CN105497885A - 一种亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。该疫苗组合物种几种蛋白抗原组合使用，协同刺激机体免疫反应，只需要免疫一次即可产生良好的保护作用，对不同血清型猪巴氏杆菌的混合感染有较好的保护作用。本发明还提供了该疫苗组合物的制备方法，通过基因工程手段对蛋白抗原进行大量表达产生，利于大规模生产。经试验证明本发明的疫苗组合物可有效保护猪只抵抗不同血清型猪巴氏杆菌的混合感染，其应用对于提供一种完善预防和/或治疗猪巴氏杆菌感染的途径，和对于净化猪巴氏杆菌有着积极的现实意义。

Description

一种亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种亚单位疫苗，该疫苗的制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属多杀性巴氏杆菌种，是有荚膜的革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧。根据其荚膜和脂多糖的不同，可将Pm分为A、B、D、E、F5个血清群和16个血清型，A型主要引起禽霍乱，B、E型主要引起出血性败血症，产毒素的D型主要引起猪萎缩性鼻炎。该病原菌在世界各地均有流行，宿主范围较广，可感染多种动物并引起发病，不同动物感染后发病症状和病理变化不尽相同。

猪的多杀性巴氏杆菌病多数是由PmA、B、D血清型引起，非产毒素多杀性巴氏杆菌主要引发猪肺疫，又称猪出血性败血症，俗称“锁喉风”。该病最急性型呈败血症症状，咽喉部急性肿胀，高度呼吸困难，犬坐姿势，死亡迅速；急性型表现为纤维素性胸膜肺炎症状；慢性型多为慢性肺炎、胃肠炎以及逐渐消瘦，有时伴发关节炎。产毒素多杀性巴氏杆菌主要引起进行性猪萎缩性鼻炎，该病会导致猪鼻甲骨萎缩、鼻吻变形及全身骨骼发育受到影响，使猪的生长迟缓，容易继发复合性肺炎，给养猪业造成巨大的经济损失。

目前临床上用于预防多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗，灭活苗对巴氏杆菌不同血清型的交叉保护能力差、保护期短；弱毒活疫苗的免疫效果易受环境等因素的影响且存在毒力返强的风险。无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗，均需要多次重复免疫，面对异型菌株的攻击，其保护功效是十分有限的。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物，包含三种猪巴氏杆菌免疫保护性抗原和佐剂。

本发明的第一方面包括一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。

本发明采用大肠杆菌表达的OmpA、OmpH及PlpE蛋白制备猪巴氏杆菌亚单位疫苗，对猪巴氏杆菌不同血清型提供全面的保护；使用吸收效果好的新型水溶性佐剂，避免免疫局部出现不良反应，提高免疫应答及对猪的免疫保护作用。

本发明首次通过将Pm的外膜蛋白OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白组合使用，针对不同血清型猪巴氏杆菌感染有较好的保护作用，而且只需要免疫一次，避免多次重复免疫带来的应激反应。通过免疫效力比较试验，意外发现，几种蛋白组合使用，协同刺激机体免疫反应，能够有效降低免疫剂量，大大降低免疫成本。

本发明提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原为P.multocida重组OmpA、OmpH、PlpE蛋白。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.5,所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.6。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原OmpA蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原OmpH蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原PlpE蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述编码猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白的核苷酸序列为SEQ.NO.1,所述编码猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白的核苷酸序列为SEQ.NO.2,所述编码猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白的核苷酸序列为SEQ.NO.3。

本发明提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白、PlpE蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。

术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪巴氏杆菌菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。

术语“片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。

术语“保护性反应”意为在动物中预防猪巴氏杆菌相关疾病或由猪巴氏杆菌导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。

本发明涉及的猪巴氏杆菌多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。

如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪巴氏杆菌菌株攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。

当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO：4-6中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。

在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为100-400μg/ml。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

优选地，对于动物猪而言，本发明疫苗组合物OmpA蛋白抗原含量为50-100μg/ml；OmpH蛋白抗原含量为50-100μg/ml；PlpE蛋白抗原含量为100-400μg/ml。

更优选地，所述疫苗组合物OmpA蛋白抗原含量为100μg/ml；OmpH蛋白抗原含量为100μg/ml；PlpE蛋白抗原含量为200μg/ml。

作为本发明的一种最优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为200μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为50μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为50μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为100μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为400μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包含佐剂，所述佐剂包括油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”，是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。

本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。

本发明所用术语“铝盐佐剂”，又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”，包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。

本发明所用术语“细胞因子佐剂”，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等，又称“细胞因子”或“细胞素”，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞，在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在免疫系统中起着非常重要的调控作用。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述佐剂包括水佐剂。

本发明实施例中使用了水溶性佐剂中的一种gel佐剂。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/治疗猪巴氏杆菌感染的疫苗组合物，由猪巴氏杆菌免疫抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白、PlpE蛋白和gel佐剂组成。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述的水佐剂为体积比10％的gel佐剂。

作为本发明的一种最优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为200μg/ml以及体积比为10％的Gel佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为50μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为50μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为100μg/ml以及体积比为10％的Gel佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为400μg/ml以及体积比为10％的Gel佐剂。

本发明疫苗组合物还可以进一步包含其他的试剂。例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))，抗氧化剂，表面活性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明的另一方面包括一种制备所述疫苗组合物的方法,其中，所述方法包括：(1)分别克隆表达所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白；以及(2)混合所述表达的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法，包括：

(1)制备OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白抗原；

(2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化。

抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段，例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如“克隆载体”，其被设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸；“表达载体”，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列；或“病毒载体”，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或“穿梭载体”，其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明猪链球菌抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪巴氏杆菌抗原的制备还包括通过人工合成的方式来实现。

本发明的另一方面包括所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪巴氏杆菌相关疾病的药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供包含猪巴氏杆菌免疫抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白、PlpE蛋白或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌相关疾病或感染的组合物中的应用。

本发明可以应用的猪巴氏杆菌相关疾病的非穷举性列表包括，如猪出血性败血症、肺炎、肠胃炎和关节炎。

术语“预防”指通过其与猪巴氏杆菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与猪巴氏杆菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。

本发明的而另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备预防和/治疗猪巴氏杆菌相关疾病或感染的药物的应用。

作为本发明的一种优选实施方式，所述猪巴氏杆菌相关疾病为多种猪巴氏杆菌混合感染导致的。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1P.multocidaOmpA、OmpH、PlpE基因PCR扩增与原核表达质粒的构建

1.1引物的设计

根据GenBank中已发表的P.multocidapm-113株(登录号：JX435111.1)的OmpA基因序列、pm-70株(登录号：AE004439.1)基因全长序列中的OmpH、PlpE基因序列，利用Primer5.0软件分别设计3对引物，上下游引物5’端分别引入BamHI、XhoI酶切位点及保护性碱基，用于扩增OmpA、OmpH、PlpE基因全长序列，3对引物的序列见表1，其中画线部分为引入的酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。

表1引物序列

1.2P.multocidaA型HN5株基因组DNA的提取

将多杀性巴氏杆菌A型HN5株菌种划线于TSA平板，与37℃培养16-20h，挑取单克隆于含5mlBHI培养基的试管中，于200rpm、37℃振荡培养16-24h，获得的菌液用试剂盒提取P.multocida基因组DNA。

1.3OmpA、OmpH、PlpE基因PCR扩增

1.3.1OmpA基因的扩增

PCR反应体系为：ompA上下游引物各2.5μl，DNA聚合酶0.5μl，dNTP3μl，10×buffer5μl，无菌双蒸水31.5μl，模板5μl；PCR反应程序为：95℃预变性1min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物使用1％凝胶进行电泳检测。

结果：出现与目的基因1056bp大小相符的片段，将该目的基因片段用胶回收试剂盒回收。

1.3.2OmpH基因的扩增

PCR反应体系为：OmpH上下游引物各2.5μl，DNA聚合酶0.5μl，dNTP3μl，10×buffer5μl，无菌双蒸水31.5μl，模板5μl；PCR反应程序为：95℃预变性1min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物使用1％凝胶进行电泳检测。

结果：出现与目的基因942bp大小相符的片段，将该目的基因片段用胶回收试剂盒回收。

1.3.3PlpE基因的扩增

PCR反应体系为：PlpE上下游引物各2.5μl，DNA聚合酶0.5μl，dNTP3μl，10×buffer5μl，无菌双蒸水31.5μl，模板5μl；PCR反应程序为：95℃预变性1min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物使用1％凝胶进行电泳检测。

结果：出现与目的基因1008bp大小相符的片段，将该目的基因片段用胶回收试剂盒回收。

1.4重组质粒的构建

回收的目的基因用BamHI/XhoI进行双酶切，回收纯化后与经同样酶切处理的pET-32a载体连接，连接体系如下：目的基因20μl、pET-32a载体0.5μl、连接酶缓冲液2.0μl、T4DNA连接酶1.0μl、灭菌双蒸水8.5μl。连接反应条件为16℃，30min。

1.5重组质粒的鉴定

从-80℃冰箱取出E.coliDH5α感受态细胞，置冰上缓慢解冻，待完全融化后，加入10μl连接产物，混匀后冰浴30min；42℃水浴锅加热45s后，冰浴1min，加入890μl的LB液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养板，37℃培养过夜。挑典型菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，200rpm培养10h。取1ml菌液煮沸10min，12000rpm离心5min，取上清作为模板，进行PCR鉴定，PCR程序同实施例1.2.1～1.2.3；同时提取质粒，使用BamHI/XhoI进行双酶切鉴定，酶切产物经1％凝胶电泳检测，并回收目的基因片段。将PCR和酶切鉴定均为阳性的质粒送上海Invitrogen公司进行测序。经测序正确的重组质粒分别命名为PET-OmpA、PET-OmpH、PET-PlpE。

实施例2重组表达菌株BL21-OmpA、BL21-OmpH及BL21-PlpE的构建

2.1重组质粒转化E.coliBL-21感受态细胞及重组蛋白表达

实施例1中经测序正确的重组质粒转化E.coliBL-21感受态细胞，分别得到重组表达菌株BL21-OmpA、BL21-OmpH、BL21-PlpE，同时将空质粒pET-32a以同样的方法转化E.coliBL-21感受态细胞，涂布含氨苄的LB固体培养基，37℃培养16h后挑取生长良好的单个菌落分别接种于10ml的含氨苄的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养2h。待菌液OD₆₀₀值达到0.6时，分别取1mL未诱导的表达菌液和空质粒菌液作为诱导前样品，剩余菌液中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达4～5h，分别取1mL诱导后的表达菌液和空质粒菌液作为诱导后样品。

2.2重组蛋白的SDS-PAGE检测

将实施例2.1所取样品1mL12000rpm离心1min，弃上清，在沉淀中加入50ul灭菌双蒸水后混匀，再加入等体积的2×SDSLoadingBuffer，混匀后于沸水中煮5～10min，离心后取10ul上清液进行SDS-PAGE电泳。结果：诱导后的BL21-OmpA、BL21-OmpH、BL21-PlpE重组表达菌分别在57.9Kda、54.2KDa、56.8KDa附近出现条带，与预期的三种重组蛋白大小基本一致，未诱导的重组表达菌没有出现目的条带，诱导后的空质粒菌表达20KDa左右的组氨酸标签蛋白。

2.3重组蛋白的WesternBlot检测

(1)诱导后的表达产物进行SDS-PAGE；(2)使用蛋白转膜仪转印至PVDF膜；(3)转印结束后，将PVDF膜用PBST洗涤后投入丽春红染色液中染色5～10min，当蛋白条带出现后，用PBST洗涤数次，直至洗去丽春红染色液；(4)将PVDF膜用含5％脱脂乳的PBST封闭液室温振荡封闭2h左右；(5)用PBST洗涤后，加入兔抗PmD型HB4株多克隆抗血清，室温作用2h，使用PBST洗涤4次，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG-HRP，37℃作用2h后，进行显色。

结果：重组BL21-OmpA、BL21-OmpH、BL21-PlpE表达的r-OmpA、r-OmpH、r-PlpE蛋白，可特异性的与兔抗Pm阳性血清进行反应。

2.4重组蛋白r-OmpA、r-OmpH、r-PlpE的纯化

按实施例2中的方法分别诱导表达BL21-OmpA、BL21-OmpH、BL21-PlpE重组表达菌各500mL，离心收集菌体，重悬于50ml菌体裂解液中，室温作用30min，4℃冰浴超声波裂解后12000rpm离心30min，收集含有可溶性蛋白的上清液。上清经His亲和层析纯化重组蛋白，再经G25凝胶过滤层析除掉样品中的咪唑，收集纯化蛋白并用核酸蛋白仪测定重组蛋白浓度，同时按实施例2中的SDS-PAGE方法测定重组蛋白纯度。将纯化的重组蛋白装入透析袋中，依次用5mol/L、4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L的尿素于4℃搅拌条件下透析处理，每个梯度维持6～8h，核酸蛋白仪测定重组蛋白浓度，经浓缩后蛋白浓度为1.5mg/mL。

实施例3Pm疫苗的制备

3.1重组Pm亚单位疫苗的制备

将r-OmpA、r-OmpH、r-PlpE重组蛋白按照一定比例组合，加入一定量的Gel佐剂(法国赛比克公司)混合后制成含不同浓度三种重组蛋白成分的Pm亚单位疫苗，每种疫苗中三种重组蛋白成分浓度如表2。

表2不同疫苗蛋白含量

实施例4重组亚单位疫苗的安全性检验

4.1BALB/c小鼠安全性检验

16～18gBALB/c小鼠10只/组，每只皮下注射重组亚单位疫苗0.5mL，免疫后观察14日，观察小鼠是否健活，包括采食、饮水、精神、行为状况等，检查注射部位有无异常。

结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6各免疫的10只BALB/c小鼠，精神状态良好，采食及饮水正常，无不良反应，无死亡情况。证明本发明猪巴氏杆菌疫苗组合物对小鼠是安全的。

4.2仔猪的安全性检验

选取14～21日龄Pm抗原、抗体均为阴性的健康仔猪5头/组，每头仔猪颈部肌肉注射重组亚单位疫苗4mL，免疫后所有仔猪连续观察14日，包括精神、采食、饮水、行为状况等有无异常，同时观察疫苗注射部位有无红肿等异常，14日后剖检注射部位取样制作组织切片，观察有无炎症、疫苗残留、肉芽肿等。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6各免疫仔猪观察14日均未见不良反应，精神状态良好，采食、饮水正常，无死亡情况。剖杀后所有脏器未见异常变化，疫苗注射部位剖检未见疫苗残留，组织切片观察未见炎症、肉芽肿、坏死等异常情况。

证明本发明猪巴氏杆菌疫苗组合物具有较好的安全性。

实施例5重组亚单位疫苗的效力试验

5.1重组亚单位疫苗对BALB/c小鼠的效力试验

16～18gBALB/c小鼠80只，随机分为8组，10只/组，试验分组见表3。免疫后两周，连同攻毒对照组皮下注射10倍LD₅₀PmA型HN5株，观察10天并记录各组小鼠的临床症状和死亡情况，统计存活率，10天后对存活的小鼠进行解剖，观察脏器病变。

表3BALB/c小鼠的效力试验分组

结果:攻毒对照组小鼠在12h内全部死亡，剖检可见肺脏、脾脏、肝脏有出血点；第1组、第2组和第3组小鼠分别在攻毒后36h、48h、24h内各死亡6只、5只、4只，剖检可见同攻毒对照组相似的病变，其余存活小鼠攻毒后精神不振、食欲减退、扎堆，之后逐步恢复正常；第4组、第5组和第6组小鼠分别在攻毒后72h、48h、48h内死亡2只、1只和1只，剖检可见肺充血，其余存活小鼠攻毒后出现精神不振，48h后开始恢复正常；第8组存活，无异常现象发生。综上，Pm亚单位疫苗中含三种蛋白成分的疫苗对小鼠的保护效果优于含单一蛋白成分的疫苗。具体结果见表4。

表4BALB/c小鼠的效力试验结果

5.2重组亚单位疫苗对仔猪的效力试验

选取14～21日龄Pm抗原、抗体均为阴性的健康仔猪80头，随机分为8组，每组10头，分免疫组(6组)和攻毒对照组(1组)及空白对照组(1组)，试验分组见表5。免疫后21日，连同攻毒对照组用PmA型HN5株(活菌量约为2×10¹⁰CFU)皮下注射进行攻毒，攻毒后连续观察35天，每天测温并记录各组仔猪临床症状，观察结束后剖杀所有试验猪，观察肺部及其他脏器肉眼病变，取病变肺组织制作病理切片观察组织病变。发病判断标准：(1)体温升高(≥40.5℃)，持续至少3日；(2)出现咳嗽、呼吸困难；(3)肺脏有肉眼可见病变；(4)肺组织病理切片有充血、水肿或化脓性病灶等。符合以上任何3项即可判为发病。

表5仔猪的效力试验分组

结果：攻毒对照组仔猪全部发病，攻毒后12h内体温升高至40.5℃以上，并持续3日以上，临床表现精神不振、食欲减退、呼吸困难和咳嗽症状，剖检可见气管粘液增多，肺脏呈暗红色，出血、肿大，肺组织切片可见小叶间及肺泡壁充血、水肿，有炎性渗出物和化脓性病灶；对比攻毒对照组的临床症状及病理变化，综合各疫苗免疫组的临床症状和病理变化结果，可以得出：含有3种蛋白成分的Pm亚单位疫苗的免疫效果优于单一蛋白成分的Pm亚单位疫苗。具体结果见表6、表7。

表6仔猪效力试验结果

注：①体温升高：“0分”表示体温正常，“1分”表示体温≥40.5℃的持续时间在1d以内，“2分”表示体温≥40.5℃的持续时间在1～2d，“3分”表示体温≥40.5℃的持续时间在2～3d，“4分”表示体温≥40.5℃的持续时间在3d以上；②咳嗽、呼吸困难：“0分”表示正常，“1分”表示症状轻微，“2分”表示症状严重，“3分”表示症状较严重，“4分”表示症状极严重；③精神、食欲：“0分”表示精神、采食正常，“1分”表示精神稍差、采食量稍减少，“2分”表示精神差、采食量少，“3分”表示精神较差、采食量较少，“4分”表示精神极差、采食量极少；④肺脏肉眼病变：“0分”表示正常，“1分”表示病变轻微，“2分”表示病变严重，“3分”表示病变较严重，“4分”表示病变极严重；⑤肺组织切片病变：“0分”表示正常，“1分”表示有轻微病变，“2分”表示病变严重，“3分”表示病变较严重，“4分”表示病变极严重。

表7仔猪效力试验结果统计

注：字母标注表示疫苗免疫仔猪后临床症状和病理变化平均分数与攻毒对照及正常对照组比较的显著性差异结果，不同的大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

仔猪效力试验评分统计结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3组三组之间差异不显著(P﹥0.05)，疫苗4、疫苗5、疫苗6组三组之间差异不显著(P﹥0.05)，疫苗1与疫苗4、疫苗5、疫苗6组差异极显著(P＜0.01)，与攻毒对照组差异不显著(P﹥0.05)，与空白对照组差异极显著(P＜0.01)，疫苗2、疫苗3与疫苗4、疫苗5、疫苗6组差异显著(P﹤0.05)，与攻毒对照组差异显著(P﹤0.05)，与空白对照组差异极显著(P＜0.01)，疫苗4、疫苗5、疫苗6与攻毒对照组差异极显著(P＜0.01)，与空白对照组差异不显著(P﹥0.05)。结果证明Pm亚单位疫苗中含三种蛋白成分的疫苗对仔猪的保护效果优于含单一蛋白成分的疫苗，从单一蛋白成分的疫苗保护结果对比情况来看，PlpE、OmpH蛋白的免疫效果比OmpA蛋白好一些。

5.3重组亚单位疫苗不同血清型交叉保护效力试验

选取14～21日龄Pm抗原、抗体均为阴性的健康仔猪30头，随机分为6组，5头/组，分免疫组(4组)和攻毒对照组(1组)及空白对照组(1组)，试验分组见表8。首免后21日，连同攻毒对照组分别用PmB型C44-1株、PmD型HB4株混合菌液(活菌量各2×10¹⁰CFU)皮下注射进行攻毒，攻毒后连续观察35天，每天测温并记录各组仔猪临床症状，观察结束后剖杀所有试验猪，观察肺部及其他脏器肉眼病变，取病变肺组织制作病理切片观察组织病变。发病判断标准：(1)体温升高(≥40.5℃)，持续至少3日；(2)出现咳嗽、呼吸困难；(3)肺脏有肉眼可见病变；(4)肺组织病理切片有充血、水肿或化脓性病灶等。符合以上任何3项即可判为发病。

表8仔猪效力试验分组

结果：PmB型C44-1株、PmD型HB4株混合菌液攻毒对照组第5组仔猪全部发病，攻毒后12h内体温升高至40.5℃以上，并持续3日以上，临床症状及剖检病变明显；第1组、第2组和第3组单一抗原均不同程度发病，其中第1组全部发病，第2组全部发病，第3组4头发病；第4组三种抗原成分免疫1头发病，4头获得保护；第6组存活，无异常现象发生。综合疫苗免疫组攻毒后的临床症状及病理变化情况，可以得出：本发明包含三种抗原疫苗组合物在抵抗多种血清型猪巴氏杆菌感染的保护效果要优于单一抗原疫苗，证明了本发明疫苗组合物可有效抵抗不同血清型猪巴氏杆菌的感染，提供了一种完善预防和/治疗猪巴氏杆菌感染的途径。具体结果见表9、表10。

表9仔猪效力试验结果

注：①体温升高：“0分”表示体温正常，“1分”表示体温≥40.5℃的持续时间在1d以内，“2分”表示体温≥40.5℃的持续时间在1～2d，“3分”表示体温≥40.5℃的持续时间在2～3d，“4分”表示体温≥40.5℃的持续时间在3d以上；②咳嗽、呼吸困难：“0分”表示正常，“1分”表示症状轻微，“2分”表示症状严重，“3分”表示症状较严重，“4分”表示症状极严重；③精神、食欲：“0分”表示精神、采食正常，“1分”表示精神稍差、采食量稍减少，“2分”表示精神差、采食量少，“3分”表示精神较差、采食量较少，“4分”表示精神极差、采食量极少；④肺脏肉眼病变：“0分”表示正常，“1分”表示病变轻微，“2分”表示病变严重，“3分”表示病变较严重，“4分”表示病变极严重；⑤肺组织切片病变：“0分”表示正常，“1分”表示有轻微病变，“2分”表示病变严重，“3分”表示病变较严重，“4分”表示病变极严重。

表10仔猪效力试验结果统计

注：字母标注表示疫苗免疫仔猪后临床症状和病理变化平均分数与攻毒对照及正常对照组比较的显著性差异结果，不同的大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

不同血清型交叉保护效力试验评分统计结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3组三组之间差异不显著(P﹥0.05)，疫苗1、疫苗2、疫苗3与疫苗6组差异极显著(P＜0.01)，与攻毒对照组差异不显著(P﹥0.05)，与空白对照组差异极显著(P＜0.01)，疫苗6组(第4组)与攻毒对照组差异极显著(P＜0.01)，与空白对照组差异不显著(P﹥0.05)。结果证明Pm亚单位疫苗中含三种蛋白成分的疫苗可以对仔猪提供很好的免疫和交叉保护性，而单一蛋白成分的亚单位疫苗的交叉保护效果较差，进一步说明了多种重组蛋白成分协同作用的保护效果优于单一重组蛋白成分。

5.4小鼠脾脏细胞增生刺激指数评估

5.4.1小鼠脾脏淋巴细胞的分离培养

将3周龄ICR小鼠随机分成试验组及阴性对照组，其中每组为5只。试验组分别肌肉注射0.25mL疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5和疫苗6，阴性对照组不进行免疫。3周后扑杀小鼠，无菌取小鼠脾淋巴细胞，用汉克氏液清洗，置于100μm滤网上轻轻磨细，制成单一细胞悬液，再以汉克氏液重复洗涤并离心，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×10⁶cells/mL，转入96孔细胞培养板，每孔100μL。

5.4.2细胞增生刺激指数评估

5.4.2.1免疫原刺激

将10μgOmpA、OmpH、PlpE分别加入每孔前述疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组制备的ICR小鼠脾脏淋巴细胞中，将30μg混合蛋白(OmpA、OmpH、PlpE各10μg)加入每孔前述疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组制备的ICR小鼠脾脏淋巴细胞中，置于37℃5％CO₂培养箱中培养72小时，然后分别加入5μg刀豆素A，置于37℃5％CO₂培养箱中培养72小时。阴性对照组则不加蛋白及刀豆素A。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3组三组之间样本差异不显著(P﹥0.05)，疫苗4、疫苗5、疫苗6组三组之间样本差异不显著(P﹥0.05)，疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6组样本与阴性对照组样本差异显著(P﹤0.05)，疫苗1、疫苗2、疫苗3组样本与疫苗4、疫苗5、疫苗6组样本差异显著(P﹤0.05)。

5.4.2.2MTT试验

在上述每孔细胞中，每孔加入20μLMTS试剂(MTS四氮唑)，混合均匀后，避光于37℃5％CO₂反应4小时，测定其波长492nm吸光值(OD₄₉₂)。

5.4.2.3细胞增生指数(stimulationindex；SI)计算

SI计算公式：细胞增生指数(SI)＝(试验组OD₄₉₂－背景值OD₄₉₂)/(阴性对照组OD₄₉₂－背景值OD₄₉₂)，其中，背景值为只添加RPMI-1640培养基与20μLMTS反应后所测定的OD₄₉₂值。

表11细胞增生指数统计结果

组别	1号	2号	3号	4号	5号	均值
							疫苗1	4.2	4.3	4.2	4.5	4.3	4.30±0.12
疫苗2	4.0	4.1	4.1	4.2	4.3	4.14±0.11
							疫苗3	4.2	4.4	4.1	4.2	4.2	4.22±0.11
疫苗4	6.0	6.2	6.2	6.3	6.4	6.22±0.15
							疫苗5	6.2	6.2	6.4	6.4	6.3	6.30±0.10
疫苗6	6.1	6.2	6.2	6.4	6.2	6.22±0.11
							阴性对照	2.2	2.4	2.2	2.2	2.3	2.26±0.09

SI结果显示试验组与对照组的细胞增殖效果差异显著(P﹤0.05)，其中疫苗1、疫苗2、疫苗3组三组之间差异不显著(P﹥0.05)，疫苗4、疫苗5、疫苗6组三组之间差异不显著(P﹥0.05)，疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6组样本与阴性对照组样本差异显著(P﹤0.05)，疫苗1、疫苗2、疫苗3组样本与疫苗4、疫苗5、疫苗6组样本差异显著(P﹤0.05)。证明了，OmpA、OmpH、PlpE三种蛋白对细胞增殖均有效果，其中含有三种蛋白成分对淋巴细胞增殖的效果要优于单一成分，进一步说明了多种抗原的组合诱导产生了协同作用。

由上述实施例可见，本发明采用大肠杆菌表达Pm外膜蛋白OmpA、OmpH、PlpE，这三种蛋白具有良好的免疫原性及交叉保护性，制成亚单位疫苗免疫仔猪后，能够对Pm不同血清型提供较为全面的保护，仅需一次免疫，经济实用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。同时本发明采用法国赛比克公司的Gel水佐剂，具有吸收好，免疫局部没有不良反应，免疫应答快，可以提高猪的免疫保护等优点。

本发明疫苗组合物可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分进行大量合成表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；本发明猪巴氏杆菌疫苗组合物中多免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫效果；本发明疫苗组合物可有效保护猪只抵抗不同血清型猪巴氏杆菌的感染，提供了一种完善预防和/或治疗猪巴氏杆菌感染的途径，对于净化猪巴氏杆菌有着积极的现实意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.5,所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.6。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为100-400μg/ml。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为200μg/ml。

5.根据权利要求1～4任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包含佐剂，所述佐剂包括油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述的佐剂包括水佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述的水佐剂为体积比10％的gel佐剂。

8.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法,其中，所述方法包括：

(1)分别克隆表达所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白；

(2)混合所述表达的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。

9.根据权利要求1～7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪巴氏杆菌相关疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述猪巴氏杆菌相关疾病为多种猪巴氏杆菌混合感染导致的。