隶属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，是猪上呼吸道的一种共栖菌，侵入机体会引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的全身性疾病。HPs只感染猪，具很强的宿主特异性，成年猪不表现明显症状，多发于各年龄段的仔猪和架子猪，在断奶前后和保育舍阶段发病，通常见于5～8周龄，发病率达40％，死亡率可达50％。HPs血清型众多，目前已鉴定了15个血清型，但不能分型的副猪嗜血杆菌仍有很多，占分离株的15.2％～41％。HPs产生耐药性较快，耐药后敏感性不易恢复，近年，副猪嗜血杆菌病普遍发生，多种抗菌药物的使用导致耐药性极为普遍，因此，制定合理免疫防疫制度，开发安全有效的疫苗尤为重要。

猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是猪的重要病原菌之一，临床上常引起急性型败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及淋巴结脓肿，可侵害各年龄段猪，病猪及带菌猪是主要传染源，本病发生无季节性，多成地方流行性。链球菌抗原构造复杂，有核蛋白抗原(P抗原)，无群特异性，及群特异抗原(C抗原)和型特异抗原。根据荚膜多糖抗原(CPS)可将链球菌分为35个血清型，即1型～34型和1/2型(同时含有1型和2型抗原的菌株)，根据C抗原不同，可将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G等20个血清群。近年，猪链球菌病在我国流行呈上升趋势，并与多种细菌性疾病呈混合感染，导致严重的后果。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropnmonia,PCP)的病原菌，PCP是主要以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。该病可感染各年龄段猪只，并引起急性和慢性感染，发病率和死亡率20％以上，急性型死亡率可高达80％-100％。APP血清型较多，目前分离鉴定出了15种血清型，根据APP生长是否需要NAD因子，可分为两个生物型，依赖外援NAD因子生长的是生物Ⅰ型，不依赖NAD因子生长的是生物Ⅱ型。溶血毒素是APP分泌到菌体细胞外的一个主要的毒力因子，被称为溶血毒素和细胞毒素，归入RTX(Repeats in thestructural toxin)毒素家族，因此APP的RTX毒素称为Apx(Actinobacillurpleuropneumoniae-RTX-toxin)毒素，包括Apx Ⅰ、Apx Ⅱ、Apx Ⅲ、Apx Ⅳ。所有血清型均能分泌Apx Ⅳ，只在体内表达，体外检测不到，大多数血清型只产生Apx Ⅰ、Apx Ⅱ、Apx Ⅲ的两种，少数血清型只产生一种。目前，对该病的预防主要以致病血清型的全菌体灭活苗为主，虽然PCP弱毒疫苗及ghost疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有一定程度的提高，但是弱毒疫苗免疫原性较低，存在毒力返强的可能性，ghost疫苗存在菌体裂解不彻底等缺点。如果开发亚单位疫苗则需要摸索适宜的抗原，进一步涉及菌种血清型的选择、抗原的提取等诸多环节，还要考虑免疫效果和不良反应等技术问题。

现有技术中，市场上的疫苗只有预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎的单苗或二联苗，而这三种病通常呈混合感染或继发感染，使用单苗或二联苗需要多次免疫，对猪应激较大，成本高。在开发联苗的技术实践中，首先应当确保抗原对各单一致病菌的免疫作用，那么菌种血清型的选择尤为重要，同时，应当保证联苗整体对三种致病菌均具有有效的免疫效果，且不会发生不良反应，此外，由于同时涉及不同类别的抗原，那么抗原的提取、灭活以及疫苗的制备等方面均需要突出的创造性劳动才可能实现。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，以解决现有技术中缺乏一种同时免疫副猪嗜血杆菌、猪链球菌以及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的疫苗制备方法的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是通过对抗原的创新性选择，以提升疫苗对上述三种致病菌的免疫效果。

本发明解决的再一技术问题是通过对抗原的创新性选择，以避免疫苗发生不良反应。

本发明解决的又一技术问题是通过对工艺的创新设计，以提升上述方法的制备效率。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素Apx Ⅲ为抗原，经灭活后制备的。

优选的，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅢ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型提取得到的。

进一步优选的，该方法包括以下步骤：

1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；

2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至200-400ug/mL，由此分别得到ApxⅠ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液和Apx Ⅲ抗原溶液；

3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10⁷～10¹²CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；

4)取步骤2)所述Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液、Apx Ⅲ抗原溶液，取步骤3)所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)(v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；

5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。

优选的，步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基中，35～38℃培养18～24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，35～38℃培养12～16小时，为一级种子；取所述一级种子以0.5～2％(v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，35～38℃培养12～16小时，得到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。

优选的，步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进行灭活，在此基础上进一步优选的，加入饱和硫酸铵后溶液中硫酸铵浓度为55～60％(w/w)。

优选的，步骤2)或步骤3)所述灭活是通过以下方法实现的：按溶液体积的0.25～0.35％加入甲醛溶液，35～38℃灭活24～48小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次搅拌持续3～5分钟；更优的，灭活36小时。

优选的，步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。

优选的，步骤3)所述浓缩是以0.45μm孔径的滤膜实现的。

优选的，步骤5)取IMS 1313VG疫苗佐剂与水以(2.5～3.5):7体积比混合，加入维生素E，调整佐剂浓度至9～11mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。

在以上技术方案中，所述“经灭活后制备”中的“制备”是指利用所述抗原以疫苗技术领域的公知制备方法制备；以上步骤5)中所述的“制备”同样是利用公知方法制备；所述IMS 1313VG佐剂是是商品名，具体限定由法国赛比克公司出品的、型号为IMS 1313VG的疫苗佐剂。

本发明首先通过对抗原的优选确定了具有极佳免疫效果的抗原组合，以此制备的多联疫苗具有突出的免疫功效，本发明制备的PCP亚单位疫苗包含免疫保护性抗原—外毒素(Apx)，其交叉免疫保护效果优于全菌体灭活苗，同时免疫副反应大大降低，在此基础上同时与副猪嗜血杆菌、猪链球菌灭活后联合免疫，能同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪传染性胸膜肺炎。

此外，本发明通过对抗原提取方法、用量、灭活条件等一系列工艺条件的创新性设计使得本方法较现有技术的疫苗制备方法能够最大程度保证免疫原性同时降低产品不良反应风险。本发明制备的三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力相当，与市售的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗相比，对不同血清型致病猪只具交叉免疫保护力，同时可以达到一针多防的目的。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

一、疫苗制备

一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗的制备方法，其步骤如下：

1生产菌种制备

1.1一级种子繁殖

将副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD平板上，37℃培养18～24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12～16小时，为一级种子。

1.2二级种子繁殖

将制备的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型一级种子按1％的体积接入TSB/NAD培养基中，37℃培养12～16小时，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。

2抗原制备

2.1亚单位抗原制备

2.1.1分泌毒素的制备

将检验合格的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型菌液，离心分离上清液，用300KD的超滤管浓缩上清液。浓缩后所得上层清液缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使得其终浓度为55％～60％，12000g离心15分钟分离沉淀，将沉淀用PBS(pH7.4～7.6)重新溶解，通过3KD超滤管再浓缩。

上述制得的溶血毒素Apx Ⅰ(APP3)、Apx Ⅱ(APP7)和细胞毒素Apx Ⅲ(APP10)分别进行SDS-PAGE和western-blot(抗猪单克隆抗体)检验，同时进行溶血活性和巨噬细胞毒性检验其生物活性，并通过BCA法测定浓度。

2.1.2分泌毒素的灭活

将检验合格的溶血毒素Apx Ⅰ(APP3)、Apx Ⅱ(APP7)和细胞毒素Apx Ⅲ(APP10)，按总体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃灭活24～48小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，分别进行溶血活性和巨噬细胞毒性检验，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无溶血活性，无巨噬细胞毒性且无细菌生长。

2.1.3分泌毒素浓缩

将检验合格后的灭活溶血毒素Apx Ⅰ(APP3)、Apx Ⅱ(APP7)和细胞毒素Apx Ⅲ(APP10)经超滤管(3KD)浓缩，根据灭活前浓度用灭菌PBS(pH7.4～7.6)调整浓度为300ug/mL。取样做无菌检验，应无细菌生长。

2.2菌体抗原制备

2.2.1菌液制备

将检定合格的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型二级种子按1％体积比接种到TSB/NAD培养基中，37℃培养18小时。后分别进行纯粹检验和活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。

2.2.2菌体抗原灭活

将检验合格的菌液，按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活24～36小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。

2.2.3菌体抗原浓缩

将检验合格的灭活菌体抗原经0.45um滤膜过滤，根据灭活前活菌计数结果用PBS(pH7.4～7.6)将灭活菌体抗原浓度调整为1.0*10¹⁰CFU/mL，取样做无菌检验，应无细菌生长。

3疫苗的制备

3.1疫苗的配置

将灭活的溶血毒素Apx Ⅰ(APP3)、Apx Ⅱ(APP7)和细胞毒素Apx Ⅲ(APP10)的浓缩-稀释液按体积比1:1:1混匀，将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型抗原浓缩-重悬稀释液按体积比1:1:1混匀，再将混匀后的灭活毒素与菌体抗原等体积混匀。

3.2疫苗的冻干

将灭菌的50％脱脂乳与预先混匀的疫苗以1:10体积混匀，无菌分装，冻干。

3.3疫苗专用稀释液的制备

将SEPPIC佐剂IMS1313VG与注射用水以3:7比例体积混匀，加入维生素E，使其终浓度为10mg/mL，用0.22um滤膜过滤除菌，2～8℃保存。

4无菌检验

取上述冻干疫苗及疫苗专用稀释液按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。

二、以上制备疫苗的安全性研究

取实施例1中制备的疫苗，按瓶签注明头份，加入疫苗专用稀释液，每头份1mL，完全溶解后肌肉注射1头份4～5周龄健康易感断奶仔猪5头，对照组5头，2周后，以相同方法相同剂量进行二免，观察21日，应无局部或全身不良反应且全部健活。结果见表1。

表1安全性研究结果

分组	实验动物数量	不良反应	健活数
				免疫组	5	无	5
对照组	5	无	5

安全性试验结果显示：副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗对仔猪安全。

三、疫苗效力研究

1试验设计

1.1疫苗免疫

取实施例1制备的疫苗，按瓶签注明头份，加入疫苗专用稀释液，每头份1mL，肌肉注射1头份4～5周龄健康易感断奶仔猪，每组40头，首免4周后二免，免疫剂量和方法同一免，同时设对照组40头，不免疫。

购买市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗(4型、5型)，猪链球菌灭活疫苗(2型)，猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，分别按其注射方法和注射剂量注射4～5周龄健康易感断奶仔猪。

表2疫苗免疫分组

1.2攻毒

免疫后2周，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌采用喷雾的方式攻毒，攻毒剂量为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)1型1×10⁹CFU、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)2型1×10⁹CFU、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)7型1×10⁹CFU。免疫后5周，副猪嗜血杆菌采用腹腔内注射攻毒，攻毒剂量为副猪嗜血杆菌4型1×10¹⁰CFU、副猪嗜血杆菌5型1×10¹⁰CFU。免疫后5周，猪链球菌2型采用静脉注射攻毒，攻毒剂量为1×10⁹CFU。攻毒分组如下表。

表3攻毒分组

1.3效力检验结果

副猪嗜血杆菌、猪链球菌及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌攻毒后观察2周，记录免疫组及对照组临床症状及死亡头数。结果见下表。

表4效力检验结果

副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗采用SEPPIC佐剂IMS1313VG并添加维生素E，免疫猪后免疫部位不会引起红肿发热的副反应，不会影响免疫后猪的精神及采食情况，有效提升了免疫猪只的免疫效果以及生产性能。副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌病保护力与市售疫苗无明显差异，保护率均在80％以上。与市售猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗相比，副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型、7型10型保护力均在80％以上，同时能对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、2型具有交叉保护力，达60％以上，而市售三价灭活疫苗对血清型3型、10型无交叉保护力。

副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗相比，免疫保护力相当，与猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗相比具有明显交叉免疫保护力，采用水溶性佐剂不引起免疫部位的副反应，添加维生素E有效提升了免疫猪只的免疫效果及生产性能，同时达到对副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病及猪传染性胸膜肺炎的有效预防的免疫效果。

实施例2

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；

2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至200ug/mL，由此分别得到Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液和Apx Ⅲ抗原溶液；

3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10⁷CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；

4)取步骤2)所述Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液、Apx Ⅲ抗原溶液，取步骤3)所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以1:1:1:2:2:2(v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；

5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。

在此基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基中，35℃培养18小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，35℃培养12小时，为一级种子；取所述一级种子以0.5％(v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，38℃培养12小时，得到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。

步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵至硫酸铵浓度为55％(w/w)，取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进行灭活。

步骤2)中灭活条件为：按溶液体积的0.25％加入甲醛溶液，35℃灭活24小时，期间每隔2小时搅拌一次，每次搅拌持续3分钟。

步骤3)中灭活条件为：按溶液体积的0.35％加入甲醛溶液，38℃灭活36小时，期间每隔3小时搅拌一次，每次搅拌持续5分钟。

步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。

步骤3)所述浓缩是以0.45μm孔径的滤膜实现的。

步骤5)取IMS 1313VG疫苗佐剂与水以2.5:7体积比混合，加入维生素E，调整佐剂浓度至9mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。

实施例3

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；

2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至400ug/mL，由此分别得到Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液和Apx Ⅲ抗原溶液；

3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10¹²CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；

4)取步骤2)所述Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液、Apx Ⅲ抗原溶液，取步骤3)所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以2:2:2:1:1:1(v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；

5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。

在此基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基中，38℃培养24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，38℃培养16小时，为一级种子；取所述一级种子以2％(v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，38℃培养16小时，得到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。

步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵至硫酸铵浓度为60％(w/w)，取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进行灭活。

步骤2)中灭活条件为：按溶液体积的0.35％加入甲醛溶液，38℃灭活48小时，期间每隔3小时搅拌一次，每次搅拌持续5分钟。

步骤3)中灭活条件为：按溶液体积的0.25％加入甲醛溶液，35℃灭活24小时，期间每隔2小时搅拌一次，每次搅拌持续3分钟。

步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。

步骤3)所述浓缩是以0.45μm孔径的滤膜实现的。

步骤5)取IMS 1313VG疫苗佐剂与水以3.5:7体积比混合，加入维生素E，调整佐剂浓度至11mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。

实施例4

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；

2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至300ug/mL，由此分别得到Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液和Apx Ⅲ抗原溶液；

3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10⁹CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；

4)取步骤2)所述Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液、Apx Ⅲ抗原溶液，取步骤3)所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以1.8:1.1:1.4:1.5:1.9:1.2(v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；

5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。

在此基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基中，36℃培养21小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，36℃培养14小时，为一级种子；取所述一级种子以1％(v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，36℃培养14小时，得到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。

步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵至硫酸铵浓度为58％(w/w)，取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进行灭活。

步骤2)中灭活条件为：按溶液体积的0.2％加入甲醛溶液，36℃灭活36小时，期间每隔2.5小时搅拌一次，每次搅拌持续4分钟。

步骤3)中灭活条件为：按溶液体积的0.2％加入甲醛溶液，36℃灭活30小时，期间每隔2.5小时搅拌一次，每次搅拌持续4分钟。

步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。

步骤3)所述浓缩是以0.45μm孔径的滤膜实现的。

步骤5)取IMS 1313VG疫苗佐剂与水以3:7体积比混合，加入维生素E，调整佐剂浓度至10mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。

实施例5

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；

2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至330ug/mL，由此分别得到Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液和Apx Ⅲ抗原溶液；

3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10⁶CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；

4)取步骤2)所述Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液、Apx Ⅲ抗原溶液，取步骤3)所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以1.6:1:1.2:2:1.1:1.8(v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；

5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。

实施例6

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素Apx Ⅲ为抗原，经灭活后制备的。其中，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素Apx Ⅲ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型提取得到的。

实施例7

一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素Apx Ⅲ为抗原，经灭活后制备的。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅢ为抗原，经灭活后制备的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅰ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx Ⅱ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅢ是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型提取得到的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；

2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至200-400ug/mL，由此分别得到ApxⅠ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液和ApxⅢ抗原溶液；

3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10⁷～10¹²CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；

4)取步骤2)所述Apx Ⅰ抗原溶液、Apx Ⅱ抗原溶液、ApxⅢ抗原溶液，取步骤3)所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)(v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；

5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基中，35～38℃培养18～24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，35～38℃培养12～16小时，为一级种子；取所述一级种子以0.5～2％(v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，35～38℃培养12～16小时，得到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进行灭活。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于加入饱和硫酸铵后溶液中硫酸铵浓度为55～60％(w/w)。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)或步骤3)所述灭活是通过以下方法实现的：按溶液体积的0.25～0.35％加入甲醛溶液，35～38℃灭活24～48小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次搅拌持续3～5分钟。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤3)所述浓缩是以0.45μm孔径的滤膜实现的。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤5)取IMS 1313VG疫苗佐剂与水以(2.5～3.5):7体积比混合，加入维生素E，调整佐剂浓度至9～11mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。