CN112704732A

CN112704732A - 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗

Info

Publication number: CN112704732A
Application number: CN202011545258.1A
Authority: CN
Inventors: 贝为成; 刘迦慧; 刘婷; 张年; 章宝; 陈焕春
Original assignee: Guangxi Yangxiang Agriculture And Animal Husbandry Co ltd; Huazhong Agricultural University
Current assignee: Guangxi Yangxiang Agriculture And Animal Husbandry Co ltd; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112704732B

Abstract

本发明公开了一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，属于兽用疫苗领域。本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示的蛋白1‑3组合。本发明抗原蛋白组合中选择的截短蛋白在APP所有血清型高度同源，将其制备成亚单位疫苗能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护；这些截短蛋白都以可溶形式表达，易于生产，成本低。

Description

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及兽用疫苗领域，具体涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae，PCP)是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引发的通常具有发病突然、病程短、发病率高和死亡率高等特点的呼吸道传染病。该病常发生于4～5月和9～11月，有明显的季节性，此外多种因素可诱发本病如通风不畅、拥挤、转群、潮湿、长途运输等。此病尤多发于育肥猪，常见为急性爆发导致的死亡(最急性死亡率高达100％)和混合感染(与PRRS、PRV、HPS等)引起的猪只生长缓慢，甚至死亡；而在急性发病中幸存或被亚临床感染的猪只可能会在鼻腔，扁桃体隐窝和慢性肺部病变中携带APP，从而成为潜在感染源，严重影响及威胁着养猪业的健康发展。本病病程多属于亚急性至急性，发病多致死亡。慢性病例中，即便临床症状不明显，但屠宰时可见肺脏病变(纤维素性黏连、肺水肿、脓肿等)，严重影响猪场生产成绩及屠宰猪肉品质。

猪胸膜肺炎放线杆菌至少具有18个血清型，不同血清型之间缺乏有效的免疫交叉保护。自2000年以来，猪传染性胸膜肺炎在全国都有流行，主要流行的血清型为1、2、3、5、7型，且在不同省市流行的血清型也有差异，在南方地区多以1、3、7型为主；在北方大多数地区主要流行5型和7型。目前对猪传染性胸膜肺炎相关疫苗的研究大致包括灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗三大类别，商业化的疫苗仅有全菌灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。其中全菌灭活苗因受APP各血清型间的有限保护力限制，在制备和使用时需要考虑当地流行血清型的问题，无法实现通用。而现有的商品化亚单位灭活疫苗属于进口苗，价格高昂不说，且其疫苗成分仅有外膜蛋白(OMP)属于亚单位组分，有关毒素类组分(ApxI、ApxII、ApxⅢ)其实属于类毒素。亚单位疫苗，具有交叉保护性好，可有效减少死亡率和肺脏病变，已日益成为疫苗研发的热点，且随着我国“禁抗”、“限抗”、“无抗”养殖理念的不断强化，各种替抗产品成为行业亟需，优质的猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗必将顺势成为抗菌利器。

申请人前期通过研究(硕士学位论文《猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的制备及免疫效果的评价》(作者刘婷，单位华中农业大学，年度2019年)发现将重组蛋白rApxIARH、rApxIIAM、rApxIIIAN、rOmlA、rTbpB组合的亚单位疫苗的免疫保护效果与商品化亚单位灭活疫苗(默沙东的猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位灭活疫苗保猪利

爱普克

APP))相当，其缺点在于组份多、rApxIIIAN不能通过可溶形式表达获得。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原组合及其在制备亚单位疫苗中的应用，以缓解现有技术中缺少一种成本低、效果好的猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合，包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1-3所示的蛋白1-3。其中，蛋白1为外毒素ApxIIAM的截短蛋白；蛋白2为外膜蛋白OmlA的截短蛋白；蛋白3为转铁结合蛋白TbpB的截短蛋白。进一步地，编码蛋白1-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合在制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用。

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，包含所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合，还包含佐剂，所述的佐剂优选为氢氧化铝佐剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明抗原蛋白组合中选择的截短蛋白在APP所有血清型高度同源，将其制备成亚单位疫苗能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护。

(2)本发明抗原蛋白组合中选择的截短蛋白都以可溶形式表达，易于生产，在增加免疫剂量的基础上达到了现有亚单位疫苗的免疫保护效果，总体成本低。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

(1)重组表达质粒的构建

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA为模板，使用表1中所示引物通过PCR扩增目的片段。

表1引物信息

将扩增的各目的片段与质粒pET-20b(+)分别使用NdeI和XhoI进行双酶切处理，再通过连接、转化大肠杆菌DH5α，最终构建得到重组表达质粒pET20b-apxIIAM、pET20b-omlA和pET20b-tbpB。这些重组表达质粒经酶切和测序鉴定，均与预期相符，序列无突变、成功插入到pET20b载体上。

(2)重组蛋白的表达及纯化

将所构建的重组表达质粒pET20b-apxIIAM、pET20b-omlA和pET20b-tbpB转化大肠杆菌BL21，从平板上挑取细菌于细菌瓶内培养OD₆₀₀至0.6-0.8时，取适量的菌液做空白对照(不加IPTG)，剩余培养的菌液中加入IPTG(1.0mM)于37℃摇床诱导表达4h。诱导结束后，离心收集菌体，重悬、破碎后收集上清及包涵体，进行SDS-PAGE电泳。结果表明：3个重组蛋白均出现特异性的蛋白条带，大约在13KDa(rApxIIAM)、40KDa(rOmlA)、60KDa(rTbpB)的位置出现，与预测的大小一致，说明重组蛋白均已表达，且rApxIIAM、rOmlA、rTbpB均在上清表达(可溶性表达)。

可溶性表达的蛋白用镍柱纯化，得到纯化的rApxIIAM、rOmlA、rTbpB蛋白。进一步通过Western Blot分析，表明重组蛋白表达成功，且具有很好的免疫原性。

实施例2

通过BCA法测定实施例1中纯化后的各重组蛋白的浓度，将重组蛋白按照一定的比例组合后与氢氧化铝佐剂等体积混合，得到各重组蛋白含量均为200μg/mL的三组份重组亚单位疫苗，用于下述免疫攻毒实验。

疫苗无菌检验：将制备好的疫苗无菌吸取200μL涂布TSA+NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷，5μg/mL)的平皿，37℃培养过夜，平皿上没有菌落生长。

实施例3

通过仔猪临床试验对实施例2得到的三组份重组亚单位疫苗的安全性和有效性进行验证，并用默沙东的猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位灭活疫苗保猪利

爱普克

APP)做对照。猪免疫前采血用猪胸膜肺炎放线杆菌鉴别诊断试剂盒对血清进行检测，确保试验猪均为阴性猪。

8周龄仔猪分为3组进行免疫，每组5只，试验分组如下：

疫苗Ⅰ组：rApxIIAM、rOmlA、rTbpB三组份重组亚单位疫苗；

疫苗Ⅱ组：默沙东猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位灭活疫苗(含1种外膜蛋白和3种类毒素ApxI、ApxII、ApxIII)；

空白对照组：PBS+氢氧化铝佐剂。

免疫攻毒保护试验：一免14天后二免，二免21天后进行攻毒。采用APP5型进行滴鼻攻毒，攻毒剂量为1×10⁸CFU，攻毒后持续观察两周。免疫攻毒保护情况见表2。

表2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗免疫攻毒保护情况

试验结果表明，本发明的三组份重组亚单位疫苗的免疫保护效果与默沙东的四组份猪传染性胸膜肺炎亚单位灭活疫苗的保护效果相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

广西扬翔农牧有限责任公司

<120> 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400> 1

Gly Gly Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val Asn Leu

1 5 10 15

Asn Glu Leu Leu Gln Asn Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala Ser Ser

35 40 45

Val Gln Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Ile Ser Lys Leu Gly Ser

50 55 60

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65 70 75 80

Asn Leu Pro Asp Leu Gly Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile Ile Ser

85 90 95

Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp Lys Glu

100 105 110

Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala

115 120

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

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Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Lys Pro Asn Ser Lys Pro Thr

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Asn Leu Gln Glu Lys Ser Pro Lys Ala Asp Glu Pro Gln Val Met Asp

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Pro Lys Leu Gly Ala Pro Gln Lys Asp Asp Gln Lys Leu Glu Glu Pro

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Lys Asn Lys Ser Asn Ala Glu Ile Leu Lys Glu Leu Gly Ile Lys Asp

100 105 110

Ile Lys Thr Gly Ile Ile Thr Arg Ser Asp Val Val Leu Asn Leu Thr

115 120 125

Leu Asp Glu Gln Glu Asn Ile Gln Ile Arg Leu Ser Glu Ser Asp Ile

130 135 140

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145 150 155 160

Arg Thr Leu Lys Asp Ser Thr Gly Arg Leu Leu Gly Tyr Tyr Gly Tyr

165 170 175

Met Gln Leu Asn Gln Val Arg Glu Gly Glu Arg Tyr Gly Ile Asn Asn

180 185 190

Val Asp Leu Val Gly His Tyr Leu Leu Ser Met Asp Glu Ser Thr Lys

195 200 205

Thr Ala Pro Asn Lys Ser Ile Glu Tyr Arg Gly Lys Met Leu Tyr Gly

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Gly Asp Tyr Trp Lys Leu Gly Ala Ile Gly Asn Asn Arg Leu Pro Lys

260 265 270

Asp Met Val Thr Gly Val Val Val Asp Lys Asp Gly Thr Ile Ser Asn

275 280 285

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290 295 300

Asp Ala Thr Phe Ser Gly Gly Ile Phe Gly Lys Asn Gly Asp Val Leu

305 310 315 320

Ala Gly Ser Ala Asp Gly Lys Asn Trp Gln Gly Val Ile Gly Ala Thr

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Lys Ala Glu Glu Arg Val Glu Leu Ser Pro Asp Asn Ile Lys Arg Leu

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130 135 140

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145 150 155 160

Gly Ile Asn Pro Ser Lys Ala Leu Pro Val Asp Lys Ile Val Lys Tyr

165 170 175

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260 265 270

Ala Lys Ala Thr Asp Pro Lys Asp Arg Tyr Phe Gly Lys Asp Ala Asn

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

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ttagttggta atattgctag ctcggtgcaa actgtagatg catttgcaga acaaatatct 180

aaactaggtt cacatttaca gaatgtgaaa ggattaggag gattgagtaa taaattacaa 240

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ggagcatctg caggtctcat tttagcagat aaagaggctt caacagaaaa gaaagctgcc 360

gca 363

<210> 5

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<212> DNA

<213> 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

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ggcggcggct catcgggttc atcgtctaaa ccaaattcga aacctacgcc taaggttgat 60

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tcagatgtag tactaaattt aacattggat gaacaagaaa atattcagat tagattaagt 420

gaaagtgata tagtccgtaa tgatttaaaa attacaaata caattccaaa tcaagacatc 480

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ttatctatgg acgaatcaac aaaaacagct ccaaataaat ctatagaata tagaggtaag 660

atgctatatg gctataaaaa tgtagataat aggaacttag tggcagacgt acaagcatca 720

tataatcatt cagataaaaa attatcgatg gagatatttg gtgatcacgg tgattattgg 780

aagctaggtg caattggtaa taatcgatta cctaaagata tggttacagg cgttgtagtt 840

gataaggatg gtactatctc aaatgctggt ttgtattcaa aaatagataa tactccagga 900

aaactaaccc cggacgccac tttctccggc ggtattttcg gtaaaaatgg tgatgtactt 960

gcaggaagtg ctgatggtaa aaactggcaa ggcgtaatcg gagctactgc tactgaagca 1020

aataagaaa 1029

<210> 6

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<212> DNA

<213> 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400> 6

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gatttcacta ccgatgcggt aaataaacga agagcgcaag gctttgaaga gtcttatatc 600

ggagatcgct atggtgcgat ttcctatgat gaacctatta ataatgataa atacggagca 660

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gtaatagata aaaacggttt ttccggcgtc gtaaaaacac ttaaagacgg ttttagcgca 1500

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<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atatacatat gggtggtatt caatctattt taggat 36

<210> 8

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<212> DNA

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<400> 8

attgctcgag tgcggcagct ttcttttctg 30

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

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<400> 9

atatacatat gggcggcggc tcatcgggtt c 31

<210> 10

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<212> DNA

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attgctcgag tttcttattt gcttcagtag cagtag 36

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

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<400> 11

atatacatat gtgttcaggt ggtaaaggtg gtt 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgctcgag tttcttctcg acttgacgtt ttg 33

Claims

1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合，其特征在于：包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的蛋白1-3。

2.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合，其特征在于：编码蛋白1-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

3.权利要求1或2所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合在制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用。

4.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，其特征在于：包含权利要求1或2所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合。

5.根据权利要求4所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，其特征在于：还包含佐剂。

6.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。