CN104248754B - 猪链球菌疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及猪链球菌亚单位抗原，和编码其蛋白的氨基酸序列。本发明还涉及提供了一种猪链球菌疫苗组合物，该疫苗组合物用于预防和/或治疗猪链球菌相关疾病和由猪链球菌造成的感染的相关疾病。

Description

猪链球菌疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及猪链球菌(Streptococcussuis)的疫苗组合物及其制备方法，所述组合物包含两种猪链球菌免疫抗原。本发明还涉及将所述免疫抗原用于制备预防和/或治疗与猪链球菌相关的疾病和由猪链球菌导致的感染的组合物和方法中应用。

背景技术

猪链球菌是一种重要的猪病原体，可导致许多病理疾病诸如关节炎、心内膜炎、脑膜炎、肺炎和败血病。其还是对于接触污染的猪或它们的副产物的人的重要的动物传染病病原体，导致脑膜炎和心内膜炎。目前已知基于荚膜抗原的三十三种血清型(1-31型、33和1/2型)，但还不完全了解涉及猪链球菌的发病机理和致病力的机制，所以仍未有有效的疫苗来防控猪链球菌的感染。

现有的灭活全菌疫苗和活的无毒疫苗，因需要重复多次免疫并且不能抵御异型菌株的攻击，其保护功效是十分有限的。由于猪链球菌荚膜在致病力中具有重要作用，因此进行了基于荚膜物质开发疫苗的尝试，然而，这种疫苗因为荚膜多糖的免疫原性较差未取得令人满意的效果。有人尝试使用溶血素(suilysin)，或溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外蛋白质因子(EF)开发亚单位疫苗，然而，在一些地理区域中有显著数量的致病力强的菌株并不表达这些蛋白质，造成其免疫保护的局限性。本发明首次通过将38KDA蛋白与SaoA蛋白组合使用，针对不同血清型猪链球菌感染有着较好的保护作用，而且只需要免疫一次，避免多次重复免疫带来的应激反应。通过免疫效力比较试验，意外发现，两种蛋白组合使用，协同刺激机体免疫反应，有效降低了免疫剂量，大大降低免疫成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物，包含两种猪链球菌免疫保护性抗原和佐剂。

本发明提供的预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物包含的两种猪链球菌免疫抗原为38KDA蛋白和SaoA蛋白。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物包含的猪链球菌免疫抗原38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，本发明提供的治疗和/或预防猪链球菌感染的疫苗组合物包含的猪链球菌免疫抗原SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明提供的预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物包含的猪链球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。

本发明的另一个目的在于提供包含猪链球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗动物中猪链球菌相关疾病或感染的组合物和/或方法中的应用。

本发明可以应用的猪链球菌相关疾病的非穷举性列表包括，如关节炎、心内膜炎、脑膜炎、肺炎和败血症。

术语“动物”指对链球菌菌株如猪链球菌感染敏感的任何动物。具体地，这样的动物可以是，但不限于，小鼠、猪、山羊、马和人。更具体地，所述动物由猪组成。

术语“预防”指通过其与链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。

术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪链球菌菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。

术语“片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。

术语“保护性反应”意为在动物中预防猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。

本发明涉及的猪链球菌多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。

如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪链球菌菌株攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。

当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。

在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水乳状液(例如：完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)，水溶性佐剂，Quil A佐剂，氢氧化铝佐剂，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸钠。

本发明实施例中使用了水溶性佐剂中的一种gel佐剂，本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。

优选地，所述疫苗组合物中gel佐剂含量为10％～40％(V/V)。

在一个实施方式中，本发明提供一种治疗和/或预防猪链球菌感染的疫苗组合物，由猪链球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白和gel佐剂组成。

本发明的另一个目的是提供一种治疗和/或预防动物中猪链球菌相关疾病或感染的疫苗组合物的制备方法，包括：

(1)制备38KDA蛋白和SaoA蛋白抗原；

(2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化。

抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段，例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如“克隆载体”，其被设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸；“表达载体”，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列；或“病毒载体”，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或“穿梭载体”，其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明猪链球菌抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪链球菌抗原的制备还包括通过人工合成的方式来实现。

本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备治疗和/或预防动物中猪链球菌相关疾病或感染的药物的应用。

本发明疫苗组合物可以进一步包含猪链球菌全菌抗原。

优选地，所述的猪链球菌全菌抗原为猪链球菌2型全菌抗原。

更优选地，所述的猪链球菌2型全菌抗原为猪链球菌2型SC株全菌抗原。

还可以将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))，抗氧化剂，表面活性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

优选地，对于动物猪而言，本发明疫苗组合物38KDA蛋白抗原含量为10-100μg/ml；SaoA蛋白抗原有效量为50-300μg/ml。

更优选地，所述疫苗组合物38KDA蛋白抗原含量为50μg/ml；SaoA蛋白抗原有效量为150μg/ml。

本发明具有以下突出的优点：

(1)本发明疫苗组合物可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分进行大量合成表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；

(2)本发明猪链球菌疫苗组合物中多免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫效果；

(3)本发明疫苗组合物可有效保护猪只抵抗不同血清型猪链球菌的感染，提供了一种完善预防和/或治疗猪链球菌感染的途径，对于净化猪链球菌有着积极的现实意义。

附图说明

图1：本发明疫苗组合物免疫小鼠后的抗体水平。

图2：本发明疫苗组合物同单一组分抗原免疫仔猪后抗体水平比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7.4的PBS，配制方法：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

实施例1

猪链球菌免疫原性抗原的制备

猪链球菌免疫原性抗原可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行制备，例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。。适合制备本发明猪链球菌多肽抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪链球菌多肽抗原的制备还包括人工合成的多肽抗原。本发明实施例采用大肠杆菌表达系统来制备38KDA蛋白和SaoA蛋白。

1.材料

本发明采用的pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)，大肠杆菌DH5α感受态购自宝生物工程(大连)有限公司。

本发明所用菌株为猪链球菌2型CVCC606菌株购自中国北京中国兽医药品监察所，属于一个商业菌株。

大肠杆菌培养基:LB液体培养液及固体培养基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，用10mol/LNaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用)。

引物设计与合成：

根据SEQ ID NO.1所示的38KDA基因序列，设计上游引引物CGGGATCCCGATGGATATTAGACAGGTTAGA与下游引物GCTGCAGCTTAGTTCTTAAAGCTATGA扩增38KDA基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

根据SEQ ID NO.2所示的SaoA基因序列，设计上游引物AAAGGATCCGCAACCTGATGGGGGAC与下游引物GGGCTGCAGTCATTACATTGCTTCCTTA扩增SaoA基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.抗原蛋白制备

将猪链球菌2型菌种CVCC606株(购自中国北京，中国兽医药品监察所)接种于含有10％灭活新生牛血清的TSA固体培养基(购自Sigma公司)上，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基(购自Sigma公司)中，置于摇床中(150r/min)，37℃震荡培养过夜。

遵照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒(购自武汉大风生物技术有限公司)说明书提供的操作方法提取基因组DNA。

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

基因组模板	3μl
		10XPCR Buffer(Mg2+plus)	5μl
上、下游引物(50pmol/μl)	2X0.5μl
		Taq酶	2μl
灭菌去离子水	35μl
		2.5mmol/L dNTP Mixture	4μl

反应程序为:94℃预变性5min；94℃1min；52℃、30sec,72℃、1min，30个循环；延伸72℃10min。

PCR产物回收:采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行。

抗原基因的TA克隆：分别将目的基因38KDA蛋白、SaoA蛋白的PCR回收产物和载体pMD18-T于16℃水浴过夜进行连接反应，转化DH5α感受态细胞，37℃在含有氨苄青霉素(AMP，50μg/mL)的LB固体培养基上培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入含有氨苄青霉素(AMP，50μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养12小时后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，将其分别命名为pMD-38KDA和pMD-SaoA。

重组质粒的双酶切鉴定:利用BamHI和PstI分别酶切pMD-38KDA和pMD-SaoA表达质粒，酶切后出现预期大小的目的片段和载体片断即为正确的重组质粒。

重组表达菌株的构建:分别回收上述步骤酶切产物38KDA和SaoA，并分别与pQE30(BamHI和PstI酶切线性化)于16℃水浴连接过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，于37℃在LB固体培养基上培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37℃培养12h后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，并分别命名为pQE30-38KDA和pQE30-SaoA。

目的基因的诱导表达:将含重组质粒pQE30-38KDA和pQE30-SaoA的表达菌株接种于含有25μg/ml Kna的3ml LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μl接种于10mL含有25μg/ml Kna的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD600达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.8mmol/l，继续培养3h后收集菌体。

将诱导后的重组大肠杆菌于8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mMTris-Cl(pH5.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度lmg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，I0000r/min，离心30min。收集蛋白。用Bradford蛋白测定法测量蛋白浓度，并分别将用PH为7.4的PBS溶液调整为1mg/ml。

实施例2

猪链球菌疫苗组合物的制备

取实施例1制备的38KDA和SaoA蛋白，缓缓加入到佐剂中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪链球菌的疫苗组合物。具体配比见表2。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的油佐剂，水乳状液(例如，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)，水溶性佐剂，Quil A佐剂，氢氧化铝佐剂，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸钠其中的一种或几种，在本实施例中，选用水溶性佐剂gel佐剂(法国赛比克公司)。

表2猪链球菌疫苗组合物成分配比

	疫苗1	疫苗2	疫苗3	疫苗4	疫苗5	疫苗6	疫苗7
								38KDA(μg/ml)	50	100	0	0	10	100	50
SaoA(μg/ml)	0	0	150	300	50	300	150
								gel佐剂(V/V％)	10	10	10	10	40	20	10

实施例3

猪链球菌疫苗组合物的免疫原性试验

1.免疫程序

使用5-7周龄的清洁级昆明系小鼠作免疫原性试验，根据试验要求分为8组，1-7组分别为本发明实施例2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7免疫组、第8组PBS对照组。免疫组免疫途径为背部皮下注射0.4ml，PBS对照组免疫等量的PBS，14天后加强免疫1次。分别于首免后14天和28天检测疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7及PBS对照组抗体水平。

2.抗体水平检测

各组小鼠在首免后14天及28天采血收集免疫血清，每组5只，用于ELISA检测。免疫血清的收集方法如下：小鼠断尾取血200μl，收集于1mL离心管中，37℃静置1h后，4℃过夜放置，3000r/min离心15min，收集上层血清，-20℃保存备用。分别使用纯化的38KDA、saoA抗原250ng/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。将分别收集的小鼠血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设空白对照。37℃反应30min。洗板3次后加入体积比1:5000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液(底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H2O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度。小鼠血清抗体ELISA检测结果见图1，表明1-7免疫组小鼠产生了较高水平的特异性抗体。

3.小鼠攻毒保护试验

将5-7周龄的清洁级昆明系小鼠90只，平均分为9组，即1-7组分别为本发明实施例1制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7免疫组、第8组和第9组免疫等量的PBS。首免后28天对第1-8组小鼠使用猪链球菌2型强毒株SC株(保藏编号为：CCTCCM2011351，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)，保藏日期为2011年10月12日。)进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为1×10⁸CFU。攻击后10天内每天固定时间观察临床状况。每天的临床评分为每只动物的姿势和运动性评分的总和，其基于神经、肌骨骼或呼吸系统疾病的指标如下：

姿势：

0＝正常的姿势和对刺激反应

1＝不活跃并且反应缓慢；眼鼻有分泌物

2＝仅对重复的刺激有反应，情感淡漠

3＝不活动，无反应，对环境没有意识

4＝死亡

运动性：

0＝正常步态和体位

1＝轻微神经症状，跛，和/或关节肿胀，但是没有辅助可以站立爬行

2＝明显神经症状转圈跑或跛，但是没有辅助可以站立爬行

3＝严重的跛，角弓反张，不能站立爬行

4＝死亡

结果在该攻毒剂量下第1-7免疫组10只小鼠获得不同程度的保护，出现短暂临床体征的在36h后逐渐恢复正常，最终存活；第8组在攻毒后12h开始出现临床体征(败血症)，发烧，对刺激反应缓慢，陆续出现中枢神经系统症状(脑膜炎)如转圈跑和角弓反张，5日内全部死亡；第9组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表3。

表3免疫小鼠攻毒保护结果

对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行得，临床评分结果见表4。临床评分通过对疾病指标的测定并结合死亡率和发病率，使用Mann-Whitney分析来比较疫苗对临床评分的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫效果差异不显著(P＞0.05)，疫苗5、疫苗6和疫苗7差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4同疫苗5、疫苗6、疫苗7之间差异极显著(P＜0.01)，而所有疫苗免疫组同攻毒对照组之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗5、疫苗6和疫苗7的免疫效果要显著高于疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4。证明了本发明包含两种抗原疫苗组合物免疫效果要优于单一抗原疫苗，而且还发现，本发明包含两种抗原疫苗组合物具有更低的抗原含量，却能达到更好的免疫效果，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明疫苗组合物临床疾病显著少于单一抗原疫苗。

表4免疫小鼠临床评分结果

组别	1天	2天	3天	4天	5天	6天	7天	8天	9天	10天
											1	1.2	3.2	4	4	3.4	3.2	3.2	2.8	2.6	2.6
2	1.4	3.2	3.8	4	3.4	3	3	2.6	2.4	2.2
											3	1.4	3.6	4.8	5	4.6	4	3.6	3.2	3	2.8
4	1.2	3.2	3.8	4.2	4	3.6	3.4	3	2.8	2.4
											5	1	2.2	2.4	1.6	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
6	1	2	2	1.2	0	0	0	0	0	0
											7	0.8	1.8	1.8	1.2	0	0	0	0	0	0
8	3.6	6.2	6.8	7.6	8	8	8	8	8	8

4.仔猪攻毒保护试验

将25-30日龄、猪链球菌抗原抗体阴性的仔猪90只，平均分为9组，即1-7组分别为本发明实施例1制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7免疫组、第8组和第9组免疫等量的PBS，单次免疫。免疫后21天，对第1-8组免疫猪群使用猪链球菌2型强毒株SC株腹腔注射攻毒，攻毒剂量为5×10⁸CFU。攻击后10天内每天固定时间观察临床状况。每天的临床评分为每只动物的姿势和运动性评分的总和，其基于神经、肌骨骼或呼吸系统疾病的指标如下：

姿势：

0＝正常的姿势和对刺激反应

1＝不活跃并且反应缓慢；眼鼻有分泌物

2＝仅对重复的刺激有反应，情感淡漠

3＝不活动，无反应，对环境没有意识

4＝死亡

运动性：

0＝正常步态和体位

1＝轻微失调，跛，和/或关节肿胀，但是没有辅助可以站起

2＝明显不协调或跛，但是没有辅助可以站起

3＝严重的跛、失调，不能保持站立

4＝死亡

结果在该攻毒剂量下第8组仔猪攻毒24小时后开始出现临床症状，表现为体温骤然持续升高，跛行、趴卧、发颤、不进食、四肢划水并于攻毒后5天内全部死亡。本发明的免疫组第1-7组10只仔猪获得不同程度的保护，出现短暂临床体征的在36小时后逐渐恢复正常，最终保持存活；第9组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表5。

表5免疫仔猪攻毒保护结果

对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行得，临床评分结果见表6。临床评分通过对疾病指标的测定并结合死亡率和发病率，使用Mann-Whitney分析来比较疫苗对临床评分的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫效果差异不显著(P＞0.05)，疫苗5、疫苗6和疫苗7差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4同疫苗5、疫苗6、疫苗7之间差异极显著(P＜0.01)，而所有疫苗免疫组同攻毒对照组之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗5、疫苗6和疫苗7的免疫效果要显著高于疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4。证明了本发明包含两种抗原疫苗组合物免疫效果要优于单一抗原疫苗，而且还发现，本发明包含两种抗原疫苗组合物具有更低的抗原含量，却能达到更好的免疫效果，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明疫苗组合物临床疾病显著少于单一抗原疫苗。

表6免疫仔猪临床评分结果

组别	1天	2天	3天	4天	5天	6天	7天	8天	9天	10天
											1	1.3	3.4	4.2	4	3.6	3.2	3.2	3.2	3.2	3.2
2	1.4	3.3	3.8	4.1	3.4	3	3	2.6	2.4	2.2
											3	1.6	3.8	5	5	4.5	4	3.6	3.2	3	2.7
4	1.2	3.2	3.6	4.3	4	3.5	3.4	3	2.8	2.5
											5	1	2	2.1	1.8	1.6	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
6	1.2	2	2.2	1.6	0	0	0	0	0	0
											7	1	2	1.8	1.4	0	0	0	0	0	0
8	4	6.4	6.8	7.4	8	8	8	8	8	8

实施例4

猪链球菌疫苗组合物的效力比较试验

1.仔猪的免疫程序

选择25-30日龄、猪链球菌阴性的仔猪70头，试验分7组，第1组为疫苗1免疫组，第2组为疫苗2免疫组，第3组为疫苗3免疫组，第4组为疫苗4免疫组，第5组为疫苗7免疫组，第6-7组为PBS对照组。PBS对照组每头猪注射1ml配比10％(V/V)gel佐剂的PBS，疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗1ml，单次免疫。

2.抗体水平检测

各组仔猪在免疫后21采血收集免疫血清，每组10只，用于ELISA检测。免疫血清的收集方法如下：仔猪颈静脉窦取血，收集于1ml离心管中，37℃静置1h后，4℃过夜放置，3000r/min离心15min，收集上层血清，-20℃保存备用。分别使用纯化的38KDA、SaoA抗原250ng/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。将分别收集的小鼠血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设空白对照。37℃反应30min。洗板3次后加入体积比1:5000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液(底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500ml配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度。仔猪血清抗体ELISA检测结果见图2，表明1-5免疫组小鼠产生了较高水平的特异性抗体。而且意外发现，本发明疫苗7相对于疫苗1和疫苗3在含量相同的条件下具有更高的抗体效价，甚至比疫苗2和疫苗4抗原含量大大提高后所引起的免疫反应抗体效价相当或更好。本发明疫苗7在刺激机体免疫时，两种抗原协同，意外的实现了以较低的抗原含量产生了较高的抗体效价。

3.免疫仔猪攻毒保护试验

免疫后21天，对5组免疫猪群及第6组PBS对照组进行腹腔注射攻毒，攻毒用猪链球菌菌液包含有33种血清型的猪链球菌，攻毒剂量为5×10⁸CFU。攻毒后观察10天，并按照实施例3中对攻毒仔猪的临床指标进行评分。结果如表7，第6组PBS对照组仔猪攻毒24小时后开始出现临床症状，表现为体温骤然持续升高，跛行、趴卧、发颤、不进食、四肢划水并于攻毒后5天内全部死亡。本发明的免疫组1死亡5头，5头保护，2头曾出现短暂临床体征的在36小时后逐渐恢复正常，最终保持健康；免疫组2死亡4头，6头保护并无明显临床症状，2头曾出现短暂临床体征的在36小时后逐渐恢复正常，最终保持存活；免疫组3死亡4头，6头保护并无明显临床症状，1头曾出现短暂临床体征的在36小时后逐渐恢复正常，最终保持健康；免疫组4死亡3头，7头保护并无明显临床症状；免疫组5死亡1头，9头保护并无明显临床症状。第7组PBS对照组存活，无异常现象发生。证明本发明疫苗组合物具有较好的保护效力。而且，意外发现，本发明疫苗7相对于疫苗1、疫苗2、疫苗3及疫苗4具有更好的免疫保护作用。疫苗7两种抗原在刺激机体免疫时，协同作用，出人意料的达到了较好的免疫保护效果。

表7免疫仔猪攻毒保护结果

组别	免疫方式	免疫类别	数量	攻毒剂量	死亡数	保护率(％)
							1	肌肉注射	疫苗1	10	5×108CFU	5	50
2	肌肉注射	疫苗2	10	5×108CFU	4	60
							3	肌肉注射	疫苗3	10	5×108CFU	4	60
4	肌肉注射	疫苗4	10	5×108CFU	3	70
							5	肌肉注射	疫苗7	10	5×108CFU	1	90
6	肌肉注射	佐剂PBS	10	5×108CFU	10	0
							7	肌肉注射	佐剂PBS	10	—	0	—

对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行得，临床评分结果见表8。临床评分通过对疾病指标的测定并结合死亡率和发病率，使用Mann-Whitney分析来比较疫苗对临床评分的作用。结果显示疫苗1和疫苗2、疫苗3免疫效果差异不显著(P＞0.05)，疫苗1同疫苗4差异显著(P＝0.044)；疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫效果差异不显著(P＞0.05)；疫苗7和疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4免疫效果差异极显著(P＜0.01)，而所有疫苗免疫组同攻毒对照组之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗7的免疫效果要显著高于疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4。证明了本发明包含两种抗原疫苗组合物在抵抗多种血清型猪链球菌感染的保护效果要优于单一抗原疫苗，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明疫苗组合物临床疾病也显著少于单一抗原疫苗。本发明疫苗组合物可有效抵抗不同血清型猪链球菌的感染，提供了一种完善预防和/或治疗猪链球菌感染的途径。

表8免疫仔猪临床评分结果

组别	1天	2天	3天	4天	5天	6天	7天	8天	9天	10天
											1	1.2	3.4	4	4.4	4.4	4	4	4	4	4
2	1.4	3.6	4	4.6	4	3.6	3.2	3.2	3.2	3.2
											3	1.6	3.8	5	5	4.5	4	3.2	3.2	3.2	3.2
4	1.2	3.2	3.8	4.4	4	3.5	3.2	2.8	2.4	2.4
											5	1	1.8	1.8	1.4	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

6

4.6

6.6

7

7.2

8

8

8

8

8

8

实施例5

猪链球菌疫苗组合物的应用

1.一级种子的繁殖

将SS2SC株(保藏编号为：CCTCCM2011351，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期为2011年10月12日。)冻干菌种用缓冲马丁肉汤稀释，分别划线接种于Clumbia羊血琼脂(法国梅里亚公司)，37℃培养24h，选择有明显溶血环、光滑、稍大的菌落接种于Clumbia羊血琼脂(法国梅里亚公司)斜面，37℃培养18～24h作为一级种子。

2.二级种子的繁殖

用少量缓冲马丁肉汤冲洗一级种子的血琼脂斜面培养物，接种于含1.5％(v/v)犊牛血清的缓冲马丁肉汤，同时加入0.2％葡萄糖(制成50％溶液灭菌后按比例加入)，37℃静置培养16～18h，经检验纯粹后即为二级种子。

缓冲马丁肉汤的配制：将蛋白胨20g，氯化钠2g加入1000ml牛肉汤中，加热至80～90℃，用氢氧化钠调整pH值为7.2，再缓缓加入磷酸氢二钠1g，碳酸氢钠2g，煮沸90分钟，静置2～8h，吸取上清液，116℃高压灭菌40分钟，灭菌后pH值为7.6～8.0。将葡萄糖配成50％溶液，116℃高压灭菌30分钟，在接种时加入。

3.制苗用菌液的制备

将缓冲马丁肉汤预热至37℃左右，按10～20％接种二级种子液，37℃静置培养16～18h，培养期间振摇2～3次，收获菌液做纯粹检验后，置2～8℃保存备用。

4.抗原制备

将培养液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为1000Kda道尔顿)进行浓缩，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录方法进行活菌计数，并灭活。制备的猪链球菌2型SC株抗原含量为灭活前10¹¹CFU/ml。

5.疫苗组合物制备

取实施例1制备的38KDA蛋白及SaoA蛋白抗原同猪链球菌2型SC株抗原按比例混合，缓缓加入到佐剂中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪链球菌的疫苗组合物。具体配比见表9。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的油佐剂，水乳状液(例如，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)，水溶性佐剂，Quil A佐剂，氢氧化铝佐剂，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸钠其中的一种或几种，在本实施例中，选用水溶性佐剂gel佐剂(法国赛比克公司)。

表9猪链球菌疫苗组合物成分配比

7.疫苗组合物的效力试验

选择25-30日龄、猪链球菌阴性的仔猪100头，试验分10组，第1-3组为疫苗8免疫组，第4-6组为疫苗9免疫组，第7-10组为PBS对照组。PBS对照组每头猪注射1ml配比10％(V/V)gel佐剂的PBS，疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗1ml，单次免疫。

免疫后21天，对6组免疫猪群及第7-9组PBS对照组进行腹腔注射攻毒，其中第1组、第4组和第7组攻毒用猪链球菌菌液包含有33种血清型的猪链球菌，第2组、第5组和第8组攻毒用猪链球菌SC株，第3组、第6组和第9组攻毒用猪链球菌CVCC606株(购自中国北京，中国兽医药品监察所)，攻毒剂量皆为5×10⁸CFU。攻毒后观察10天。结果如表10。

本发明的第1、2和3全部保护并无明显临床症状；第5组和第6组保护率达到80％以上，第4组保护率仅仅为50％；第7、8和9组仔猪攻毒24小时后开始出现临床症状，表现为体温骤然持续升高，跛行、趴卧、发颤、不进食、四肢划水并于攻毒后5天内全部死亡；通过检测仔猪攻毒前及攻毒后血液，第1、2和3组没有检测到细菌，攻毒前后没有区别；第10组PBS对照组存活，无异常现象发生。证明本发明疫苗组合物作为疫苗添加物具有较好的保护效力，可有效抵抗猪链球菌感染。同时，仔猪针对同血清型菌攻毒保护达到80％以上时，添加本发明38KDA蛋白和SaoA蛋白的疫苗组合物所需的全菌抗原含量更低，而且对于不同血清型菌株的攻击具有良好的免疫保护效果。

表10免疫仔猪攻毒保护结果

组别	免疫方式	免疫类别	数量	攻毒剂量	死亡数	保护率(％)
							1	肌肉注射	疫苗8	10	5×108CFU	0	100
2	肌肉注射	疫苗8	10	5×108CFU	0	100
							3	肌肉注射	疫苗8	10	5×108CFU	0	100
4	肌肉注射	疫苗9	10	5×108CFU	5	50
							5	肌肉注射	疫苗9	10	5×108CFU	1	90
6	肌肉注射	疫苗9	10	5×108CFU	2	80
							7	肌肉注射	佐剂PBS	10	5×108CFU	10	0
8	肌肉注射	佐剂PBS	10	5×108CFU	10	0
							9	肌肉注射	佐剂PBS	10	5×108CFU	10	0
10	肌肉注射	佐剂PBS	10	—	0	—

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种猪链球菌疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物由38KDA蛋白、SaoA蛋白和佐剂组成；其中，所述的38KDA蛋白是由SEQ ID NO.3编码的蛋白；所述的SaoA蛋白是由SEQ IDNO.4编码的蛋白；所述的38KDA蛋白含量为10-100μg/ml；SaoA蛋白含量为50-300μg/ml。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的佐剂包括油佐剂，水乳状液，水溶性佐剂。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的佐剂包括Quil A佐剂，氢氧化铝佐剂，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸钠。

4.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，其中，所述的制备方法包括：

1)制备38KDA蛋白和SaoA蛋白抗原的步骤；

2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化的步骤。

5.一种猪链球菌疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物由38KDA蛋白、SaoA蛋白、灭活的猪链球菌2型SC株全菌抗原和佐剂组成；其中，所述的38KDA蛋白是由SEQ ID NO.3编码的蛋白；所述的SaoA蛋白是由SEQ ID NO.4编码的蛋白；所述的38KDA蛋白含量为10-100μg/ml；SaoA蛋白含量为50-300μg/ml。

6.根据权利要求1所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染的药物中的应用。